孫曉菲， 楊皓然， 柳彎， 解宇環(huán)

(云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明650500)

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性別對皮膚屏障障礙模型小鼠表皮厚度及絲聚合蛋白表達(dá)的影響

孫曉菲， 楊皓然， 柳彎， 解宇環(huán)*

(云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明650500)

目的 探索性別對小鼠皮膚屏障功能的影響。方法 用丙酮-乙醚法和膠帶粘貼法復(fù)制皮膚屏障功能障礙模型、觀察性別對皮膚屏障障礙模型小鼠的表皮厚度和絲聚合蛋白(FLG)表達(dá)的影響。結(jié)果 與正常對照組相比，丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組小鼠表皮厚度增寬(P<0.05)；正常對照組雄鼠與雌鼠相比，表皮厚度無差異；而丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組雌鼠表皮厚度均較同組雄鼠增加(P<0.05)。丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組與正常對照組相比，F(xiàn)LG蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，同組雄鼠表達(dá)水平均低于雌鼠(P<0.05)。結(jié)論 皮膚機(jī)械屏障功能被破壞后，小鼠的表皮厚度變化存在性別差異，而FLG蛋白表達(dá)在正?；蚴瞧つw屏障障礙小鼠中的性別差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在研究小鼠皮膚屏障障礙相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療措施時應(yīng)重視性別差異。

性別；皮膚屏障障礙模型；表皮厚度；絲聚合蛋白

皮膚是機(jī)體與外部環(huán)境間的重要屏障。廣義的皮膚屏障功能指皮膚的物理性屏障作用，以及色素屏障作用、神經(jīng)屏障作用、免疫屏障作用以及其他與皮膚功能相關(guān)的諸多方面；狹義的皮膚屏障通常指表皮的機(jī)械性屏障結(jié)構(gòu)(劉瑋，2008)。皮膚結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定對保護(hù)機(jī)體內(nèi)臟器官和組織免受外界有害因素?fù)p傷，防止體內(nèi)水分電解質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)的丟失具有重要意義。皮膚屏障功能可受諸多因素影響，如性別、年齡、基因遺傳等。近年來人們逐漸重視性別與皮膚疾病的關(guān)系，一些常見的皮膚疾病如濕疹、脫毛、皮膚癌等在組織學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)等方面均表現(xiàn)出性別差異(Daoetal.，2007)。以往研究多集中于性別對健康機(jī)體皮膚屏障的影響，而本研究將采用化學(xué)試劑(丙酮-乙醚)法(李欽等，2008)和膠帶粘貼法(Mona等，2008)復(fù)制小鼠皮膚屏障障礙模型，并觀察性別對模型小鼠表皮厚度和絲聚合蛋白(Filaggrin，F(xiàn)LG)表達(dá)的影響，以進(jìn)一步揭示性別與皮膚屏障障礙相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級ICR小鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，使用許可證號：SCXK(滇)K2011-0011,生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要試劑

兔抗FLG antibody購自Santa Cruz公司；山羊抗兔GAPDH antibody購自博奧森生物科技有限公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 主要方法

1.3.1 皮膚屏障障礙模型的復(fù)制 將健康ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別是正常對照組(♂)、正常對照組(♀)、丙酮-乙醚組(♂)、丙酮-乙醚組(♀)、膠帶粘貼組(♂)、膠帶粘貼組(♀)，每組10只。正常對照組不予模型干預(yù)。于造模前1 d將各組小鼠用剃刀剃掉頸背部毛。造模當(dāng)天丙酮-乙醚組小鼠用2 cm×2 cm脫脂棉蘸取丙酮∶乙醚=1∶1混合液覆蓋于剪毛處15 s，然后取另一2 cm×2 cm脫脂棉蘸取蒸餾水覆蓋于剪毛處30 s，每天2次；膠帶粘貼組小鼠用強(qiáng)力膠帶反復(fù)粘貼剃毛處皮膚，每天2次，每次4～5下。連續(xù)造模6 d后將小鼠處死，取下造模處皮膚，用打孔器將剪下的皮膚打成皮膚圓片。

1.3.2 小鼠表皮厚度測量 取各組小鼠皮片1片置于10%中性甲醛溶液中，經(jīng)石蠟包埋作組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察各組小鼠皮膚整體形態(tài)。每張皮膚共拍5張圖，拍完后用Image-Pro Plus 6.0軟件在每一張圖片上選5個點(diǎn)，一張皮膚共選25個點(diǎn)測量小鼠表皮厚度，所得值的平均值即為小鼠表皮厚度值。

1.3.3 Western-blot法檢測FLG表達(dá)水平 皮膚樣品以20 mg加100～200 μL組織裂解液[含苯甲基磺酰氟(PMSF)]提取蛋白并定量。10%SDS-PAGE 分離蛋白，以每平方厘米凝膠面積1.5 mA轉(zhuǎn)1～2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。1%牛血清白蛋白封閉1 h。滴加一抗(anti-Filaggrin)后，4 ℃過夜。將膜放入密封袋中加二抗，室溫?fù)u床上輕搖1 h，化學(xué)發(fā)光試劑自顯影。凝膠成像分析系統(tǒng)掃描顯色帶，定量分析軟件Quantity One分析其灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)。

2 結(jié)果

2.1 性別對皮膚屏障障礙模型小鼠表皮厚度的影響

與正常對照組相比，丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組小鼠的表皮厚度增寬(P<0.05)；正常對照組雄鼠與雌鼠相比，表皮厚度無差異；而丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組雌鼠表皮厚度均較同組雄鼠增加(P<0.05)(圖1)。

2.2 性別對皮膚屏障障礙模型小鼠FLG蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組相比，膠帶粘貼組與丙酮-乙醚組小鼠FLG蛋白表達(dá)降低，而雌鼠FLG蛋白表達(dá)均高于同組雄鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

3 討論

有研究表明，皮膚是雌激素重要的靶器官(Brincatetal.，2005)，雌激素可通過調(diào)節(jié)其受體α(ERα)增加角質(zhì)層的厚度，促使角質(zhì)層中脂類的沉積及角質(zhì)層復(fù)層板層膜的形成(Azzietal.，2005)。相反，給孕鼠注射睪丸激素會延緩小鼠皮膚屏障功能的形成。這一結(jié)果在離體皮膚培養(yǎng)中得到進(jìn)一步證實(shí)。據(jù)此可知，性激素可直接作用于皮膚而影響皮膚屏障功能。本研究發(fā)現(xiàn)正常ICR雌性小鼠的表皮較雄性小鼠稍厚，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而有機(jī)試劑和物理剝脫刺激所造成的小鼠皮膚屏障障礙模型卻觀察到雌鼠的表皮較雄鼠厚，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明雌激素可能參與了動物表皮損傷后的異常增生。

圖1 性別對小鼠皮膚屏障障礙模型表皮厚度的影響

A為經(jīng)HE染色的小鼠表皮石蠟切片(×20): a. 正常對照組(♀), b. 正常對照組(♂), c. 丙酮-乙醚組(♀), d. 丙酮-乙醚組(♂), e. 膠帶粘貼組(♀), f. 膠帶粘貼組(♂); B為正常對照組、丙酮-乙醚組和膠帶粘貼組雌雄小鼠表皮厚度的比較: 數(shù)值以Mean±SD表示,n=10; 與正常對照組相比,*P<0.05。

A. Paraffin sections of mouse epidermis stained with hematoxylin and eosin (×20): a. normal control group (♀), b. normal control group (♂), c. acetone-ether group (♀), d. acetone-ether group (♂), e. tape stripping group (♀), f. tape stripping group (♂); B. Comparison between male and female epidermis thickness in normal control group, acetone-ether group and tape stripping group: values are presented as Mean±SD,n=10; compared with the normal control group,*P<0.05.

圖2 Western-blot法檢測小鼠表皮絲聚合蛋白表達(dá)水平

Fig.2 Western-blot detection for filaggrin expression in mice epidermis 數(shù)值以Mean±SD表示,n=10; 與正常對照組相比,*P<0.05; 與同一模型組的雌鼠相比, △P<0.05。

Values are presented as Mean±SD,n=10; compared with normal control group,*P<0.05; compared with normal the female individuals in the same model group, △P<0.05.

角質(zhì)層中角質(zhì)細(xì)胞是移行至角質(zhì)層并呈終末分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，它們被角蛋白絲固定并由交聯(lián)蛋白組成的細(xì)胞膜和共軛脂質(zhì)膜包圍，是角質(zhì)層最重要的保護(hù)性結(jié)構(gòu)組分之一，構(gòu)成了“磚-墻”結(jié)構(gòu)體系中的“磚”。在角質(zhì)形成細(xì)胞正常分化的最后階段，排列有序的角蛋白通過與中間絲相關(guān)蛋白相互作用構(gòu)成了一種濃縮陣列。其中，中間絲相關(guān)蛋白聚合成束狀角蛋白細(xì)絲，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞死亡后扁平形態(tài)的形成(Dangetal.，2005)，這對維持皮膚屏障的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。在哺乳動物表皮中，角蛋白和中間絲相關(guān)蛋白占蛋白含量的80%～90%，若兩者基因突變將直接影響角質(zhì)層屏障組織結(jié)構(gòu)的完整性，繼而出現(xiàn)一系列以角質(zhì)層屏障受損相關(guān)為主要表現(xiàn)的皮膚疾病(田燕，劉瑋，2013)；Presland等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，若正常的中間絲相關(guān)蛋白及絲聚合蛋白原缺失，小鼠在出生時可表現(xiàn)出皮膚干燥、脫屑等。有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以調(diào)節(jié)胎鼠表皮的分化和FLG的表達(dá)(K?müvesetal.，1998)。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚屏障障礙模型小鼠的FLG蛋白表達(dá)明顯低于正常對照組，而雌鼠的FLG蛋白表達(dá)均高于同組雄鼠，說明性別可能會影響皮膚屏障障礙小鼠角質(zhì)層的完整性。本研究進(jìn)一步揭示了性別對小鼠皮膚屏障的影響，并為皮膚疾病小鼠模型的性別選擇提供了參考。

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Gender Differences in Epidermis Thickness and Filaggrin Expression of Mice Skin Barrier Dysfunction Models

SUN Xiaofei, YANG Haoran, LIU Wan, XIE Yuhuan*

(Basic Medicine School, Yunnan University of TCM, Kunming 650500, China)

Objective To investigate whether genders would affect mice skin barrier dysfunction models. Methods The mice skin barrier dysfunction models were constructed by the acetone-ether method and repeated tape stripping. The epidermis thickness and Filaggrin (FLG) expression of mice skin were measured by hematoxylin and eosin staining and western-blot. Results The result of morphological analysis showed that the epidermis thickness of model mice were thicker than normal control group (P<0.05). There was no significant difference between the males and females in normal group, whereas the epidermis were thicker in the females of both model groups than the males in the same group (P<0.05). Epidermal FLG expression was decreased in both model groups (P<0.05), additionally, the expression levels of model mice FLG were higher in the female in all groups (P<0.05). Conclusion There were gender differences of skin thickness in skin barrier dysfunction models. In both normal and barrier dysfunction model groups, the FLG expression showed a gender bias, and this suggested that we should pay more attention on the gender differences on the study of pathogenesis and treatment of disease with skin barrier dysfunction.

gender; skin barrier dysfunction model; epidermis thickness; filaggrin

10.11984/j.issn.1000-7083.20150207

2015-06-10 接受日期：2015-09-14 基金項(xiàng)目:云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目(No.2011FZ15,2013FB056); 云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2013Z004); 國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科“中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)”

孫曉菲(1979—), 女, 講師, 研究方向?yàn)樗幚韺W(xué), E-mail:xiaofeisun@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:kmkamma@163.com

Q95-33

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1000-7083(2016)01-0105-04