方宜臻，葉輝銘，劉江武，金宏偉，林永志，顏水堤，于 洋，高 磊，徐飛海，張忠英△

(1.廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門(mén) 361000；2.廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建廈門(mén) 361000)

?

·臨床研究·

國(guó)產(chǎn)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)估*

方宜臻1，葉輝銘1，劉江武2，金宏偉1，林永志1，顏水堤1，于 洋1，高 磊2，徐飛海2，張忠英1△

(1.廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門(mén) 361000；2.廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建廈門(mén) 361000)

目的 對(duì)廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司的細(xì)胞角蛋白19片段非小細(xì)胞肺原相關(guān)抗原21-1(CYFRA21-1)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分析性能評(píng)估。方法 依據(jù)《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》等文件對(duì)試劑盒的敏感性、線性范圍、可報(bào)告范圍、準(zhǔn)確度、精密度、交叉反應(yīng)等性能進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)與電化學(xué)發(fā)光法平行比對(duì)，檢測(cè)配對(duì)血清/血漿結(jié)果的一致性。結(jié)果 該試劑盒檢測(cè)最低限為0.1 ng/mL；線性范圍為 0.1～1 000.0 ng/mL；可報(bào)告范圍達(dá)0.1～2 000.0 ng/mL；批內(nèi)精密度為6.15%～9.46%，批間精密度為7.57%～11.00%；回收率達(dá)99.60%；與多種常見(jiàn)腫瘤抗原無(wú)交叉反應(yīng)；輕度溶血、膽紅素小于或等于340 μmol/L、三酰甘油小于或等于18.1 μmol/L及類(lèi)風(fēng)濕因子小于或等于400 U/mL時(shí)，對(duì)試劑無(wú)顯著干擾；與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)總符合率為98.56%，一致性良好(P<0.05，Kappa=0.965)；血清、血漿標(biāo)本檢測(cè)一致性良好(P<0.05，Kappa=0.936)。結(jié)論 廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒各項(xiàng)性能評(píng)估良好，可滿(mǎn)足臨床檢測(cè)要求。

細(xì)胞角蛋白19片段； 試劑； 化學(xué)發(fā)光免疫分析法； 方法學(xué)評(píng)價(jià)

細(xì)胞角蛋白是一種構(gòu)成上皮組織中間纖維亞單位的結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞骨架的重要組成部分[1]。人體中約有20種相對(duì)分子質(zhì)量為(40～70)×103的角蛋白，其中細(xì)胞角蛋白19在正常狀態(tài)下水平極低，當(dāng)細(xì)胞惡性變時(shí)大量細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段釋放入血，通過(guò)2種特異性單克隆抗體KS19.1和BM19.21可測(cè)定出相對(duì)分子質(zhì)量約為30×103的細(xì)胞角蛋白19片段[2]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，血液、尿液中的細(xì)胞角蛋白19片段是一種重要腫瘤標(biāo)志物，在非小細(xì)胞肺癌[3]、鼻咽癌[4-5]、膀胱癌[6-8]、食管癌等腫瘤中均具有良好的臨床診斷價(jià)值[9]。

目前，非小細(xì)胞肺癌相關(guān)抗原21-1(CYFRA21-1)的檢測(cè)方法主要以電化學(xué)發(fā)光法和化學(xué)發(fā)光法免疫分析法為主，2種方法具有高敏感性、高特異性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，但是95.00%以上的市場(chǎng)份額都被國(guó)外品牌所占領(lǐng)，且試劑盒成本昂貴。因此，開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，評(píng)估并使用性能穩(wěn)定、優(yōu)良的國(guó)產(chǎn)CYFRA21-1化學(xué)發(fā)光法免疫分析試劑盒是打破國(guó)外品牌長(zhǎng)期壟斷局面的有效途徑，能大大降低臨床檢驗(yàn)CYFRA21-1的成本，降低醫(yī)療費(fèi)用。

廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司與本實(shí)驗(yàn)室合作，對(duì)廈門(mén)萬(wàn)泰公司的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量檢測(cè)試劑盒的敏感性、線性范圍、交叉反應(yīng)等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)與德國(guó)羅氏公司的CYFRA21-1定量測(cè)定試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行平行比對(duì)，結(jié)果顯示國(guó)產(chǎn)試劑各性能指標(biāo)良好。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)比對(duì)血清：2013年7月患者血清標(biāo)本中選取348例標(biāo)本，用于試劑A、B平行比對(duì)試驗(yàn)。(2)準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)血清：標(biāo)本庫(kù)選取1例健康人血清，用于準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)。(3)可報(bào)告范圍試驗(yàn)血清：標(biāo)本庫(kù)中選取5例不同CYFRA21-1水平低值標(biāo)本和3例不同CYFRA21-1水平高值標(biāo)本用于可報(bào)告范圍驗(yàn)證試驗(yàn)。(4)精密度試驗(yàn)標(biāo)本：標(biāo)本庫(kù)中選取選1例低值及1例高值血清(血清標(biāo)本1、血清標(biāo)本2)用于精密度試驗(yàn)。(5)血清/血漿相關(guān)性分析標(biāo)本：收集2013年7月99例子患者配對(duì)血清/血漿標(biāo)本共99對(duì)198例，用于血清/血漿一致性分析。(6)交叉反應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)本：標(biāo)本庫(kù)中選取42例甲胎蛋白(AFP)、腫瘤抗原(CA)12-5、CA15-3、CA19-9、癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性抗原(SCC)分別為陽(yáng)性且CYFRA21-1經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，用于交叉反應(yīng)試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 采用CARIS系列化學(xué)發(fā)光儀(廈門(mén)優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，COBAS e601(德國(guó)羅氏公司)。

1.2.2 試劑 (1)試劑A：廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)；(2)試劑B：德國(guó)羅氏公司的非小細(xì)胞肺癌相關(guān)抗原21-1定量測(cè)定試劑盒(批號(hào)173353)；(3)干擾物：膽紅素(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批號(hào)39340)、三酰甘油(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批號(hào)55543)、類(lèi)風(fēng)濕因子(Biorbyt，批號(hào)D6987)；(4)L系列參考品(廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20130326)；(5)參考品M(0水平校準(zhǔn)品，廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20130326)；(6)企業(yè)一級(jí)校準(zhǔn)品(廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20130314)。

1.3 方法

1.3.1 分析敏感性評(píng)價(jià) 試劑A檢測(cè)梯度稀釋的L系列參考品并擬合劑量反應(yīng)曲線，同時(shí)重復(fù)測(cè)定0水平校準(zhǔn)品20次，計(jì)算最低檢測(cè)限。

1.3.2 線性范圍評(píng)價(jià) 參考CLSI EP-6A文件提供的方案并依據(jù)《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》[10]，用試劑A 檢測(cè)梯度稀釋的企業(yè)一級(jí)校準(zhǔn)品，以校準(zhǔn)品水平對(duì)數(shù)為X，測(cè)定水平平均值對(duì)數(shù)為Y建立回歸方程并計(jì)算偏離直線平均差異(ADL)，評(píng)價(jià)其線性范圍。

1.3.3 可報(bào)告范圍評(píng)價(jià) 參考CLSI EP-6A文件并依據(jù)《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》[10]，試劑A重復(fù)檢測(cè)5個(gè)水平的低值標(biāo)本(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5)及3個(gè)不同水平的高值標(biāo)本(H1、H2、H3)。變異系數(shù)(CV)≤10.00%的最低水平作為可報(bào)告范圍低限。高值標(biāo)本還原水平與理論水平偏差不超過(guò)(±10.00)%時(shí)，其還原水平為可報(bào)告范圍高限。

1.3.4 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 20 μL稀釋校準(zhǔn)品加入180 μL健康人血清制得混合血清，將稀釋校準(zhǔn)品、正常人血清及混合血清重復(fù)測(cè)量3次，參考 CLSI EP9-A2文件并根據(jù)《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》計(jì)算準(zhǔn)確度[11]。

1.3.5 精密度評(píng)價(jià) 基于《YYT 1175-2010 腫瘤標(biāo)志物定量測(cè)定試劑(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)》的有關(guān)要求并參考CLSI EP5-A文件[12]，用3批試劑(批號(hào)：RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)檢測(cè)血清標(biāo)本1、2并計(jì)算批內(nèi)和批間CV。

1.3.6 干擾試驗(yàn) 參考CLSI EP7-A文件并依據(jù)《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》[13]，用3批試劑(批號(hào)RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)分別檢測(cè)同一患者溶血前與溶血后的血清標(biāo)本，考察輕度溶血對(duì)試劑準(zhǔn)確度的影響；用健康人血清稀釋膽紅素溶液、三酰甘油溶液及類(lèi)風(fēng)濕因子溶液，測(cè)試膽紅素、三酰甘油及類(lèi)風(fēng)濕因子對(duì)試劑檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響。計(jì)算添加干擾因素前后的百分偏差(Bias)，以超過(guò)±10.00%判定為存在干擾。

1.3.7 交叉反應(yīng)驗(yàn)證 試劑A檢測(cè)42例交叉反應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)本，用于交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。

1.3.8 試劑A與試劑B平行比對(duì)試驗(yàn) 試劑A、B平行測(cè)定347例患者血清CYFRA21-1水平，以試劑B的結(jié)果為X，試劑A結(jié)果為Y，構(gòu)建線性回歸方程。同時(shí)，根據(jù)各試劑的參考范圍將結(jié)果判為CYFRA21-1異?；蛘?，計(jì)算總符合率并進(jìn)行一致性分析和相關(guān)性分析。

1.3.9 血漿/血清相關(guān)性分析 試劑A檢測(cè)99對(duì)198例配對(duì)血清/血漿標(biāo)本，比較血清、血漿標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性、相關(guān)性并以血漿檢測(cè)結(jié)果為Y，血清檢測(cè)結(jié)果為X進(jìn)行簡(jiǎn)單線性回歸分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用多項(xiàng)回歸分析并計(jì)算ADL，當(dāng)ADL小于相應(yīng)臨界值時(shí)認(rèn)為多項(xiàng)式具有臨床可接受的非線性；一致性評(píng)價(jià)采用Kappa一致性檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，線性回歸分析采用簡(jiǎn)單線性回歸分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分析敏感性評(píng)價(jià) 劑量反應(yīng)曲線見(jiàn)圖1，試劑A最低檢測(cè)水平平均值為0.095 2 ng/mL，該試劑盒最低檢出限為0.1 ng/mL。

圖1 試劑A (RM2013031501)的劑量反應(yīng)曲線

2.2 線性范圍評(píng)價(jià) 檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1。PctBnd取5.00%時(shí)， ADL均小于其臨界值具有臨床可接受的非線性，見(jiàn)表2。因此，本試劑盒線性范圍為0.1～1 000.0 ng/mL。

表1 試劑A(RM2013031501)對(duì)企業(yè)一級(jí)校準(zhǔn)品梯度稀釋的檢測(cè)結(jié)果(ng/mL)

表2 試劑A(RM2013031501)多項(xiàng)式回歸方程及線性檢驗(yàn)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3 可報(bào)告范圍評(píng)價(jià) 可報(bào)告范圍的結(jié)果，見(jiàn)表3、4。水平為0.076～0.206 ng/mL時(shí)，CV值均小于10.0%，所以0.1 ng/mL為可報(bào)告范圍低限。高值標(biāo)本進(jìn)行2倍稀釋時(shí)，CV值小于5.00%且還原水平與理論水平的偏差Bias均小于10.00%，可報(bào)告范圍高限為2 000.0 ng/mL，因此該試劑盒可報(bào)告范圍為0.1～2 000.0 ng/mL。

表3 試劑A(RM2013031501)可報(bào)告范圍下限檢測(cè)結(jié)果

表4 試劑A(RM2013031501)可報(bào)告范圍上限檢測(cè)結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 回收率為95.60%～103.70%，平均回收率為99.60%，定量準(zhǔn)確性良好。

2.5 精密度評(píng)價(jià) 批內(nèi)精密度為6.15%～9.46%，批間精密度為7.57%～11.00%，試劑盒的重復(fù)性良好，見(jiàn)表5。

2.6 干擾試驗(yàn) 溶血、膽紅素、三酰甘油及類(lèi)風(fēng)濕因子對(duì)試劑A影響較小，添加干擾因素后的Bias均在10.00%以?xún)?nèi)。見(jiàn)表6。

表5 試劑A精密度

注：血清標(biāo)本1批間CV為7.57%，血清標(biāo)本2批間CV為11.00%。

表6 不同干擾因素對(duì)試劑檢測(cè)結(jié)果的影響

2.7 交叉反應(yīng)驗(yàn)證 AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CEA、SCC對(duì)試劑A的交叉反應(yīng)物水平分別為：31.54～244.72 ng/mL、104.8～516.2 U/mL、72.63～189 U/mL、134.2～801.3 U/mL、119.9～379.6 ng/mL、11.9～35.8 ng/mL，試劑A對(duì)多種腫瘤抗原交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

圖2 A、B試劑血清CYFRA21-1檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)擬合

2.8 試劑A與試劑B平行比對(duì)試驗(yàn) 試劑A與試劑B呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=1.524X-1.889(R2=0.975，P<0.05)，見(jiàn)圖2。同時(shí)，一致性比較及相關(guān)性分析的結(jié)果顯示試劑A與試劑B具有良好的一致性(Kappa=0.971，P<0.05)及相關(guān)性(r=0.987，P<0.05)，總符合率為98.56%。

2.9 血漿/血清相關(guān)性分析 配對(duì)血漿/血清標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果具有良好一致性(Kappa=0.936，P<0.05)及相關(guān)性(r=0.949，P<0.05)，線性回歸方程為Y=0.947X+0.242(R2=0.900，P<0.05)，見(jiàn)圖3，因此試劑A對(duì)血清和血漿的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 血清、血漿CYFRA21-1測(cè)定結(jié)果線性相關(guān)擬合圖

3 討 論

CYFRA21-1是一種臨床腫瘤標(biāo)志物，尤其對(duì)非小細(xì)胞肺癌有重要診斷價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)CYFRA21-1多以羅氏、雅培等國(guó)外品牌為主，臨床檢驗(yàn)成本昂貴。因此，國(guó)產(chǎn)CYFRA21-1化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的研究、應(yīng)用和推廣對(duì)降低醫(yī)療費(fèi)用、提升患者滿(mǎn)意度具有重要社會(huì)意義。萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司與本實(shí)驗(yàn)室合作，對(duì)廈門(mén)萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的敏感性、線性范圍、可報(bào)告范圍、準(zhǔn)確度、精密度、干擾試驗(yàn)、交叉反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，并與試劑B(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行平行比對(duì)，結(jié)果顯示，該試劑盒各項(xiàng)檢測(cè)性能均可滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)要求，且適用于血清及血漿標(biāo)本。

干擾試驗(yàn)結(jié)果表明膽紅素、三酰甘油及類(lèi)風(fēng)濕因子不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，但本試驗(yàn)添加的外源性膽紅素、三酰甘油、類(lèi)風(fēng)濕因子水平分別為0～340 μmol/L、0～18.1 mmol/L和0～400 U/mL，因此，對(duì)于膽紅素水平高于340 μmol/L、高乳糜濁度及高類(lèi)風(fēng)濕因子水平標(biāo)本，本試劑盒的抗干擾能力還有待進(jìn)一步改良。同時(shí)，溶血前后血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，輕度溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小，但中、重度溶血對(duì)該試劑盒的抗干擾能力還未驗(yàn)證，臨床上應(yīng)避免中、重度溶血對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響。

在方法學(xué)平行比對(duì)試驗(yàn)中，試劑A與試劑B(電化學(xué)發(fā)光法)有較好相關(guān)性，其檢測(cè)結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法等效，而線性范圍高于電化學(xué)發(fā)光法(電化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)范圍為0.1～500 ng/mL，試劑A為0.1～1 000.0 ng/mL)。同時(shí)，試劑A可報(bào)告范圍為0.1～2000.0 ng/mL，高于電化學(xué)發(fā)光法的0.1～1000.0 ng/mL，表明該試劑盒相較于電化學(xué)發(fā)光法不僅有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，部分指標(biāo)性能更優(yōu)于羅氏，有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Maeda Y,Segawa Y,Takigawa N,et al.Clinical usefulness of serum cytokeratin 19 fragment as a tumor marker for lung cancer[J].Internal Medicine,1996,35(10):764-771.

[2]Stieber P,Hasholzner U,Bodenmuller H,et al.CYFRA 21-1.A new marker in lung cancer[J].Cancer,1993,72(3):707-713.

[3]Zhang ZH,Han YW,Liang H,et al.Prognostic value of serum CYFRA21-1 and CEA for non-small-cell lung cancer[J].Cancer Medicine,2015,4(11):1633-1638.

[4]Zhu WQ,Yu JM,Sun XD,et al.Serum CYFRA21-1 as a prognostic marker for patients with undifferentiated nasopharyngeal carcinoma[J].Biomarkers,2010,15(7):602-607.

[5]Song XM,Wang SZ,Wang ZJ,et al.Serum CYFRA21-1 as an effective tumor biomarker for patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Neoplasma,2015,62(1):124-129.

[6]Kuang LI,Song WJ,Qing HM,et al.CYFRA21-1 levels could be a biomarker for bladder cancer:a meta-analysis[J].Genetics and Molecular Research,2015,14(2):3921-3931.

[7]Huang YL,Chen J,Yan W,et al.Diagnostic accuracy of cytokeratin-19 fragment(CYFRA 21-1)for bladder cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Tumour Biology,2015,36(5):3137-3145.

[8]葉輝銘,林永志,張忠英.電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)尿細(xì)胞角蛋白19及其在膀胱癌診斷中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2005,20(6):533-535.

[9]Zhang J,Zhu Z,Liu Y,et al.Diagnostic value of multiple tumor markers for patients with esophageal carcinoma[J].PloS One,2015,10(2):e0116951.

[10]CLSI.EP6-A:Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2003.

[11]CLSI.EP9-A2:Method comparison and bias estimation using patient samples[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2002.

[12]CLSI.EP5-A:Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2004.

[13]CLSI.EP7-A:Interference testing in clinical chemistry[S].Wayne,PA,USA:CLSI,1986.

廈門(mén)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助項(xiàng)目(3502Z20130006)；福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011D018)?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.031

A

1673-4130(2016)22-3177-04

2016-05-21

2016-08-14)