周冉， 齊磊， 王文霞， 胡德夫， 隋金玲

(北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083)

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抗生素保存褐馬雞糞便分泌型免疫球蛋白A的時(shí)效性研究

周冉， 齊磊， 王文霞， 胡德夫， 隋金玲*

(北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083)

糞便免疫球蛋白是衡量野生動(dòng)物健康狀況及生存狀態(tài)的有效手段之一，其中糞便的保存問(wèn)題是關(guān)鍵。為探索抗生素對(duì)糞便分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的保存時(shí)效性，采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)4種常用抗生素(利福平、四環(huán)素、卡那霉素和慶大霉素)的3種不同濃度(1 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1)保存的褐馬雞Crossoptilonmantchuricum糞便SIgA的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，25 μg·mL-1的利福平保存的褐馬雞糞便SIgA效果最佳，其次是50 μg·mL-1的四環(huán)素和50 μg·mL-1的卡那霉素，慶大霉素保存效果最差。

褐馬雞；抗生素；糞便分泌型免疫球蛋白A；保存時(shí)效

褐馬雞Crossoptilonmantchuricum是中國(guó)特有珍稀鳥(niǎo)類，國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，世界易危鳥(niǎo)類之一。目前，褐馬雞野生種群主要分布在山西呂梁山、河北小五臺(tái)山和北京東靈山、陜西黃龍山等地的局部地區(qū)(鄭光美，王歧山，1998；雷忻，廉振民，2008)。迄今為止，該物種的生態(tài)習(xí)性、種群生態(tài)、繁殖生物學(xué)習(xí)性及保護(hù)生物學(xué)等方面研究取得了一些成果(柳明來(lái)，黨太合，1999；鄭建旭等，2000；張國(guó)剛等，2005；武玉珍，馮睿芝，2013)，但該物種免疫生理學(xué)的報(bào)道甚少。究其原因，該瀕危動(dòng)物種群數(shù)量少、應(yīng)激生理反應(yīng)較高、捕捉難度大，導(dǎo)致采集血液及組織等樣本十分困難，這嚴(yán)重阻礙了該領(lǐng)域的研究。近年來(lái)，通過(guò)收集野生動(dòng)物的糞便、尿液、毛發(fā)、唾液等遺留物，即非損傷的取樣方法，拓展了野生動(dòng)物免疫生理學(xué)的研究途徑(Terioetal.，2002)。分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是外分泌液中存在的一種主要抗體，是粘膜免疫系統(tǒng)主要的免疫防線(Ushidaetal.，2008)。其中，糞便SIgA是監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物健康狀況及生存狀態(tài)有效而直觀的生理指標(biāo)之一(Paramastrietal.，2007；Yuetal.，2011；Curryaetal.，2012)，其含量的測(cè)定有助于及時(shí)預(yù)防野生動(dòng)物種群的疾病，為自然保護(hù)區(qū)管理人員對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行補(bǔ)飼和有效管護(hù)提供依據(jù)。因此，糞便SIgA成為研究野生動(dòng)物機(jī)體所處狀態(tài)的一種有效手段。

野外或圈養(yǎng)條件下采集的新鮮糞便均需要保存并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)一步測(cè)定。動(dòng)物的排泄物中含有大量的胃腸細(xì)菌，新鮮糞便若沒(méi)有及時(shí)提取或低溫保存處理，則糞便中的待測(cè)物質(zhì)很容易被微生物分解，造成測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確或無(wú)法檢測(cè)出目標(biāo)物質(zhì)。目前比較常用的保存方法是冷凍保存法、有機(jī)溶劑保存法和干燥保存法。但野外采集的糞便很難進(jìn)行及時(shí)冷凍，且冷凍保存也不利于遠(yuǎn)距離采樣操作。糞便類固醇激素的保存時(shí)效研究多采用甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑法(Khanetal.，2002；郎冬梅等，2011)，而甲醇或乙醇等有機(jī)溶劑易使蛋白質(zhì)變性失活，無(wú)法應(yīng)用于糞便中免疫球蛋白的保存。因此，如何有效保存糞便內(nèi)免疫球蛋白，無(wú)疑成為開(kāi)展免疫生理研究工作必須解決的首要問(wèn)題。抗生素可抑制糞便中微生物的活性，增強(qiáng)免疫球蛋白的穩(wěn)定性。本文通過(guò)研究不同濃度的4種常用抗生素對(duì)褐馬雞糞便中SIgA的保存效果，探討了抗生素對(duì)糞便免疫球蛋白保存的可行性，以期為野外條件下野生動(dòng)物的免疫生理生態(tài)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及藥品

實(shí)驗(yàn)材料為山西龐泉溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)人工飼養(yǎng)的5只雌性健康成年褐馬雞的新鮮糞便，共75份。

抗生素包括利福平(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、四環(huán)素(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、卡那霉素(西南藥業(yè)股份有限公司)、慶大霉素(福建古田藥業(yè)有限公司)。

1.2 樣品處理

將所有糞便充分混勻，以消除個(gè)體和采樣時(shí)間的差異。將混合后的糞樣分成130份(13份/時(shí)間段×10時(shí)間段)，每份0.5 g。取其中10份樣品作為對(duì)照組(不加抗生素)，其余120份樣品作為抗生素組，分別用利福平、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素4種抗生素的3種濃度(1 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1)處理糞便(0.5 g糞便∶1 mL抗生素)，然后在恒溫箱(20 ℃±3 ℃)條件下保存。保存時(shí)間設(shè)定為0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d，共10個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段分別取出13份樣品(12個(gè)抗生素組和1個(gè)對(duì)照組)進(jìn)行SIgA的提取與測(cè)定。

1.3 糞便SIgA的提取與測(cè)定

參照Peters等(2004)和Ushida等(2008)提取糞便免疫球蛋白的方法，并略作改進(jìn)。具體步驟如下：將0.5 g濕糞和5 mL提取緩沖液(0.01 M PBS，0.05% Tween 20，pH=7.2)加入離心管中，渦旋儀器旋轉(zhuǎn)萃取5 min，2000 rmp/min常溫離心20 min。取上清液1 mL于2 mL離心管內(nèi)，再次10 000 rmp/min低溫(4 ℃)冷凍離心20 min。最后，取上清液于1.5 mL離心管內(nèi)進(jìn)行分裝，填寫(xiě)標(biāo)號(hào)，并置于-20 ℃冰箱中冷凍待測(cè)。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定糞便SIgA含量，酶聯(lián)免疫診斷試劑盒為上海越研生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，Sigmaplot 12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖，SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和多重比較，顯著水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照組糞便SIgA含量的測(cè)定

不同保存時(shí)間下對(duì)照組糞便SIgA含量如圖1所示，可見(jiàn)未進(jìn)行保存處理的糞便SIgA含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)下降迅速。2 d時(shí)SIgA含量降至0 d時(shí)的72.71%；4 d時(shí)SIgA含量降至0 d時(shí)的40.9%，8 d時(shí)降至0，即對(duì)照組糞便SIgA含量在8 d時(shí)被完全降解。

圖1 對(duì)照組糞便SIgA含量隨時(shí)間變化圖

2.2 抗生素組糞便SIgA含量的測(cè)定

2.2.1 利福平保存糞便SIgA含量的測(cè)定 不同濃度利福平保存的糞便SIgA含量隨時(shí)間變化如圖2。3種濃度的利福平保存下的糞便SIgA含量在16 d內(nèi)呈緩慢下降趨勢(shì)，16 d后SIgA含量迅速降低，18 d時(shí)降至0，且明顯比對(duì)照組下降緩慢。25 μg·mL-1利福平保存糞便效果較對(duì)照組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他濃度較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，16 d時(shí)，1 μg·mL-1利福平保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的63.00%；25 μg·mL-1利福平保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的66.03%，下降趨勢(shì)較平緩；50 μg·mL-1利福平保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的42.69%，相對(duì)于其他濃度呈較快的下降趨勢(shì)。

圖2 不同抗生素保存下糞便SIgA含量的變化圖

Fig. 2 The change of fecal SIgA content in the groups treated by different antibiotics

2.2.2 四環(huán)素保存糞便SIgA含量的測(cè)定 不同濃度四環(huán)素保存的糞便SIgA含量隨時(shí)間變化如圖2。3種濃度的四環(huán)素保存下的糞便SIgA含量在16 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，16 d后SIgA含量迅速降低，至18 d時(shí)降為0，且比對(duì)照組下降緩慢，50 μg·mL-1較對(duì)照組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他2個(gè)濃度較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，16 d時(shí)，1 μg·mL-1四環(huán)素保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的60.66%；25 μg·mL-1保存糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的63.23%；50 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的68.12%，相對(duì)于其他2個(gè)濃度呈緩慢下降趨勢(shì)。

2.2.3 卡那霉素保存糞便SIgA含量的測(cè)定 不同濃度卡那霉素保存的糞便SIgA含量隨時(shí)間變化如圖2。3種濃度的卡那霉素保存的糞便SIgA含量在16 d內(nèi)均有下降趨勢(shì)、波動(dòng)幅度較大，1 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量分別在14 d、14 d、16 d后迅速降低，至18 d時(shí)降為0，且比對(duì)照組下降緩慢，但較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，14 d時(shí)，1 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的56.63%；25 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的48.73%。16 d時(shí)，1 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的17.71%；25 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的13.08%；50 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的65.86%。

2.2.4 慶大霉素保存糞便SIgA含量的測(cè)定 不同濃度慶大霉素保存的糞便SIgA含量隨時(shí)間變化如圖2。3種濃度的慶大霉素保存的糞便SIgA含量在10 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，1 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量分別在6 d、10 d、10 d后迅速降低，分別至10 d、12 d、12 d時(shí)降為0。SIgA含量下降比對(duì)照組略微緩慢，但較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，6 d時(shí)，1 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的49.44%。10 d時(shí)，25 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的36.59%；50 μg·mL-1保存的糞便SIgA含量降至0 d時(shí)的50.95%。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，利福平對(duì)糞便SIgA保存有效，其中25 μg·mL-1利福平效果最好，但保存時(shí)間最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)16 d。四環(huán)素對(duì)糞便SIgA保存亦有效，其中50 μg·mL-1四環(huán)素效果最好，但保存時(shí)間最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)16 d?？敲顾貙?duì)糞便SIgA保存一般，其中50 μg·mL-1卡那霉素的效果更好。慶大霉素對(duì)糞便SIgA的保存效果最差。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，25 μg·mL-1利福平保存效果與50 μg·mL-1四環(huán)素、50 μg·mL-1卡那霉素保存效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在16 d時(shí)，25 μg·mL-1利福平、50 μg·mL-1四環(huán)素、50 μg·mL-1卡那霉素保存的糞便SIgA含量分別降至0 d時(shí)的66.03%、68.12%、65.86%，且25 μg·mL-1利福平下降趨勢(shì)較50 μg·mL-1四環(huán)素、50 μg·mL-1卡那霉素平緩，波動(dòng)幅度較小，50 μg·mL-1四環(huán)素下降趨勢(shì)較50 μg·mL-1卡那霉素平緩。本研究分析指出，25 μg·mL-1利福平保存褐馬雞糞便SIgA效果最佳，其次為50 μg·mL-1四環(huán)素和50 μg·mL-1卡那霉素，慶大霉素保存效果最差。

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌劑，對(duì)多種病原微生物均有抗菌活性，通過(guò)抑制依賴DNA的RNA聚合酶，使聚合酶失去活性，從而影響細(xì)菌的RNA合成，起到抑菌和殺菌作用。四環(huán)素為廣譜抑菌劑，通過(guò)干擾氨酰-tRNA與核糖體的結(jié)合而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成；卡那霉素和慶大霉素為氨基糖苷類抗生素，通過(guò)與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物(如tRNA、mRNA)相互作用，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。結(jié)果證實(shí)利福霉素、四環(huán)素廣譜抗菌劑對(duì)褐馬雞糞便SIgA的保存效果較卡那霉素和慶大霉素等氨基糖苷類抗生素效果好。但研究中利福平、四環(huán)素、卡那霉素和慶大霉素保存的糞便SIgA在18 d后的含量迅速降至0，這可能是由于抗生素失效，導(dǎo)致微生物滋生，SIgA被完全降解。

糞便類固醇保存時(shí)效研究指出，微生物分解代謝類固醇激素可能影響免疫測(cè)定時(shí)待測(cè)激素與抗體之間的親和率或引起免疫測(cè)定時(shí)的交叉反應(yīng)，造成激素測(cè)定值的明顯改變(Wasser，1988；Yamauchi，1999)。在抗生素保存糞便SIgA的過(guò)程中，SIgA含量出現(xiàn)不同程度的增加情況。推測(cè)出現(xiàn)這種情況可能的原因是：(1)糞便及外界環(huán)境中存在大量細(xì)菌，其分泌的IgA蛋白酶不僅識(shí)別出現(xiàn)IgA鉸鏈區(qū)序列，而且也識(shí)別連接IgA蛋白酶區(qū)和beta區(qū)的可變區(qū)。各種細(xì)菌產(chǎn)生的IgA蛋白酶對(duì)IgA的切除位點(diǎn)不同，且分泌型IgA抗原結(jié)合價(jià)為4，可能是由于IgA蛋白酶裂解，使不同的抗原結(jié)合部位暴露出來(lái)，檢測(cè)時(shí)與多余的抗體結(jié)合，導(dǎo)致糞便IgA含量升高。(2)IgA的糖基化異常也會(huì)影響到它對(duì)IgA蛋白酶的敏感性，因此在IgA腎病中，IgA糖基化的異常可能是導(dǎo)致IgA升高的原因之一(李青等，2010)。

本研究初次探討抗生素對(duì)褐馬雞糞便SIgA的保存時(shí)效性，發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)褐馬雞糞便SIgA有一定的保存效果，但抗生素的種類和濃度對(duì)糞便SIgA保存效果有極大的影響，因此在野外研究中采用適當(dāng)?shù)目股睾秃线m的濃度處理樣品，將有利于開(kāi)展對(duì)野生褐馬雞健康狀況的評(píng)價(jià)。而關(guān)于不同抗生素保存褐馬雞糞便SIgA的機(jī)制，以及抗生素對(duì)其他鳥(niǎo)類糞便SIgA保存的有效性，仍需做進(jìn)一步探討。

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Effects of Antibiotics on the Storage of Fecal Secretory Immunoglobulin A of Brown-eared Pheasant

ZHOU Ran, QI Lei, WANG Wenxia, HU Defu, SUI Jinling*

(School of Nature Conservation, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

Evaluation of fecal immunoglobulin level is an effective means of monitoring health and survival situation in wildlife, and this method requires the storage of feces in an appropriate way. In the present study, four antibiotics including rifampicin, tetracycline, kanamycin and gentamicin were used to investigate the efficiency for preservation of fecal secretory immunoglobulin A (SIgA) of brown-eared pheasant (Crossoptilonmantchuricum) at three different concentrations (1 μg·mL-1, 25 μg·mL-1, 50 μg·mL-1). The content of SIgA was measured by enzyme linked immunosorbent assay. The results showed that rifampicin at concentration of 25 μg·mL-1was optimal for SIgA preservation, followed by 50 μg·mL-1tetracycline and 50 μg·mL-1kanamycin, whereas the storage effect of gentamicin was the worst.

Crossoptilonmantchuricum; antibiotics; fecal secretory immunoglobulin A; storage time

10.11984/j.issn.1000-7083.20150190

2015-05-22 接受日期：2015-08-25 基金項(xiàng)目:全國(guó)第二次陸生野生動(dòng)物資源調(diào)查——北京市常規(guī)調(diào)查項(xiàng)目(YBZ2015-003)

周冉(1989—), 女, 碩士研究生, 研究方向?yàn)橐吧鷦?dòng)物保護(hù)與利用, E-mail:zhou_ran@126.com

*通信作者Corresponding author， 副教授, E-mail:jlsui@126.com

Q955

A

1000-7083(2016)01-0058-04