丁麗玉，張丹，許瑩，胡佳亮，吳飛,

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，a.藥劑科，b.內(nèi)分泌科，上海 200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué),a.中藥學(xué)院，b.中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203)

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3個(gè)指標(biāo)性成分用于監(jiān)控芪貞降糖顆粒濃縮工藝的研究

丁麗玉1a，張丹1b，許瑩2a，胡佳亮2b，吳飛2a,2b

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，a.藥劑科，b.內(nèi)分泌科，上海 200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué),a.中藥學(xué)院，b.中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203)

目的 探索3個(gè)主要成分作為指標(biāo)監(jiān)控芪貞降糖顆粒濃縮工藝穩(wěn)定性的可行性。方法 選擇枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷3個(gè)主要成分作為高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)指標(biāo)，分別在常壓和減壓條件下進(jìn)行芪貞降糖顆粒提取液的濃縮，測(cè)定不同溫度下不同時(shí)間點(diǎn)樣品中指標(biāo)性成分的含量變化情況，系統(tǒng)考察其熱穩(wěn)定性規(guī)律，用于濃縮工藝的參數(shù)確定。結(jié)果 常壓和減壓條件下經(jīng)過(guò)8 h濃縮后，枸櫞酸在溫度60～80 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，90 ℃條件下轉(zhuǎn)移率下降約15%。常壓條件下經(jīng)過(guò)8 h濃縮，特女貞苷在溫度60～80 ℃范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移率下降不超過(guò)13%，在90 ℃條件下轉(zhuǎn)移率下降25%；減壓條件下經(jīng)過(guò)8 h濃縮，特女貞苷在溫度60～80 ℃范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移率下降不超過(guò)11%，在90 ℃條件下轉(zhuǎn)移率下降約20%。常壓和減壓條件下經(jīng)過(guò)8 h濃縮后，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在60～90 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。因此，芪貞降糖顆粒的常壓和減壓濃縮溫度均應(yīng)控制不超過(guò)80 ℃。3批中試放大試驗(yàn)均驗(yàn)證了以上規(guī)律和工藝參數(shù)的可行穩(wěn)定。結(jié)論 以枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性作為指標(biāo)得到的濃縮工藝參數(shù)，可用于芪貞降糖顆粒的制劑工藝質(zhì)量控制。

芪貞降糖顆粒；濃縮；穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)移率；枸櫞酸；特女貞苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

對(duì)于中藥制劑來(lái)說(shuō)，質(zhì)量控制體系不僅應(yīng)包括通過(guò)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的指標(biāo)性成分的含量測(cè)定對(duì)制劑終端質(zhì)量進(jìn)行控制，還需要靠監(jiān)督投料、控制生產(chǎn)工藝的辦法控制質(zhì)量[1]。近年來(lái)中藥制劑工藝控制領(lǐng)域已有越來(lái)越多的研究著眼于從控制制劑過(guò)程來(lái)保證終產(chǎn)品的質(zhì)量[2-3]，主要著眼于熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、與質(zhì)量關(guān)鍵屬性相關(guān)的指標(biāo)性活性成分[4]。

芪貞降糖方由烏梅、靈芝、黃芪和女貞子4味中藥組成，長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用表明其在改善患者胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖代謝等方面療效顯著[5-10]。在將之開發(fā)為顆粒劑的研究中，前期已經(jīng)進(jìn)行了正交工藝優(yōu)選其提取工藝[11]。本研究以處方中的3個(gè)水溶性良好的成分為指標(biāo)，考察其在常壓和減壓濃縮工藝條件下的熱穩(wěn)定性規(guī)律，用于芪貞降糖顆粒的制備工藝確定和工藝穩(wěn)定性的控制。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，Kromasil 100-5C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，F(xiàn)A2104N型電子天平(0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，TE214S型電子天平(0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，XP205型電子天平(0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司),R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，PTHW型電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，TGL-18C型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 黃芪(批號(hào):141210，產(chǎn)地甘肅)，制烏梅(批號(hào):140913，產(chǎn)地浙江)，制女貞子(批號(hào):141125，產(chǎn)地湖南)，靈芝(批號(hào):141105，產(chǎn)地山東)，均購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司。

枸櫞酸(批號(hào):100396-201302)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào):111920-201102)，特女貞苷對(duì)照品(批號(hào):111926-201404)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法 按照已建立的高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定[11]。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成濃度為0.529 0、0.252 0、0.050 2 g·L-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取濃縮液樣品，16 000 r·min-1下高速離心10 min，取上清液，即得。

2.2 濃縮穩(wěn)定性研究 前期通過(guò)正交試驗(yàn)確定了芪貞降糖顆粒的提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次提取1.5 h。按照提取工藝制備1倍處方量的提取液，供穩(wěn)定性研究使用[11]。

2.2.1 常壓濃縮穩(wěn)定性研究 將3次提取液合并混勻，量取800 mL提取液8份，置于燒杯中，密封，分別置于60、70、80、90 ℃恒溫水浴中保溫，每個(gè)溫度平行處理2份，定時(shí)取樣(取樣前以水補(bǔ)足總體積)，共考察8 h，即時(shí)間點(diǎn)分別為0、1、2、3、4、6和8 h。按照“2.1”項(xiàng)下操作，分別測(cè)定樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率，3個(gè)指標(biāo)成分的常壓濃縮8 h穩(wěn)定性結(jié)果分別見圖1～3。

圖1 枸櫞酸常壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

圖2 特女貞苷常壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

圖3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷常壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

由圖1可見，在溫度不高于80 ℃時(shí)，經(jīng)過(guò)8 h常壓濃縮后枸櫞酸含量保持穩(wěn)定，而在90 ℃條件下，轉(zhuǎn)移率下降15%。由圖2可見，特女貞苷的轉(zhuǎn)移率隨濃縮時(shí)間不斷下降：經(jīng)過(guò)8 h常壓濃縮后，在60 ℃和70 ℃條件下下降均不超過(guò)5%，下降趨勢(shì)較緩，而在80 ℃和90 ℃條件下，分別下降13%和25%。由圖3可見，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在常壓濃縮溫度60～90 ℃之間保持穩(wěn)定，隨濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移率未有下降，穩(wěn)定性良好。

2.2.2 減壓濃縮穩(wěn)定性研究 用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置模擬提取液在生產(chǎn)過(guò)程中的減壓濃縮狀態(tài)[11]。將3次提取液合并混勻，量取800 mL提取液8份置于圓底燒瓶中，分別置于60、70、80、90 ℃的旋蒸減壓濃縮，每個(gè)溫度平行處理2份，定時(shí)取樣(取樣前將餾出液補(bǔ)回樣品溶液并混勻，以水補(bǔ)足總體積取樣)，共考察8 h，即時(shí)間點(diǎn)分別為0、1、2、3、4、6和8 h。按照“2.1”項(xiàng)下操作，分別測(cè)定樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率，3個(gè)指標(biāo)成分的減壓濃縮8 h穩(wěn)定性結(jié)果分別見圖4～6。

圖4 枸櫞酸減壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

圖5 特女貞苷減壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

圖6 毛蕊異黃酮葡萄糖苷減壓濃縮工藝熱穩(wěn)定性曲線

由圖4可見，不高于80 ℃時(shí)，枸櫞酸經(jīng)過(guò)8 h減壓濃縮后含量相對(duì)穩(wěn)定，90 ℃條件下，轉(zhuǎn)移率下降15%。由圖5可見，特女貞苷的轉(zhuǎn)移率隨時(shí)間溫度變化：經(jīng)過(guò)8 h減壓濃縮后，在60 ℃、70 ℃和80 ℃條件下下降趨勢(shì)較緩，轉(zhuǎn)移率分別下降3%、5%和11%，90 ℃條件下，轉(zhuǎn)移率下降約20%。由圖6可見，在60～90 ℃的減壓濃縮溫度范圍內(nèi)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量未隨時(shí)間下降，穩(wěn)定性良好。

2.3 濃縮穩(wěn)定性研究結(jié)論 經(jīng)過(guò)以上穩(wěn)定性研究可知，芪貞降糖顆粒的3個(gè)指標(biāo)性活性成分中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的穩(wěn)定性最佳，在60～90 ℃范圍內(nèi)，在常壓和減壓濃縮條件下，8 h內(nèi)均保持基本穩(wěn)定。在常壓和減壓濃縮條件下，枸櫞酸在60～80 ℃范圍內(nèi)能保持基本穩(wěn)定，而90 ℃下則穩(wěn)定性不佳。在常壓和減壓濃縮條件下，特女貞苷隨著溫度的升高穩(wěn)定性變差，在60～80 ℃范圍內(nèi)經(jīng)過(guò)8 h濃縮后轉(zhuǎn)移率均下降不大，而90 ℃下則穩(wěn)定性不佳，所以常壓和減壓濃縮溫度均不宜超過(guò)80 ℃。為保證以上3個(gè)指標(biāo)成分尤其是熱敏性成分特女貞苷的轉(zhuǎn)移率，故在芪貞降糖顆粒濃縮過(guò)程中溫度須控制不超過(guò)80 ℃。將以上參數(shù)用于中試放大研究，以驗(yàn)證此結(jié)論的可行性。3批中試產(chǎn)品的濃縮轉(zhuǎn)移率見表1。3批次中試生產(chǎn)的減壓濃縮溫度均控制在80 ℃以下，濃縮過(guò)程經(jīng)歷時(shí)長(zhǎng)約12～18 h，從表1可以發(fā)現(xiàn)3個(gè)指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率下降趨勢(shì)一致，下降率不高。歷經(jīng)超過(guò)12 h的濃縮步驟后3個(gè)成分較穩(wěn)定，驗(yàn)證此減壓濃縮工藝可以應(yīng)用于芪貞降糖顆粒的中試放大生產(chǎn)。

表1 中試產(chǎn)品濃縮工藝中3個(gè)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率結(jié)果/%

3 討論

中藥制劑的制備過(guò)程包括提取、分離、濃縮、干燥和成型等階段，多數(shù)需經(jīng)水、醇溶劑的熱處理，各階段都可能發(fā)生一些物理、化學(xué)變化，導(dǎo)致制劑中有效成分的降解和損失[12]。在制劑各環(huán)節(jié)中，由于濃縮環(huán)節(jié)對(duì)工藝參數(shù)的穩(wěn)定性控制要求最高，且相對(duì)耗時(shí)最長(zhǎng)，所以此環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制最為重要[2]。

傳統(tǒng)思路認(rèn)為，濃縮階段所選擇的指標(biāo)性成分應(yīng)為復(fù)方中君藥或臣藥所含的與臨床適應(yīng)證、提取工藝相關(guān)的指標(biāo)性成分[13]，且盡量選擇定量控制更加準(zhǔn)確的測(cè)定方法用于監(jiān)測(cè)。所以本研究初步選擇君藥烏梅、佐使藥黃芪和女貞子的指標(biāo)成分作為監(jiān)控指標(biāo)，以HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定，而不選擇臣藥?kù)`芝藥材所對(duì)應(yīng)的多糖含量(UV法測(cè)定)作為監(jiān)控指標(biāo)。以此考察濃縮過(guò)程中藥液的穩(wěn)定性，對(duì)芪貞降糖顆粒的濃縮工藝過(guò)程進(jìn)行有效的控制。

從目前生產(chǎn)企業(yè)使用的設(shè)備情況來(lái)看，藥液濃縮一般都是在減壓狀態(tài)下進(jìn)行。但是在一些藥品標(biāo)準(zhǔn)中，藥液的濃縮卻顯示是在常壓狀態(tài)下進(jìn)行[14]。所以本研究在設(shè)計(jì)的時(shí)候就將常壓穩(wěn)定性納入考察的范圍，以利于全面探索3個(gè)化合物的熱穩(wěn)定性規(guī)律。

本研究分別在減壓和常壓條件下，系統(tǒng)全面地考察了烏梅、黃芪和女貞子3味常用中藥的指標(biāo)性成分枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和特女貞苷的熱穩(wěn)定性規(guī)律，指出了水提取溶液中3個(gè)成分的濃縮熱穩(wěn)定性規(guī)律，不僅用于本處方的工藝控制，還可為其他采用類似工藝的處方中此類成分的研究提供重要的借鑒。但也要考慮到，化學(xué)成分的熱穩(wěn)定性規(guī)律一方面取決于化合物本身的結(jié)構(gòu)，另一方面也受溶液環(huán)境和其他共存成分的影響，本研究所得出的3個(gè)成分的熱穩(wěn)定性規(guī)律在某種程度上與本處方組成和提取工藝密切相關(guān)。

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Application of three main components to indicate the reliability of Qizhenjiangtang Granules concentration process

DING Liyu1a,ZHANG Dan1b,XU Ying2,et al

(1a.DepartmentofPharmacy,1b.DepartmentofEndocrinology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.CollegeofChineseMaterialMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To explore the stability of Qizhenjiangtang Granules concentration process by using 3 main components as the index.Methods Citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-glucoside were chosen as the detection indicators to display the thermal stability during the concentration process.The concentrated solution were prepared under both the atmospheric and vacuum conditions.The concentration of the 3 components were determined at different time points and at different bath temperature,so as to select the suitable process parameter in this step.Results In both atmospheric and vacuum conditions,citric acid was stable between 60 ℃ and 80 ℃ and the transfer rate decreased by 15% at 90 ℃ in 8 hours.Calycosin-7-glucoside kept stable for 8 hours between 60 ℃ and 90 ℃.In the atmospheric condition,the transfer rate of specnuezhenide decreased by no more than 13% between 60 ℃ and 80 ℃ while it decreased by 25% at 90 ℃.In the vacuum condition,the transfer rate of specnuezhenide decreased by no more than 11% between 60 ℃ and 80 ℃ while it decreased by about 20% at 90 ℃.So the concentration temperature should be controlled no more than 80 ℃.The thermal stability of the 3 components and the optimal concentration parameters were validated by 3 batches of product via pilot magnification.Conclusions The parameters obtained from the stability study of citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-glucoside are suitable for the quality control of Qizhenjiangtang Granules concentration process.

Qizhenjiangtang Granules;Concentration;Stability;Transfer rate;Citric acid;Specnuezhenide;Calycosin-7-glucoside

上海市衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑能力提升項(xiàng)目(ZY3-JSFC-2-2017);上海市衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目資助(ZY3-CCCX-3-5001)；上海市科委平臺(tái)資助項(xiàng)目(15DZ2292000)

吳飛，男，副研究員，研究方向：中藥制劑分析和藥物分析，E-mail:a1983d3891h@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.009

2016-05-04，

2016-07-11)