郭肖穎，王磊，李敏，王斌，趙竑緋，李虹穎，徐文靜，施六林,*

1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥230031

2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所，合肥230031

基于秀麗隱桿線蟲的微量水樣環(huán)境毒理學(xué)研究

郭肖穎1，王磊1，李敏2，王斌1，趙竑緋1，李虹穎2，徐文靜1，施六林1,*

1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥230031

2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所，合肥230031

目前,環(huán)境水樣個體水平的毒理學(xué)檢測成本較高、耗時長,且檢測后的水樣若處理不當(dāng)易造成環(huán)境的二次污染。通過使用易于培養(yǎng)和觀察、個體微小的模式生物—秀麗隱桿線蟲作為實驗對象,利用毛細(xì)玻璃管的虹吸原理將線蟲暴露于微量的環(huán)境水樣進(jìn)行染毒培養(yǎng),實現(xiàn)微量水樣在個體水平的毒理學(xué)評價。為了驗證該方法的可行性,檢測了暴露組線蟲與對照組線蟲的生殖腺細(xì)胞損傷水平、活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生量、氧化應(yīng)激水平、脫氧核糖核酸(DNA)損傷水平等生物終點的差異性。研究結(jié)果有助于為微量環(huán)境水樣在個體水平的毒理學(xué)分析提供一種快速、可行、廉價的評價手段。

秀麗隱桿線蟲；微量環(huán)境水樣；毒理學(xué)評價；評價體系

個體水平的毒理學(xué)分析是評價復(fù)雜污染物共存的環(huán)境水體綜合生物效應(yīng)的有效手段之一,并有利于進(jìn)一步解析環(huán)境水體生物毒性的內(nèi)在作用機(jī)制[1-3]。底棲動物、魚類、鳥類、大型蚤類等動物模型是水環(huán)境生物毒性評價常用的指示生物[4-6],而由于這些實驗動物發(fā)育周期較長,使得環(huán)境水體毒理學(xué)評價的耗時長,短期內(nèi)很難獲得大量具有統(tǒng)計意義的實驗結(jié)果；另外,這些實驗動物個體相對較大,培養(yǎng)條件亦較為復(fù)雜,以其為模型進(jìn)行環(huán)境水樣生物毒性評價所需的實驗成本相對較高；再者,較大的實驗動物模型暴露所需的環(huán)境水樣量亦較多,水樣的采集、運(yùn)輸、保存及后處理成本亦隨之增加,并且,若供試水樣處理不當(dāng),直接或間接地排放到周邊的水域,還會造成二次污染[7]。因此,選擇適宜的、個體微小的實驗動物模型,開展微量環(huán)境水樣的生物毒性評價,發(fā)展快速、實時、綜合的評價方法,減少實驗成本,避免二次污染是當(dāng)前環(huán)境水體生物毒性評價的重要課題,亦是本研究的關(guān)鍵所在。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C.elegans)因其蟲體微小且通體透明、生命周期短、易于培養(yǎng)、遺傳與發(fā)育背景清楚、操作簡單等優(yōu)點使其成為水環(huán)境生物毒性研究的一種理想模式動物,并被廣泛應(yīng)用于工業(yè)廢水、城市廢水、重金屬廢水等的水質(zhì)安全評價中[8-10]。秀麗隱桿線蟲用于水環(huán)境生物毒性評價的主要指標(biāo)包括生理、生化和行為3個方面,其中生理指標(biāo)主要應(yīng)用于致死性和衰老的研究,包括對生殖、發(fā)育和繁殖等生理現(xiàn)象檢測；行為指標(biāo)主要通過對線蟲運(yùn)動、學(xué)習(xí)、記憶等行為的監(jiān)測剖析水環(huán)境潛在的神經(jīng)毒性；生化標(biāo)志物主要包括蛋白、酶活性及脫氧核糖核酸(DNA)等生物大分子,具有更高的靈敏度,是從分子水平上解析水環(huán)境作用于生物體的毒性機(jī)制[11-14]。目前,應(yīng)用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行水環(huán)境生物安全性評價已得到一定程度的肯定,2009年國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)頒布了將秀麗隱桿線蟲用于水體毒理學(xué)評價的標(biāo)準(zhǔn)化指南。本文以秀麗隱桿線蟲作為實驗動物模型,以毛細(xì)玻璃管作為暴露體系,發(fā)展微量環(huán)境水樣的生物毒性評價方法。通過虹吸原理將線蟲暴露于透明毛細(xì)玻璃管內(nèi)的微量環(huán)境水樣進(jìn)行染毒培養(yǎng),易于實現(xiàn)毒性效應(yīng)的實時監(jiān)測。基于線蟲低氧耐受能力強(qiáng)的優(yōu)勢,利用凝膠將毛細(xì)玻璃管兩端密封,有效減少由于水分蒸發(fā)造成的實驗誤差。并通過檢測暴露于以雙氧水為代表的環(huán)境水樣中線蟲生殖系細(xì)胞凋亡、氧化損傷和DNA損傷等多個生物終點的變化,進(jìn)一步驗證了該環(huán)境水樣暴露方法的可行性。結(jié)果表明,基于秀麗隱桿線蟲的微量水樣暴露檢測方法能夠在個體生物水平上實現(xiàn)微量環(huán)境水樣毒理學(xué)效應(yīng)的實時監(jiān)測,且該方法簡單、快速、廉價。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗所用秀麗隱桿線蟲品系為N2 Bristol野生型,CF1553:sod-3;muIs84,muIs84基因型表示在sod-3基因上融合了GFP表達(dá)蛋白,WS1433:hus-1 (op241)I;unc-119(ed3)III;opIs34,opIs34基因型表示在hus-1基因上融合了GFP表達(dá)蛋白,線蟲品系由美國NIH資助的國際線蟲種質(zhì)中心(CGC)贈送。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲培養(yǎng)

線蟲的培養(yǎng)方法參照Brenner的文獻(xiàn)[15]。將妊娠期線蟲的卵取出,并進(jìn)行24 h的同步化處理, 95%以上的孵化成L1期幼蟲時,接入NGM培養(yǎng)基,20℃恒溫條件下將線蟲培養(yǎng)至所需的時期。

1.2.2 環(huán)境水樣的處理及暴露

將環(huán)境水樣通過0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行滅菌處理,將發(fā)育至早期成蟲的線蟲挑至過濾后的水樣中,添加2%的E.coliOP50濃縮菌作為線蟲的食物,并通過虹吸作用使線蟲和水樣同時進(jìn)入到毛細(xì)玻璃管中。該毛細(xì)玻璃管是內(nèi)徑75μm,外徑100μm的圓柱形物體,1.5～2.0μL體積的線蟲和水樣混合液可以填充毛細(xì)管的長度為33.9～45.3 mm,一根毛細(xì)管可培養(yǎng)線蟲20～30條(附圖1)。在毛細(xì)玻璃管兩端使用2%的瓊脂進(jìn)行密封,進(jìn)行線蟲在微量環(huán)境水樣的暴露處理。本實驗以含8.84μmol·L-1H2O2的環(huán)境水樣為代表,進(jìn)行微量水樣毒理學(xué)方法的研究和相關(guān)毒理學(xué)終點的檢測。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡的測定依據(jù)Kelly等[16]的修改,并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在毛細(xì)玻璃管中添加吖啶橙染色液,使其終濃度為50μg·mL-1,避光染色1～1.5 h。染色后將線蟲置于含有OP50的35 mm NGM培養(yǎng)皿上,在20℃的培養(yǎng)箱中恢復(fù)20～40 min,選取30～40條線蟲置于載玻片上的20 mmol·L-1疊氮鈉溶液(NaN3)液滴中,待蟲子全部麻醉后置于DP70熒光顯微鏡下觀察,凋亡的細(xì)胞呈亮綠色或橙黃色,這是DNA片斷化的一個重要標(biāo)志,而未凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色[16]。

1.2.4 ROS含量的檢測[17]

在毛細(xì)玻璃管中加入CM-H2DCFDA熒光探針,使其終濃度為1μmol·L-1,20℃培養(yǎng)30 min,將處理后的線蟲取出,于2%瓊脂上以60μg·mL-1左旋咪唑麻醉,在Leica TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡上,以488 nm激發(fā)波長和510 nm發(fā)射波長,對每一條蟲子進(jìn)行拍照,使用Image pro plus 6.0進(jìn)行圖像處理,記錄線蟲身體的綠色熒光強(qiáng)度,作為ROS的相對值。

1.2.5 SOD-3表達(dá)量的檢測[18]

SOD-3是細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶,在線粒體附近發(fā)揮其調(diào)控氧化壓力的作用。通過使用sod-3:: gfp的線蟲品系CF1553,可以觀察sod-3在線蟲體內(nèi)的分布和表達(dá)量的變化。本實驗將環(huán)境水樣暴露組和對照組CF1553品系的線蟲分別移至滴有200μmol·L-1NaN3麻醉劑的載破片上,待線蟲麻醉后,使用488 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā),觀察線蟲體內(nèi)綠色熒光蛋白的亮度和分布變化,并對每條線蟲進(jìn)行獨立拍照,最后使用Image-Pro?Plus version 6.0軟件對每個蟲體的SOD-3::GFP表達(dá)進(jìn)行定量。

1.2.6 DNA損傷水平的檢測

HUS-1是DNA損傷檢測點蛋白,正常情況下呈彌散狀分散在細(xì)胞質(zhì)中[19]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時,HUS-1會轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,對損傷的DNA位點進(jìn)行修復(fù)[19]。WS1433是hus-1::gfp的轉(zhuǎn)基因線蟲品系,通過觀察GFP熒光蛋白的分布情況,即可觀測到HUS-1蛋白在線蟲體內(nèi)的位置,進(jìn)而反映DNA損傷的情況。本實驗將環(huán)境水樣暴露組和對照組WS1433品系的線蟲分別移至滴有200μmol·L-1NaN3麻醉劑的載玻片上,待線蟲麻醉后對每條線蟲進(jìn)行獨立拍照,重點針對生殖腺細(xì)胞的細(xì)胞核位置進(jìn)行拍照。使用488 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā),觀察線蟲體內(nèi)綠色熒光蛋白的分布變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用Orign 8.0軟件分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示,以Turkey多重比較檢驗不同水樣的毒性效應(yīng),利用雙尾t檢驗檢測線蟲環(huán)境水樣暴露所導(dǎo)致的損傷差異,顯著性水平為P＜0.05。文章中熒光強(qiáng)度的定量均由Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計。所有實驗結(jié)果均由三次以上獨立實驗完成。

2 結(jié)果(Results)

2.1 基于秀麗隱桿線蟲的微量環(huán)境水樣毒理學(xué)評價方法研究

圖1 毛細(xì)管微量水樣的線蟲暴露過程Fig.1 Exposure process ofC.elegansto trace water in capillary

基于秀麗隱桿線蟲的微量環(huán)境水樣毒理學(xué)評價方法實驗流程如如圖1所示。采用毛細(xì)玻璃管作為微量環(huán)境水樣的暴露體系是由于玻璃的透明特性,可以實現(xiàn)暴露于環(huán)境水樣中線蟲生長發(fā)育、運(yùn)動、存活等多個生物終點的實時監(jiān)測,并且在利用熒光染料在進(jìn)行蟲體組織的染色過程中,亦可實時觀察染色效果。而使用瓊脂糖進(jìn)行毛細(xì)玻璃管兩端的密封,其主要目的在于減少由于水分的蒸發(fā)改變環(huán)境水樣中有毒成分濃度變化的可能性,從而確保試驗的準(zhǔn)確性和精確性。再者,線蟲成蟲的長度僅為1 mm,線蟲的身體直徑為40～60μm,所選擇的毛細(xì)玻璃管尺寸保證了線蟲可進(jìn)入毛細(xì)管中且不會造成重疊或擠壓。同時線蟲又是低氧耐受能力很強(qiáng)的生物,24 h乏氧環(huán)境可保證存活率在95%以上。因此,以內(nèi)徑75μm,外徑100μm的毛細(xì)玻璃管為暴露體系,以瓊脂糖密封保證水分不流失,可以很好地構(gòu)建基于秀麗隱桿線蟲的微量水樣暴露體系,順利完成環(huán)境水樣的線蟲暴露過程。

為了驗證該暴露體系和方法的可行性和毒理學(xué)效應(yīng)評價的準(zhǔn)確性,文章以8.84μmol·L-1 H2O2的環(huán)境水樣為代表,以線蟲的生殖細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)量、氧化損傷以及DNA損傷為生物檢測終點,進(jìn)行了以下幾個方面的驗證試驗。

2.2 基于秀麗隱桿線蟲的微量環(huán)境水樣毒理學(xué)評價體系的生殖腺細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡是機(jī)體生命活動的需要。正常培養(yǎng)條件下,在固定的時間點,線蟲的每條生殖腺約有2、3個細(xì)胞會進(jìn)入生理性的凋亡過程[20]。同時,線蟲生殖細(xì)胞對外界環(huán)境脅迫非常敏感,在遭遇內(nèi)外環(huán)境脅迫條件下,其生殖腺除了具有生理性的細(xì)胞凋亡,還表現(xiàn)出明顯的脅迫誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡[21]。由圖2A和B可見,野生型線蟲暴露于毛細(xì)管微量水樣體系中,其生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目約為2～3個,與實驗室培養(yǎng)條件下的野生型線蟲品系的正常凋亡數(shù)目接近[20]。此結(jié)果表明本文所采用的毛細(xì)管微量水樣暴露體系并未對線蟲的生殖腺細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)造成顯著性影響。而通過觀察8.84μmol·L-1的雙氧水實驗組的生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目可以看出,環(huán)境水樣處理組引起了線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目的顯著性升高,表明該環(huán)境水樣誘導(dǎo)了線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目的顯著增加,該結(jié)果與實驗室常規(guī)培養(yǎng)條件下環(huán)境水樣誘導(dǎo)線蟲的生殖腺凋亡數(shù)目接近,因而,上述研究結(jié)果表明毛細(xì)管微量水樣暴露體系可用于測量環(huán)境水樣造成的線蟲的生殖腺細(xì)胞凋亡水平變化。

圖2 微量水樣誘導(dǎo)的線蟲生殖細(xì)胞凋亡注:A)同步化生長的早期成蟲暴露于不同的評價體系,24 h后測定其生殖細(xì)胞死亡數(shù)目；B)熒光顯微鏡下觀察的凋亡細(xì)胞(紅色箭頭所指的亮點)。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n≥20,*表示與對照具有顯著差異,P＜0.05。Fig.2 Trace water induced germ cell apoptosis inC.elegansNote:A)Synchronized young adult worms were cultivated by two methods for 24 h,and germ cell corpses were counted after AO staining. B)Apoptotic germ cells were observed under an Olympus IX71 fluorescence microscope(Olympus,Tokyo,Japan). All values are represented by means±SE;n≥20.* represents statistical significance(P＜0.05)as indicated.

2.3 基于秀麗隱桿線蟲的微量環(huán)境水樣毒理學(xué)評價體系的氧化損傷檢測

活性氧是造成細(xì)胞損傷的主要原因之一。細(xì)胞內(nèi)的活性氧基團(tuán)可以通過氧化還原反應(yīng)破壞細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等重要的生物活性分子,從而影響細(xì)胞的新陳代謝速率,進(jìn)而影響機(jī)體的正常生理功能[22]。而氧化應(yīng)激是生物體應(yīng)對活性氧分子大量產(chǎn)生時的一種保護(hù)機(jī)制。當(dāng)生物體內(nèi)活性氧分子數(shù)量高于正常水平時,機(jī)體通過調(diào)節(jié)能夠分解活性氧分子的酶類的活性和表達(dá)量,來避免過高的活性氧可能造成的損傷[23]。因此,表征機(jī)體的氧自由基水平以及分解活性氧分子的酶的表達(dá)量,能夠在一定程度上反映環(huán)境脅迫造成的氧化損傷。環(huán)境水樣中的許多有毒成分都可造成生物體內(nèi)活性氧水平的升高,如重金屬離子、農(nóng)藥的有機(jī)成分、自來水處理中的氯離子等。檢測環(huán)境水樣對生命個體活性氧水平的影響,對于評價環(huán)境水樣的毒理學(xué)效應(yīng),具有重要意義。本實驗首先通過使用活性氧分子的特異性化學(xué)探針進(jìn)行熒光標(biāo)記,對線蟲體內(nèi)的活性氧水平進(jìn)行示蹤和定量,從而在個體水平研究水樣對機(jī)體各器官組織的活性氧水平的影響。實驗分別應(yīng)用線蟲微量環(huán)境水樣暴露新體系和常規(guī)試驗方法開展的ROS水平的檢測,圖3A和B的研究結(jié)果顯示,實驗組線蟲經(jīng)過2種方法的暴露處理后,比對照組線蟲的活性氧水平均具有顯著性的提高,并達(dá)到顯著性的差異(P＜0.05)。該結(jié)果表明毛細(xì)管微量水樣暴露體系能夠真實地反映環(huán)境水樣造成秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平的變化。進(jìn)而,通過表征線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶SOD-3的表達(dá)進(jìn)一步檢查了環(huán)境水樣作用于機(jī)體的氧化損傷。如圖4A和B所示,應(yīng)用新的染毒培養(yǎng)體系的處理中,在對照組線蟲體內(nèi),SOD-3::GFP的表達(dá)主要集中在線蟲的頭部和尾部；而在環(huán)境水樣處理后的線蟲體內(nèi),SOD-3:: GFP除了在頭部和尾部表達(dá)外,還集中在腸道組織表達(dá),生殖腺及卵細(xì)胞中SOD-3::GFP的表達(dá)亦有不同程度的提升,因而,線蟲體內(nèi)SOD-3::GFP的表達(dá)變成了全身性的,說明微量的以雙氧水為代表的環(huán)境水樣顯著提升了線蟲體內(nèi)超氧化物岐化酶SOD-3的表達(dá)。在常規(guī)方法的實驗中,我們亦發(fā)現(xiàn)了基本一致的研究結(jié)果,同時新方法與常規(guī)方法相比,染毒培養(yǎng)后線蟲體內(nèi)的SOD-3::GFP表達(dá)水平未發(fā)生顯著性的差異(圖4A),也就是說,本文所提微量環(huán)境水樣的暴露方法未改變常規(guī)試驗方法獲得的實驗結(jié)果,因此可以利用該體系進(jìn)行線蟲機(jī)體響應(yīng)微量環(huán)境水樣氧化應(yīng)激的檢測。

圖3 微量水樣顯著提高線蟲體內(nèi)ROS的表達(dá)水平A)同步化生長早期成蟲暴露于不同的評價體系,24 h后測定ROS產(chǎn)量,環(huán)境水樣暴露的線蟲個體ROS表達(dá)顯著上調(diào)；B)熒光顯微鏡下觀察的ROS表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n≥20,*表示與對照具有顯著差異,P＜0.05。Fig.3 Trace water enhanced the ROS production inC.elegansA)Synchronized young adult worms were cultivated by two methods for 24 h,and the relative ROS production were measured using Image pro plus 6.0. B)The ROS level was observed under an Olympus IX71 fluorescence microscope(Olympus,Tokyo,Japan).All values are represented by means±SE;n≥20.* represents statistical significance(P＜0.05)as indicated.

圖4 微量水樣顯著提高線蟲體內(nèi)SOD-3的表達(dá)水平A)同步化生長的早期成蟲暴露于不同的評價體系,24 h后測定ROS產(chǎn)量,環(huán)境水樣暴露的線蟲個體ROS表達(dá)顯著上調(diào)；B)熒光顯微鏡下觀察的ROS表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n≥20,*表示與對照具有顯著差異,P＜0.05。Fig.4 Trace water enhanced the SOD-3 level inC.elegansA)Synchronized young adult worms were cultivated by two methods for 24 h,and the relative SOD-3 levels were measured using Image pro plus 6.0. B)The SOD-3 level was observed under an Olympus IX71 fluorescence microscope(Olympus,Tokyo,Japan).All values are represented by means±SE;n≥20.* represents statistical significance(P＜0.05)as indicated.

圖5 微量水樣誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞HUS-1蛋白發(fā)生點聚集A)同步化生長的早期成蟲暴露于不同的評價體系,24 h后通過統(tǒng)計40個有絲分裂細(xì)胞中的HUS-1::GFP聚集點的進(jìn)行環(huán)境水樣誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞DNA損傷的定量分析。B)熒光顯微下觀察到的HUS-1::GFP聚集點。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n≥10,*表示與對照具有顯著差異,P＜0.05。Fig.5 Trace water caused the significant foci of HUS-1 inC.elegansgerm cellsA)Quantification of HUS-1::GFP foci in the mitotic germ cells after worms were treated for 24 h.Foci were scored in 40 proliferating germ cells. B)HUS-1::GFP foci were observed under an Olympus IX71 fluorescence microscope(Olympus,Tokyo,Japan).All values are represented by means±SE;n≥10.* represents statistical significance(P＜0.05)as indicated.

2.4 基于秀麗隱桿線蟲的微量環(huán)境水樣毒理學(xué)評價體系的線蟲生殖細(xì)胞DNA損傷檢測

DNA損傷反應(yīng)機(jī)制是生物體遭受外界環(huán)境脅迫的一種重要的損傷響應(yīng)方式。當(dāng)細(xì)胞中的DNA損傷感應(yīng)基因檢測到DNA損傷發(fā)生時,將啟動一系列的DNA損傷修復(fù)機(jī)制,而未有效修復(fù)的細(xì)胞將誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生,否則DNA損傷將傳遞至后代,形成遺傳損傷[21]。HUS-1是線蟲DNA損傷修復(fù)的檢驗點蛋白,在線蟲DNA損傷修復(fù)中有不可替代的重要作用。正常情況下,HUS-1在細(xì)胞質(zhì)中均勻分布,而當(dāng)DNA損傷發(fā)生時,HUS-1就從細(xì)胞質(zhì)被募集到細(xì)胞核中,并對DNA損傷的位點進(jìn)行識別和修復(fù)。HUS-1標(biāo)記上GFP熒光蛋白后,細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時,隨著HUS-1的聚集,GFP將呈現(xiàn)點狀的亮綠色,WS1433是當(dāng)前已構(gòu)建的HUS::GFP線蟲品系,常通過對GFP點聚集的檢測和統(tǒng)計,反應(yīng)環(huán)境脅迫造成機(jī)體的DNA損傷[21]?；诖?實驗分別將WS1433線蟲品系通過毛細(xì)玻璃管微量環(huán)境水樣暴露新體系和常規(guī)試驗方法進(jìn)行HUS::GFP點聚集的檢測。圖5A和B的研究結(jié)果顯示,經(jīng)過2種方法的暴露處理后的WS1433線蟲品系,其環(huán)境水樣暴露組線蟲生殖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了明顯的GFP聚集亮點,數(shù)量顯著高于對照組線蟲,并達(dá)到顯著性的差異(P＜0.05)。該結(jié)果表明,毛細(xì)管微量水樣暴露體系可以應(yīng)用于微量水環(huán)境引致線蟲生殖細(xì)胞DNA損傷的檢測,并通過HUS-1的點聚集使得線蟲生殖細(xì)胞DNA損傷發(fā)生的位點可視化,并可進(jìn)行定量分析。

3 討論(Discussion)

環(huán)境水體安全性的生物毒性評價體系較多,而與其他的實驗動物模型相對,線蟲具有其獨特的優(yōu)勢:線蟲個體微小、結(jié)構(gòu)簡單,生物檢測終點多樣,不同的檢測終點均可敏感響應(yīng)環(huán)境水體復(fù)雜的生物毒性效應(yīng),這是實現(xiàn)微量環(huán)境水樣生物毒性檢測的基礎(chǔ)；線蟲通體透明,易于在活體狀態(tài)下實現(xiàn)多種生物檢測終點的實時監(jiān)測；線蟲的遺傳背景清楚,遺傳操作簡便,利于從分子水平解析環(huán)境水體的致毒機(jī)理,并且線蟲40%的基因序列和人類基因組具有同源性,利用線蟲獲得的研究結(jié)果很多可以直接應(yīng)用于高等動物,甚至人類本身[8-10]。應(yīng)用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行環(huán)境水體的安全性評價及生物毒性檢測已逐步獲得肯定,并取得大量的研究成果。但當(dāng)前基于秀麗隱桿線蟲進(jìn)行環(huán)境水樣生物毒性的分析多應(yīng)用塑料培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板進(jìn)行線蟲的染毒培養(yǎng),體系所需的水樣量較大,且水分蒸發(fā)快；塑料制品對水環(huán)境中的部分污染物具有一定的吸附作用,這就可能造成環(huán)境水樣污染物分散的均一性,降低實驗結(jié)果的可比性,增加實驗誤差。本文利用毛細(xì)玻璃管作為環(huán)境水樣的暴露體系,并以瓊脂糖進(jìn)行玻璃管兩端的密封,有效減少了環(huán)境水樣中有毒成分的吸附作用以及水分蒸發(fā)的難題,同時,還有利于在活體狀態(tài)下進(jìn)行多種生長、生殖檢測終點的聯(lián)合監(jiān)測。但本方法亦存在不足之處。由于毛細(xì)玻璃管體積所限,暴露于環(huán)境水樣中的線蟲量約在20～30條,因而本方法不適宜進(jìn)行大量線蟲個體的染毒培養(yǎng)。另外,由于毛細(xì)玻璃管的兩端應(yīng)用瓊脂糖密封,不利于空氣的流通,長期乏氧環(huán)境將影響線蟲正常的生長發(fā)育,因而本方法不適宜進(jìn)行線蟲長時間的染毒處理。

近年來,環(huán)境污染問題受到前所未有的關(guān)注,自然資源的安全是工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品安全的前提和保障,是人類健康的基礎(chǔ)。本研究旨在為水資源生態(tài)環(huán)境生物安全的預(yù)警和評價提供行之有效的技術(shù)方法,盡可能地避免因污染造成的健康風(fēng)險,并為水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和修復(fù)提供新的視角和思路。

[1]高小輝,楊峰峰,何圣兵,等.水質(zhì)的生物毒性檢測方法[J].凈水技術(shù),2012,31(4):49-54 Gao X H,Yang F F,He S B,et al.Testing methods of biological toxicity detection for water quality[J].Water Purification Technology,2012,31(4):49-54(in Chinese)

[2]Wang S C,Geng Z Z,Wang Y,et al.Essential roles ofp53 and MAPK cascades in microcystin-LR-induced germline apoptosis inCaenorhabditis elegans[J].EnvironmentalScience&Technology,2012,46(6):3442-3448

[3]COHIBA project.Innovative Approaches to Chemicals Control of Hazardous Substances,WP3 Final Report[R]. Helsinki:COHIBA project,2011

[4]劉大勝,趙巖,傅瑩,等.工業(yè)廢水排放環(huán)境監(jiān)管中的新手段:魚類急性毒性試驗應(yīng)用[J].環(huán)境保護(hù),2008, 400:50-52

[5]Connon R,Dewhu R,Crane M,et al.Haemperoxidase activity inDaphnia magna:A biomarker for sublethal toxicity assessments of kerosenecont aminated ground water [J].Ecotoxicology,2003,12:387-395

[6]Venkateswara Rao J,Srikanth K,Arepalli S K,et al.Toxic effects of acephate onParamecium caudatumwith special emphasis on morphology,behaviour,and generation time[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,86: 131-137

[7]劉德春,楊定明,鐘國清.高?；瘜W(xué)實驗室廢水的處理技術(shù)研究進(jìn)展[J].科技資訊,2012,17:102

[8]Leung M C K,Williams P L,Benedetto A,et al.Caenorhabditis elegans:An emerging model in biomedical and environmental toxicology[J].Toxicological Sciences, 2008,106(1):5-28

[9]Martinez-Finley E J,Aschner M.Revelations from the nematodeCaenorhabditis eleganson the complex interplay of metal toxicological mechanisms[J].Journal of Toxicology,2011:895236

[10]齊麗娟.秀麗隱桿線蟲在生態(tài)毒理學(xué)評價中應(yīng)用研究進(jìn)展[J].毒理學(xué)雜志,2015,29(1):60-65

[11]Ruan Q L,Ju J J,Li Y H,et al.Chlorpyrifos exposure reduces reproductive capacity owing to a damaging effect on gametogenesis in the nematodeCaenorhabditis elegans [J].Journal of Applied Toxicology,2012,32(7):527-535

[12]Wren J F,Kille P,Spurgeon D J,et al.Application of physiologically based modeling and transcriptomics to probe the systems toxicology of aldicarb forCaenorhabditis elegans(Maupas 1990)[J].Ecotoxicology,2011,20: 397-408

[13]張燕芬,王大勇.利用模式動物秀麗線蟲建立環(huán)境毒物毒性的評估研究體系[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2008,3(4): 313-322 Zhang Y F,Wang D Y.Establishment of toxicity evaluation system using model organism ofCaenorhabditis elegans[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2008,3(4):313-322(in Chinese)

[14]Helmcke K J,Avila D S,Aschner M.Utility ofCaenorhabditis elegansin high throughput neurotoxicological research[J].Neurotoxicology and Teratology,2010,32(1): 62-72

[15]Brenner S.The genetics ofCaenorhabditis elegans[J]. Genetics,1974,77:71–94

[16]Kelly K O,Dernburg A F,Stanfield G M,et al.Caenorhabditis elegans msh-5is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis[J].Genetics,2000,156(2):617-630

[17]Zhu C,Ji C B,Zhang C M,et al.Thelin-4gene controls fat accumulation and longevity inCaenorhabditis elegans [J].International Journal of Molecular Sciences,2010,11: 4814-4825

[18]Ye K,Ji C B,Lu X W,et al.Resveratrol attenuates radiation damage inCaenorhabditis elegansby preventing oxidative stress[J].Journal of Radiation Research,2010,51: 473–479

[19]Hofmann E R,Milstein S,Boulton S J,et al.Caenorhabditis elegansHUS-1 is a DNA damage checkpoint protein required for genome stability and EGL-1-mediated apoptosis[J].Current Biology,2002,12:1908-1918

[20]Gartner et al.Germline survival and apoptosis[DB]. WormBook:TheC.elegansResearch Community,http:// www.wormbook.org

[21]Craig A L,Moser S C,Bailly A P,et al.Methods for studying the DNA damage response in theCaenorhabditis elegansgerm line[J].Methods Cell Biology,2012,107: 321-352

[22]Keshari R S,Verma A,Barthwal M K,et al.Reactive oxygen species-induced activation of ERK and p38 MAPK mediates PMA-induced NETs release from human neutrophils[J].Journal of Cellular Biochemistry,2013,114: 532-540

[23]Okano H.Effects of static magnetic fields in biology: Role of free radicals[J].Frontiers in Bioscience-landmark,2008,13:6106–6125

Environmental Toxicology Study of Trace Water Samples with Caenorhabditis elegans

Guo Xiaoying1,Wang Lei1,Li Min2,Wang Bin1,Zhao Hongfei1,Li Hongying2,Xu Wenjing1,Shi Liulin1,*
1.Institute of Agricultural Engineering,Anhui Academy of Agricultural Science,Hefei 230031,China
2.Institute of Soil and Fertilizer,Anhui Academy of Agricultural Science,Hefei 230031,China

6 May 2015 accepted 6 July 2015

In the present,test methods used for environmental water sample toxicology evaluation on individual scale are usually costly and time consuming,and without appropriate treatment,processed water samples would cause secondary pollution.Toxicology evaluation of trace water samples was realized with a kind of tiny model organisms,Caenorhabditis elegans,as experiment subjects who are easy to cultivate and observe;C.eleganscould be exposed to trace environment water samples through siphon principle of glass capillary for toxicity cultivation.In order to verify the applicability of this evaluation method,biological end points such as germline cell apoptosis, ROS generation,SOD-3 expression and DNA damage ofC.eleganswere measured.This research helps to provide a swift,applicable and economical evaluation method for individual scale toxicology evaluation in trace environmental water sample.

Caenorhabditis elegans;trace environmental water sample;toxicology evaluation;assessment system

2015-05-06 錄用日期:2015-07-06

1673-5897(2016)1-345-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150506002

郭肖穎,王磊,李敏,等.基于秀麗隱桿線蟲的微量水樣環(huán)境毒理學(xué)研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2016,11(1):345-352

Guo X Y,Wang L,Li M,et al.Environmental toxicology study of trace water samples withCaenorhabditis elegans[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(1):345-352(in Chinese)

安徽省科技攻關(guān)計劃項目(1301042115)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(14C1308)；國家自然科學(xué)基金(21407002)；安徽省自然科學(xué)基金(1508085MB39)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項目(14A1009)

郭肖穎(1979-),女,副研究員,研究方向為農(nóng)業(yè)生態(tài)和環(huán)境毒理學(xué),E-mail:gxy2@mail.ustc.edu.cn

),E-mail:shiliulin386@126.com

簡介:施六林(1964—)，男，碩士，研究員，主要研究方向為生態(tài)環(huán)境治理修復(fù)利用等。