張海全，黃勤英

(1 廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系，廣西 崇左 532200；2 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點實驗室培育基地，廣西 崇左 532200)

?

正交實驗優(yōu)化提取絲瓜藤中的齊墩果酸

張海全1,2，黃勤英1

(1 廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系，廣西 崇左 532200；2 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點實驗室培育基地，廣西 崇左 532200)

為建立絲瓜藤中齊墩果酸的含量測定方法，優(yōu)選絲瓜藤中齊墩果酸的提取工藝，以齊墩果酸的得率為指標(biāo)，利用正交實驗優(yōu)化提取工藝，并進行含量測定。所得線性方程為Y=0.0627X- 0.0287，(r=0.9979，n= 6)齊墩果酸濃度與吸光度在3.3～20.0 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；最佳提取工藝為75%乙醇、料液比1:40、超聲波提取時間70 min、提取溫度70 ℃；絲瓜藤中齊墩果酸的含量為3.82 mg/g。優(yōu)化的提取工藝可靠性強，提取效率高。該法測定絲瓜藤中齊墩果酸含量穩(wěn)定、快速、簡便。

絲瓜藤；齊墩果酸；提取工藝；含量測定

絲瓜藤為葫蘆科植物絲瓜或粵絲瓜的莖，含有人體所需要的多種化學(xué)成分[1]，迄今從中已分離獲得五環(huán)三萜皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、芹菜素類等成分。民間常用絲瓜藤及其提取物治療慢性鼻炎、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎等疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為：絲瓜藤具有抗炎和抗過敏、抗菌、抗病毒等藥理學(xué)作用[2]。

齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，多分布于自然界綠色植物中，可溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，不溶于水。研究表明齊墩果酸具有護肝、降糖、降脂、抗炎、抗病毒、抗癌等藥理作用[3-6]。齊墩果酸多采用回流提取法、超聲波提取法、微波輔助提取法等方法進行提取[7-9]。本研究利用正交實驗優(yōu)化提取絲瓜藤中的齊墩果酸，為絲瓜藤資源利用和齊墩果酸開發(fā)提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

材料：絲瓜藤，采集于廣西宜州市，自然風(fēng)干，粉碎過24目篩，備用。

試劑：齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，110709-200304)；香草醛，高氯酸，冰醋酸等試劑均為市售分析純試劑。

儀器：HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器，SHZ-CD循環(huán)水式多用真空泵，UV-1100紫外分光光度計，AL-204電子分析天平，ZFD-5140鼓風(fēng)干燥箱，小型萬能粉碎機。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用95%乙醇配制齊墩果酸對照品溶液(0.2 mg·mL-1)。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分別置于比色管中，加熱揮去溶劑，加入5%香草醛一冰醋酸液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL，搖勻，設(shè)對照管，在545 nm下測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0627X- 0.0287 (r=0.9979，n= 6)，齊墩果酸在3.3～20.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 單因素試驗

以齊墩果酸的得率為指標(biāo)，選定料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，各因素平行3次試驗。

1.2.3 正交試驗

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選定考察因素和水平，以齊墩果酸的得率作為指標(biāo)，采用L9(34)表進行正交試驗優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素的考察結(jié)果

2.1.1料液比對齊墩果酸提取效果的影響

稱取絲瓜藤20 g共5份，按料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50分別加入95%乙醇溶液，在70 ℃下超聲波提取30 min，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對齊墩果酸提取效果的影響

由圖1可知，隨著提取劑用量的增大，齊墩果酸的得率逐漸增大，但當(dāng)料液比達(dá)到1:40(g:mL)后，得率上升速度變得緩慢，說明料液比達(dá)到1:40，齊墩果酸提取較完全。為了充分提取，選擇料液比為1:40。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對齊墩果酸提取效果的影響

稱取絲瓜藤20 g共5份，按料液比1:40分別加入800 mL的55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液，在70 ℃下超聲波提取30 min，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對齊墩果酸提取效果的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從50% 增大到75% 時，齊墩果酸得率呈上升趨勢，即當(dāng)達(dá)到75%時，齊墩果酸的得率最大值0.319，故選用乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%較合適。

2.1.3 溫度對齊墩果酸提取效果的影響

稱取絲瓜藤20 g共5份，按料液比1:40分別加入800 mL 75%乙醇溶液，分別在40、50、60、70、80 ℃下超聲波提取30 min，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對齊墩果酸提取效果的影響

由圖3可知，齊墩果酸的得率隨著溫度的升高而增大隨著溫度的升高，在溫度為70 ℃時，達(dá)到最大值0.296，繼續(xù)升高溫度齊墩果酸的得率下降，故超聲波提取溫度選擇70 ℃ 較合適。

2.1.4 提取次數(shù)對齊墩果酸提取效果的影響

稱取絲瓜藤20 g共4份，按料液比1:40分別加入800 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃下超聲波提取30 min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對齊墩果酸提取效果的影響

由圖4可知，提取次數(shù)為2次時，齊墩果酸得率達(dá)到最大值0.311，增加提取次數(shù)，略有減小的趨勢，分析原因可能是提取次數(shù)越多，所用的乙醇液越多，揮干需要更長的時間，故提取次數(shù)選擇2次最適宜。

2.1.5 提取時間對齊墩果酸提取效果的影響

稱取絲瓜藤20 g共5份，按料液比1:40分別加入800 mL 75%乙醇溶液，在70 ℃下超聲波提取2次，提取時間分別為10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間對齊墩果酸提取效果的影響

分析圖5可知，提取時間為30 min時，齊墩果酸得率達(dá)到最大值0.391，增加超聲波提取時間則有所減小?？赡苁窃诔暡ㄌ崛r間過長，齊墩果酸分子被破壞；也可能使齊墩果酸與雜質(zhì)結(jié)合更加緊密，從而不易被提取，故選擇提取時間30 min較合適。

2.2 正交試驗結(jié)果

從單因素的考察結(jié)果分析選定料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)作為考察因素，設(shè)計好因素水平表，見表1。以齊墩果酸的得率為指標(biāo)，采用L9(34)表進行正交試驗，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

通過表2中極差R值可知各因素影響齊墩果酸提取效率的順序為C>A>D>B，即提取溫度是主要的影響因素，其次為料液比和提取時間，乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效率影響最小。對正交結(jié)果進行分析，從K值可以得出各因素的最優(yōu)水平，K值越大，該水平的效率越高，比較不同因素的得率，確定最優(yōu)方案為A1B2C1D1，即料液比1:40，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，提取溫度70 ℃，超聲波提取時間70 min。

2.3 驗證試驗結(jié)果

用單因素考察得到的理想提取工藝和正交試驗得出的最優(yōu)方案平行3次提取比較，齊墩果酸的含量測定結(jié)果如表3。

表3 兩方案提取結(jié)果的比較

結(jié)果表明，正交試驗最優(yōu)方案提取齊墩果酸的含量高于單因素提取工藝提取齊墩果酸的含量。因此超聲波提取絲瓜藤的最佳工藝條件是：料液比1:40，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，提取溫度70 ℃，超聲波提取時間70 min。

2.4 樣品測定結(jié)果

采用最優(yōu)工藝對同一批絲瓜藤中的齊墩果酸進行提取，其含量測定結(jié)果見表4。

表4 含量測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究通過對絲瓜藤中的齊墩果酸提取工藝進行優(yōu)化，并進行含量測定，結(jié)論如下：

(1)標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.0627X-0.0287 (r=0.9979，n=6)，齊墩果酸濃度與吸光度在3.3～20.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

(2)絲瓜藤中齊墩果酸最佳提取工藝：料液比1:40，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，提取溫度70 ℃，超聲波提取時間70 min。

(3)測定同一批絲瓜藤中齊墩果酸的含量是3.82 mg·g-1。為絲瓜藤進一步開發(fā)利用和有效性研究提供理論依據(jù)，對尋找新藥、開發(fā)醫(yī)療保健品及綜合利用資源等具有重要的意義。

[1] 李程斌,李恩.絲瓜藤和葉營養(yǎng)成分分析[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,32(1):70-71.

[2] 毛澤善,宋向鳳,馬全祥,等.絲瓜藤提取物對小鼠免疫功能的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,21(1):8-10.

[3] Korba BE, Gerin JL, et al. Use of a standardized cell culture assay to assess activities of nucleoside analogs against hepatitis B virus replication [J].Antiviral Res,1992,19(1):55-56.

[4] Astudillo L, Rodriguez J A, Schmcd -Hirschmann G. Gatroprotective activity of oleanlic acid deivatives 0n experimentally induced gastric lesions in rats and mice[J]. J Pharm Pharmacol,2002, 54(4):583.

[5] Cai L,Wu CD. Compounds from Syzygim Aromaicum Possessing Growth Inhiitory Activity Against Oral Pathogens[J].Jnat Prod,1996,59:10987.

[6] Hsu HY, Yang JJ, Lin CC. Effect of Oleanlic Acid, Ursolic Acid on Inhibiting Tumor Growth and Enhancing the Recovery of Hematopoietic System Postirradiation in Mice[J]. Cancer Lett,1997,111:1-7.

[7] 王文平,周文美.木瓜中齊墩果酸的分離提取及含量測定[J].食品科學(xué),2004,25(9):150-151.

[8] 顏廷才,孟憲軍,李江闊,等.超聲波提取嫩芽中齊墩果酸類皂苷的工藝研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 2008,34(5):170-172.

[9] 盧佳飛,李文飛,馮偉,等.微波輔助提取石榴皮中齊墩果酸的工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(2): 42-50.

Optimization of Extract Technology of Oleanolic Acid in Vine ofLuffaby Orthogonal Experiment*

ZHANGHai-quan1,2,HUANGQin-ying1

(1 Guangxi Normal University for Nationalities, Guangxi Chongzuo 532200; 2 Guangxi Normal University for Nationalities, Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory Breeding Base of Chemistry of Guangxi Southwest Plant Resources, Guangxi Chongzuo 532200, China)

Method for quantitative determination of Oleanolic Acid to obtain the optimal technology of extraction Oleanolic Acid in vine ofLuffawas established by using orthogonal experiment with extraction rate of Oleanolic Acid as index, and the content of Oleanolic Acid was determined. The concentration and absorbance of Oleanolic Acid showed a good linear relationship in the range of 3.3～20.0 μg·mL-1and the linear equation wasY=0.0627X-0.0287 (r=0.9979，n= 6). The best technical condition was as follows: 75% alcohol, ratio of solid to liquid was 1:40, the extraction time was 70 min, the extraction temperature was 70 ℃. The quantitative determination of Oleanolic Acid in vine of Luffa was 3.82 mg·g-1. The optimum extraction conditions had a good reliability and high extraction rate. The method used for the determination of the Oleanolic Acid in vine and leaves of Luffa appears to be stable, quick and simple.

vine ofLuffa; Oleanolic Acid; extraction technology; content determination

R932

A

1001-9677(2016)021-0034-03

2016年廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目(桂教科研【2016】3號文件，No：KY2016YB517)。

張海全，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的研究開發(fā)及新劑型研究。