胡媛媛， 莫春橫， 王亞軍， 李娟

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

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家雞G蛋白偶聯(lián)受體78基因的克隆與組織表達(dá)圖譜分析

胡媛媛， 莫春橫， 王亞軍， 李娟*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是一大類(lèi)膜受體超家族，參與了機(jī)體幾乎所有的生理過(guò)程，是一類(lèi)重要信號(hào)分子受體。GPR78作為GPCR超家族的成員之一，屬于孤兒型受體。目前，在脊椎動(dòng)物中，針對(duì)該基因結(jié)構(gòu)與功能的研究極少。本研究以家雞為動(dòng)物模型，通過(guò)RT-PCR方法克隆了GPR78基因的編碼區(qū)序列，并探究了該基因在家雞各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：家雞GPR78基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1020 bp，含3個(gè)外顯子，可編碼1個(gè)長(zhǎng)為339個(gè)氨基酸的7次跨膜受體；該基因在家雞腦各功能區(qū)及垂體中高表達(dá)，而在其他外周組織中均不表達(dá)。本研究為后續(xù)探究GPR78基因在家雞中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

家雞；G蛋白偶聯(lián)受體；GPR78；克隆；組織表達(dá)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是一大類(lèi)膜受體的統(tǒng)稱(chēng)，是指和GTP結(jié)合蛋白偶聯(lián)，存在于細(xì)胞表面，由單條多肽鏈經(jīng)過(guò)7次跨膜而形成的受體(Marcheseetal.，1998；徐雪等，2014)，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用(Fredriksson & Schioth，2005)。目前在人類(lèi)基因組中，有超過(guò)2%的基因可用來(lái)編碼G蛋白偶聯(lián)受體(Marcheseetal.，1998)。GPCR是目前已知的細(xì)胞表面最大的受體超家族。根據(jù)其序列相似性以及與配基的結(jié)合情況，共分為5 個(gè)亞家族。它們分別是：A族——似視紫紅質(zhì)(rhodopsin-like)受體、B族——似胰泌素(secretin-like)受體、C族——親代謝性谷氨酸鹽和信息素(metabotropic glutamate/ pheromone)受體、D族——真菌信息素(fungal pheromone)受體和E族——cAMP受體(cAMP receptor)(Schertleretal.，1993；Ungeretal.，1997；Palczewskietal.，2000；Kobilka，2007；Kobilka & Deupi，2007)。這些GPCR受體的共同點(diǎn)是在其高級(jí)結(jié)構(gòu)中，均具有7個(gè)跨膜α螺旋、C末端、3個(gè)胞外環(huán)(ECL1～ECL3)以及3個(gè)胞內(nèi)環(huán)(ICL1～I(xiàn)CL3)。N末端在胞外，常被糖基化。C末端在胞內(nèi)，多表現(xiàn)為磷酸化。7個(gè)跨膜的α螺旋反復(fù)穿過(guò)細(xì)胞膜脂雙層。在受體肽鏈的C端和連接第5個(gè)和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上都有G蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

GPCR的7個(gè)跨膜疏水區(qū)有很高的保守性，而N端、C端和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)保守性相對(duì)較低。不同種類(lèi)的配體在GPCR上的結(jié)合位點(diǎn)也不相同。小分子配體主要結(jié)合在GPCR的7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)圍成的疏水區(qū)；肽段和GPCR受體蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域則位于N端結(jié)構(gòu)域和胞外的親水環(huán)(Rohrer & Kobilka，1998；Kobilka，2007)。GPCR能與細(xì)胞外的多種配體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路，從而調(diào)控多種生理反應(yīng)；GPCR信號(hào)通路是多種藥物的作用靶點(diǎn)(Tautermannetal.，2015)，尤其是許多癌癥與腫瘤的治療途徑(Xingetal.，2011)。目前，與GPCR結(jié)合的配體，包括核酸、生物胺、多肽、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等(Marcheseetal.，1998)。這些配體可以是糖類(lèi)、脂質(zhì)、多肽等小分子，也可以是蛋白質(zhì)大分子。一些特殊的GPCR也可被非化學(xué)性的刺激源激活，例如在感光細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)可以被光所激活。雖然不同類(lèi)型GPCR受體間的基因序列沒(méi)有高的同源性，但所有GPCR均具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(Brownetal.，2003)。

GPR78是GPCR受體超家族中的孤兒型受體。目前，對(duì)于GPR78的信號(hào)通路及其配體的研究幾屬空白(Leeetal.，2000，2001)。在哺乳動(dòng)物中，針對(duì)GPR78的結(jié)構(gòu)以及組織表達(dá)已做初步研究。據(jù)報(bào)道，人GPR78 cDNA全長(zhǎng)1092 bp，編碼具363個(gè)氨基酸的受體蛋白(Leeetal.，2000，2001；Underwoodetal.，2006；Jonesetal.，2007)。GPR78的mRNA主要在腦和垂體中表達(dá)。同時(shí)，亦有研究結(jié)果提示GPR78可能參與下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)、孕期調(diào)控(Hermanetal.，1996；Underwoodetal.，2006)、情感控制(Altamuraetal.，1999；Rybakowski & Twardowska，1999；Pariante & Miller，2001)、腦發(fā)育調(diào)節(jié)等(Jonesetal.，2007)。

鑒于GPR78基因在非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物中的研究尚屬空白，因此，本研究克隆了家雞GPR78基因的編碼序列，解析了該基因的結(jié)構(gòu)；同時(shí)，亦對(duì)GPR78基因在家雞各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 分別取8月齡性成熟的公雞/母雞的各組織放入液氮中速凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.1.2 試劑與耗材 高保真PCR擴(kuò)增所用的KOD-Fx DNA聚合酶、pTA2連接的10×A-attachment Mix購(gòu)自TOYOBO公司；引物合成由成都華大基因公司提供；各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Eazy-Taq DNA聚合酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)自TaKaRa公司；總RNA提取用TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；宿主菌EscherichacoliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；測(cè)序工作由北京華大六和股份有限公司完成；DNA純化膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工有限公司。

1.2 組織RNA提取

取家雞全腦、垂體、心臟、肝臟、精巢、脾臟、腎臟、肺、小腸、胰腺、卵巢和肌肉共12種組織，迅速放入液氮中速凍，并在液氮中充分研磨；將磨碎組織加入到TRIzol-reagent中混合均勻，然后用氯仿提取，4 ℃冷凍離心(10 000 r/min，15 min)，吸取上清液，再加入異丙醇，混勻后4 ℃冷凍離心(10 000 r/min，8 min)，棄上清；用70%乙醇漂洗沉淀2次，棄上清，最后用DEPC-H2O溶解RNA沉淀。

1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄

以家雞組織總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA第一條鏈合成。反轉(zhuǎn)錄總體積10 μL，RNA模板2 μg，Oligo-dT 1 μL(終濃度0.5 μg·μL-1)，加DEPC-H2O補(bǔ)足至5 μL，70 ℃加熱10 min，取出后冰浴2 min，然后加入5×第一條鏈合成緩沖液2 μL，dNTPs 0.5 μL(終濃度2 mM)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1)0.5 μL，放入PCR儀中42 ℃孵育1.5 h，70 ℃加熱10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用DEPC-H2O稀釋至40 μL作為cDNA模板使用。

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)預(yù)測(cè)的家雞GPR78基因序列和已知β-actin基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增cDNA序列或檢測(cè)其組織表達(dá)(表1)。

1.5 家雞GPR78基因cDNA的擴(kuò)增

以2 μL腦組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法參照本實(shí)驗(yàn)室已有體系(何夏萍等，2013；張彥等，2014)。PCR反應(yīng)體系為10 μL,其中：2×KOD緩沖液5 μL，DNA模板1 μL，dNTPs 2 μL(終濃度2 mM)，上下游引物(GPR78rU1/rL1)各0.1 μL(終濃度20 μM)，KOD-Fx聚合酶(1 U·μL-1)0.5 μL，DMSO 0.6 μL，用MilliQ-H2O補(bǔ)足10 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。取3 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果。

表1 引物序列

由于KOD-Fx聚合酶所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平末端，因此將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3’末端加A，然后與pTA2載體進(jìn)行4 ℃過(guò)夜連接。連接體系為5 μL：加A產(chǎn)物1.5 μL，pTA2載體0.5 μL，連接酶0.5 μL，10×連接緩沖液0.5 μL。按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再涂于含氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。分別進(jìn)行菌落PCR篩選、重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定。挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定(由北京華大生物科技發(fā)展有限公司完成)以確定每個(gè)基因的cDNA序列。

1.6 家雞GPR78基因的組織表達(dá)圖譜分析

采用GPR78基因的RT-PCR引物U1/L1來(lái)檢測(cè)GPR78基因在家雞12種組織中的特異性表達(dá)(表1)。PCR反應(yīng)總體系為10 μL：組織cDNA模板2 μL；10×Easy-Taq緩沖液1 μL；dNTPs 0.2 μL(終濃度2 mM)；上下游引物各0.1 μL(終濃度20 μM)；Easy-Taq聚合反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 33個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家雞GPR78基因cDNA的克隆與序列分析

以家雞腦組織cDNA為模板，采用引物(GPR78rU1+rL1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度大小約為1000 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期大小一致。

圖1 家雞GPR78基因PCR擴(kuò)增

1. DNA Marker, 2.GPR78的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. DNA Marker, 2. PCR amplification product of chickenGPR78.

通過(guò)克隆得到家雞GPR78基因的完整編碼序列。該序列長(zhǎng)1020 bp，含3個(gè)外顯子，可編碼339個(gè)氨基酸(圖2)；與其他GPCR一樣，家雞GPR78也含7次跨膜區(qū)(圖2)。胞外N端的氨基酸殘基數(shù)目少，且缺乏糖基化位點(diǎn)。通過(guò)與家雞基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GPR78位于家雞4號(hào)染色體上。此外，家雞GPR78與火雞(Accession No.：XM_010710491)、夜鷹(Accession No.：XM_010163602)和人(Accession No.：AY359107)的GPR78在氨基酸水平上分別享有99.41%，97.94%和51.79%的序列一致性(圖3)。此結(jié)果表明：GPR78在鳥(niǎo)類(lèi)中具有高保守性；而鳥(niǎo)類(lèi)與人GPR78的同源性則較低。

2.2 家雞GPR78基因的組織表達(dá)圖譜分析

采用RT-PCR方法初步檢測(cè)了GPR78基因在家雞組織中的表達(dá)情況：其在腦組織中的表達(dá)量最高，在垂體中也有表達(dá)，并且目的條帶的大小為459 bp，與預(yù)期的一致；而在其他外周組織中，均未檢測(cè)到PCR信號(hào)(圖4)。

此外，GPR78基因也在家雞腦各功能區(qū)域(包括大腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦)均有表達(dá)。其中，在大腦、中腦、后腦和下丘腦中，檢測(cè)到較強(qiáng)的PCR信號(hào)，暗示GPR78在這些區(qū)域具較高表達(dá)水平；而在小腦中，僅檢測(cè)到微弱的PCR信號(hào)，提示GPR78在小腦中的表達(dá)水平相對(duì)較低(圖4)。

3 討論

GPR78作為GPCR的成員之一，也屬7次跨膜受體。但目前對(duì)GPR78的配體、信號(hào)通路及功能報(bào)道極少(Leeetal.，2000，2001)。本研究成功從家雞中克隆了GPR78基因編碼區(qū)cDNA序列，它可編碼1個(gè)具有339個(gè)氨基酸殘基的7次跨膜受體。家雞GPR78分別與火雞、夜鷹和人的GPR78享有99.41%，97.94%和51.79%的同源性。此結(jié)果說(shuō)明GPR78在鳥(niǎo)類(lèi)中具高保守性。

圖2 家雞GPR78基因的核苷酸和氨基酸序列

Fig. 2 The nucleotide and amino acid sequence of chickenGPR78

方框?yàn)槭荏w7次跨膜區(qū)。

The putative 7 transmembrane domains were boxed.

圖3 家雞GPR78(cGPR78)與火雞(tGPR78)、夜鷹(nGPR78)、人(hGPR78)GPR78的氨基酸序列比對(duì)

圖4 RT-PCR檢測(cè)GPR78在家雞組織中的表達(dá)情況

Br. 大腦, Pi. 垂體, He. 心臟, Li. 肝臟, Sp. 脾臟, Lu. 肺, Ki. 腎, In. 小腸, Pa. 胰腺, Mu. 肌肉, Te. 精巢, Ov. 卵巢, Cb. 大腦, Mi.中腦, Ce. 小腦, Af. 后腦, Hy. 下丘腦; NC. 負(fù)對(duì)照; 括號(hào)內(nèi)數(shù)字示PCR循環(huán)數(shù)。

Br. brain, Pi. pituitary, He. heart, Li. liver, Sp. spleen, Lu. lung, Ki. kidney, In. small intestine, Pa. pancreas, Mu. muscle, Te. testis, Ov. ovary, Cb. cerebrum, Mi. midbrain, Ce. cerebellum, Af. afterbrain, Hy. hypothalamus; NC, negative control; number in bracket indicated the PCR cycle number.

最初，GPR78被鑒定出來(lái)是因?yàn)樗荊PR26的旁系同源物(Paralog)。GPR26受體在人和大鼠中都得到了初步解析(Leeetal.，2000，2001；Underwoodetal.，2006)。哺乳動(dòng)物GPR78與GPR26具有高達(dá)49%的序列一致性，且兩者在跨膜區(qū)(TM區(qū))的一致性甚至高達(dá)56%(Leeetal.，2000；Underwoodetal.，2006)；GPR78與GPR26具有相同的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，它們胞外N端氨基數(shù)目都很少且缺乏糖基化位點(diǎn)，在它們的第6和第7個(gè)跨膜區(qū)，也均具有精氨酸和賴(lài)氨酸殘基位點(diǎn)(Leeetal.，2000；Underwoodetal.，2006)。與哺乳動(dòng)物中類(lèi)似，家雞GPR78與GPR26也具有較高同源性和相似結(jié)構(gòu)特征(圖5)。此外，已有報(bào)道顯示GPR78與GPR26均能引起胞內(nèi)cAMP的上調(diào)(Leeetal.，2001；Jonesetal.，2007)。這些相似結(jié)構(gòu)與功能特征均暗示GPR78與GPR26可能具有相同的配體(Leeetal.，2000；Underwoodetal.，2006)以及相似的胞內(nèi)信號(hào)通路(Underwoodetal.，2006)，但該假設(shè)尚待證實(shí)。

圖5 家雞GPR78與GPR26基因的氨基酸序列比對(duì)

Fig. 5 Amino acid sequence alignment of chickenGPR78 (cGPR78) andGPR26 (cGPR26)

橫線(xiàn)為7次跨膜結(jié)構(gòu)域。

The seven transmembrane domains were indicated by horizontal lines.

此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)GPR78 mRNA主要在家雞腦和垂體中表達(dá)。該結(jié)果與哺乳動(dòng)物GPR78的表達(dá)圖譜相似(Leeetal.，2000；Jonesetal.，2007)。GPR78在雞垂體和下丘腦中表達(dá)(圖4)也暗示，與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，GPR78可在家雞下丘腦-垂體軸上發(fā)揮功能(Hermanetal.，1996；Altamuraetal.，1999；Rybakowski & Twardowska，1999；Pariante & Miller，2001)，或參與腦的發(fā)育與功能調(diào)節(jié)。然而該推論尚待驗(yàn)證。家雞GPR78基因的克隆與組織表達(dá)圖譜分析為后續(xù)探究其在脊椎動(dòng)物中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

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Molecular Cloning and Tissue Expression of ChickenGPR78 Gene

HU Yuanyuan, MO Chunheng, WANG Yajun, LI Juan*

(Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

G protein-coupled receptor (GPCR), also known as the seven transmembrane receptor, belongs to a large receptor gene superfamily and involves in nearly all physiological processes of organisms.GPR78, as a member of GPCR, is an orphan receptor. At present, little is known about the structure and biological functions of this receptor gene in vertebrates. In this study, using chicken as an animal model, we cloned theGPR78 gene and examined its expression in different tissues of chicken. The results showed that the open reading frame of chickenGPR78 was 1020 bp in length and contained three exons, and this gene was predicted to encode a receptor of 339 amino acids; RT-PCR assay revealed that chickenGPR78 was highly expressed in various brain regions and pituitary, but not in other examined peripheral tissues. The data of study will contribute to explore the physiological roles ofGPR78 gene in chickens.

chicken; G protein-coupled receptors; GPR78; cloning; tissue expression

10.11984/j.issn.1000-7083.20150178

2015-05-12 接受日期：2015-09-14 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271325; 31272436)

胡媛媛(1989—), 女, 碩士研究生, 研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖與分子內(nèi)分泌, E-mail:1043945258@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:lijuanhk@gmail.com

Q78

A

1000-7083(2016)01-0052-06