趙建華，陸仁飛

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 226006)

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·論 著·

乙型肝炎病毒B、C基因型全基因組序列的克隆*

趙建華，陸仁飛△

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 226006)

目的 構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型全基因組序列克隆。方法 從HBV無癥狀慢性攜帶者中篩選B、C基因型，提取病毒核酸，設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用高保真酶對(duì)3 200 bp的HBV DNA進(jìn)行全序列擴(kuò)增，通過克隆技術(shù)構(gòu)建pGEM-HBV重組質(zhì)粒，測序后進(jìn)行序列分析。結(jié)果 獲得HBV B基因型和HBV C基因型重組質(zhì)粒各1株。結(jié)論 成功構(gòu)建HBV B基因型和HBV C基因型的全基因組序列克隆，可為進(jìn)一步研究HBV分子流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究提供工具。

乙型肝炎病毒； B基因型； C基因型； 全基因組序列； 克隆

乙型肝炎病毒(HBV)是嚴(yán)重威脅人類健康的病原體，全球約有20億人感染過HBV，其中超3.5億人發(fā)展為慢性感染者。我國是HBV感染流行的高發(fā)區(qū)[1-2]。由于HBV在復(fù)制過程中缺乏校對(duì)酶作用，容易發(fā)生核苷酸配對(duì)錯(cuò)誤，長期突變累積形成不同基因型。根據(jù)“HBV全基因組序列大于92%”的標(biāo)準(zhǔn)，可將HBV分為A～H 8種基因型[3]，HBV基因型研究不僅與HBV的分子流行病學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究密切相關(guān)，且與病毒感染后的臨床進(jìn)展相關(guān)[4]。我國HBV基因型以B、C型為主[1]。HBV DNA是雙鏈非閉合的松弛結(jié)構(gòu)，正負(fù)2條鏈不等長，加之基因組長度為3.2×103，使得HBV全基因組的擴(kuò)增和克隆較難。本研究采用一步法長距離聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法獲得完整的3.2×103HBV全基因組，進(jìn)一步構(gòu)建HBV基因B、C型質(zhì)粒，為后續(xù)的HBV研究提供工具?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 30例無癥狀HBV攜帶者，診斷符合2000年9月全國會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者未經(jīng)任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒藥物治療。HBV血清標(biāo)志物包括表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗HBsAb)、e抗原(HBeAg)、e抗體(抗HBeAb)、核心抗體(抗HBcAb)。抽取患者血液，分離血清。

1.2 儀器與試劑 血清病毒核酸提取試劑盒由廈門至善生物公司提供；HBV DNA定量試劑盒購于上海科華生物科技有限公司；HBV基因分型試劑盒購于上海之江生物公司；E.Z.N.A gel extraction kit、E.Z.N.A plasmid mini kit購于Omega公司；Kod-Plus聚合酶購于TOYOBO公司；T-easy vector 購于Promega公司；DH-5α由南通大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅠ購于大連TaKaRa公司；PCR擴(kuò)增儀為ABI-7500熒光定量PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)為SYN-GBOX。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA核酸提取 吸取100 μL血清，嚴(yán)格按照血清中病毒核酸提取試劑盒(手工法100 μL體系)說明書操作，最后用50 μL洗脫液洗脫。

注：F1為5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3′；R1為5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3′。

1.3.2 HBV DNA定量檢測及HBV B、C基因型篩選 HBV DNA定量檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，操作按說明書；HBV B、C基因型檢測采用TaqMAn熒光探針PCR法，操作按說明書。

1.3.3 引物 引物設(shè)計(jì)參考Gunther等[6]的引物序列，以HBV負(fù)鏈開口處為克隆序列的起始點(diǎn)，引物由英駿生物上海合成部合成，見圖1。

1.3.4 HBV的全基因組序列擴(kuò)增 擴(kuò)增所用高保真聚合酶Kod-Plus 酶購自TOYOBO公司。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照說明書。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3.5 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物加A，加A反應(yīng)條件為72 ℃ ，30 min；加A產(chǎn)物膠回收。

1.3.5 HBV全基因組序列的克隆及鑒定 膠回收產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體4 ℃連接16 h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落，抽提質(zhì)粒，SALⅠ、ECORⅠ酶切鑒定。

1.3.6 HBV全基因組序列克隆質(zhì)粒測序及分析 選擇經(jīng)酶切鑒定證實(shí)含3 200 bp片段的重組質(zhì)粒送上海華大基因測序部測序，測序結(jié)果進(jìn)行Genebank比對(duì)，DNASTAR分析。

2 結(jié) 果

2.1 HBV B、C基因型的篩選 以患者血清中提取的HBV DNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定病毒載量，見圖2；以提取的HBV DNA為模板，TaqMan熒光探針PCR法篩選HBV B、C基因型，見圖3。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定病毒載量

圖3 TaqMan熒光探針PCR法篩選HBV B、C 基因型

注：1為陰性對(duì)照；2為患者血清HBV DNA作模板的PCR產(chǎn)物；3為DNA Marker。

2.2 HBV DNA的擴(kuò)增 以篩選到的HBV B、C基因型的HBV DNA為模板，利用F1和R12條引物擴(kuò)增HBV基因組， PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約3 200 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，見圖4。

2.3 構(gòu)建質(zhì)粒的酶切鑒定 為驗(yàn)證重組質(zhì)粒中是否插入3 200 bp的目標(biāo)序列，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示：在pGEM-Teasy Vector中插入了3 200 bp大小的片段，見圖5。

注：1、4為pGEM-HBV質(zhì)粒；2、5為ECORⅠ單酶切；3、6為SalⅠ單酶切；M為 DNA Marker。

圖6 HBV-B2序列

2.4 序列分析 測得序列，剔除載體序列，通過Genbank進(jìn)行核苷酸比對(duì)，2株HBV重組質(zhì)粒的基因型為B型和C型，獲得2個(gè)HBV全基因組序列長度分別為3 215 bp和3 216 bp，能夠完整翻譯HBV所有蛋白，分別將其命名為HBV-B2和HBV-C1，見圖6、7。通過MEGA 4軟件對(duì)其基因進(jìn)行分型，確定其為B、C基因型，見圖8(見《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

圖7 HBV-C1序列

3 討 論

本研究對(duì)象選取未接受任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒藥物治療的無癥狀攜帶者。我國HBsAg的流行率大約為10%，其中大部分是無癥狀攜帶者[1,7]。由于未經(jīng)過、未接受任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒藥物治療，宿主中HBV毒株受到的免疫壓力和藥物篩選作用小，在感染過程中病毒變異發(fā)生率低，能確實(shí)反映我國HBV流行株存在情況，具有更廣的代表性，其構(gòu)建的HBV全基因組克隆可為HBV相關(guān)研究提供有利條件。

HBV基因型分布有較顯著的地域特征，A、D型主要分布在歐洲和美國，B、C型主要分布在東南亞和東亞，E型主要在西非流行，F(xiàn)型集中在中南美洲，而G型僅在個(gè)別國家有單個(gè)案例報(bào)道[7-8]。我國以B、C基因型為主，本試驗(yàn)構(gòu)建的HBV B、C基因型全基因組序列克隆順應(yīng)了我國HBV研究的需要。

然而，在對(duì)30個(gè)無癥狀攜帶者篩選B、C基因型過程中，筆者發(fā)現(xiàn)，只有1例患者是B基因型，其余29例均為C基因型，與以往的文獻(xiàn)報(bào)道B、C基因型比例相差較大[8-11]。此可能與樣本量太小無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用TaqMan熒光探針法沒有測序法精確，大規(guī)模疫苗接種和臨床抗病毒藥物的廣泛使用造成B、C基因型比例改變等相關(guān)，具體原因有待下一步試驗(yàn)研究證實(shí)。

以往研究中，擴(kuò)增HBV全基因組根據(jù)所使用引物數(shù)目的不同，可以分為一片段法(使用1對(duì)引物)和多片段法(使用多對(duì)引物)。由于HBV突變率相對(duì)較高，同一患者體內(nèi)的HBV DNA序列是以1個(gè)準(zhǔn)種池的形式呈現(xiàn)[12-15]，而非單一序列，本試驗(yàn)采用了一步法長距離PCR擴(kuò)增HBV全基因組序列，避免了多次PCR拼接所導(dǎo)致的“人工假基因組”現(xiàn)象。

HBV DNA是雙鏈非閉合的松弛結(jié)構(gòu)，正負(fù)2條鏈不等長，加之基因組長度為3.2×103，使得HBV全基因組的擴(kuò)增和克隆難度較高。因此，提取病毒DNA的效率及完整性、聚合酶的保真度和擴(kuò)增效率將是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。筆者通過高溫裂解法、柱提法、磁珠提取法比較發(fā)現(xiàn)，高溫裂解法雖然有較高提取效率但提取的核酸無法擴(kuò)增全長(可能由于高溫堿裂解打斷了DNA鏈完整性)；柱提法能將病毒載量大于1×106copy/mL血清提取的核酸擴(kuò)增到3.2×103的HBV全基因組，而從病毒載量小于1×106copy/mL血清提取的核酸很難擴(kuò)增到3.2×103的HBV全基因組；磁珠提取法能從病毒載量大于1×105copy/mL血清提取的核酸擴(kuò)增到3.2×103的HBV全基因組。因此，筆者推斷磁珠法更適合低滴度長片段核酸的提取。普通的Taq DNA 聚合酶有很強(qiáng)5′→3′的聚合酶活性，但是缺乏3′→5′核酸外切酶活性，無法消除擴(kuò)增過程中與模板鏈錯(cuò)配的現(xiàn)象，本試驗(yàn)的PCR酶采用了TOYOBO公司的Kod-Plus酶,Kod-Plus酶具有較高的DNA合成效率以及PCR保真度，其保真度大約為普通Taq DNA聚合酶的82倍[11]，但是，Kod-Plus具有較強(qiáng)的3′→5′核酸外切酶活性，使其擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物末端被平滑化，故不能直接進(jìn)行TA克隆。為便于PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體連接，必須在PCR后，對(duì)PCR產(chǎn)物末端進(jìn)行加A反應(yīng)，增加TA克隆效率。

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Cloning of complete-genome sequence of hepatitis B virus genotype B and C*

ZHAOJianhua,LURenfei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NantongMunicipalThirdPeople′sHospital,Nantong,Jiangsu226001,Chian)

Objective To construct the clone of full-genome sequence of hepatitis B virus(HBV) genotype B and C.Methods HBV genotype B and C were screened from asymptomatic carriers of HBV for extracting HBV nucleic acid and designing primer.The high fidelity enzyme was used to perform the full sequence amplification of 3 200 bp HBV DNA.The pGEM-HBV recombinant plasmid was constructed by using the clone technique.Then the sequence analysis was performed after sequencing.Results Each strain of recombinant HBV genotype B and C was obtained.Conclusion The clone of full-genome sequence of HBV genotype B and C is successfully constructed,which can provide a tool for further study of HBV molecular epidemiology and basic study.

HBV; genotype B; genotype C; complete genome sequence; clone

江蘇省南通市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(WQ2014038，W201217)；江蘇省南通市科技局資助項(xiàng)目(HS2014062)。

趙建華，男，副主任技師，主要從事臨床微生物方面的研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.004

A

1673-4130(2016)22-3101-04

2016-04-15

2016-06-21)