呂永梅，張正中，陳　麗，牟韻竹

結(jié)節(jié)性硬化癥的基因突變研究

呂永梅，張正中，陳麗，牟韻竹

目的 研究1例中國漢族人結(jié)節(jié)性硬化癥TSC1和TSC2基因的突變情況。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增該例結(jié)節(jié)性硬化癥患者、家族中的正常人以及100名健康對照者的TSC1和TSC2基因的全部外顯子，并進(jìn)行DNA測序分析。結(jié)果 該例患者TSC1基因第15外顯子存在C.1884-1887delAAAG ( P.Leu628Leu fsX23)移碼突變，引起讀碼框移位，并在其后第23位氨基酸處提前出現(xiàn)終止密碼子TGA。家族中的正常成員及100名無關(guān)正常對照未檢測出該位點(diǎn)突變。結(jié)論 TSC1基因的新缺失突變C.1884-1887del AAAG 可能是導(dǎo)致患者臨床發(fā)病的主要原因，該突變?yōu)樾峦蛔儭?/p>

硬化癥，結(jié)節(jié)性；TSC1基因；TSC2基因；突變

呂永梅

結(jié) 節(jié) 性 硬 化 癥（tuberous sclerosis complex，TSC，OMIM 191100）是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病，國外發(fā)病率為1:5 800～1:10 000[1,2]。TSC臨床表現(xiàn)為全身多種組織和器官出現(xiàn)錯構(gòu)瘤樣增生，主要表現(xiàn)為癲癇、智力發(fā)育遲緩、行為異常、色素減退斑、面部血管纖維瘤、鯊革樣斑、心臟橫紋肌瘤、腎血管肌脂瘤、腎囊腫等[2-4]。導(dǎo)致該病的兩個致病基因分別位于染色體9q34.3上的TSC1基因和16p13.3上的TSC2基因。TSC1基因含有23個外顯子，編碼相對分子量為130 000、由1 164個氨基酸組成的錯構(gòu)瘤蛋白（hamartin）。TSC2基因含有41個編碼外顯子和1個無編碼意義的引導(dǎo)外顯子，編碼相對分子量為190 000、由1 807個氨基酸組成的馬鈴薯球蛋白（tuberin）[5-8]。目前，已檢測出多個突變，對基因型和表型的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)患者多為散發(fā)，TSC2基因突變導(dǎo)致的臨床表型較重[9,10]。 筆者收集了1例散發(fā)TSC患者，為明確診斷并提供遺傳咨詢，應(yīng)用PCR-DNA測序技術(shù)分析該例患者基因突變情況，發(fā)現(xiàn)了1個新突變，并排除父母攜帶有該突變，確定為散發(fā)病例，同時也為遺傳咨詢提供依據(jù)?，F(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報告如下。

1　材料和方法

1.1研究對象

患者在我院門診就診，男，24歲。因面部血管纖維瘤、前額纖維斑14年，腰部鯊革樣斑10年就診?；颊?歲以后面部出現(xiàn)血管纖維瘤，逐漸增多。13歲以后腰骶部有鯊革樣斑。10歲時多次發(fā)生癲癇，近些年明顯減輕，僅偶有短暫發(fā)呆。大專文化。2013年來我院就診，根據(jù)面部皮損確診為TSC。自訴平時孤獨(dú)內(nèi)向，有偏激行為，常會短暫發(fā)呆。無類似疾病的家族史。皮膚科檢查：面中部密集分布針尖至黃豆大小紅色血管纖維瘤，孤立互不融合，腰骶部見鯊革樣斑，右足小趾外側(cè)見甲周纖維瘤（圖1a-1c），其余指（趾）甲周未見異常。全身未見色素減退斑。根據(jù)國際結(jié)節(jié)性硬化協(xié)會（NTSA）1998年重新修訂的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為TSC。

圖1　結(jié)節(jié)性硬化患者顏面、腰骶部及右足皮損

圖2　結(jié)節(jié)性硬化癥患者基因測序圖

1.2外周血采集

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，在取得患者及其家屬知情同意后，抽取患者和其父母的外周靜脈血各3 ml 于2%的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。另提取100名健康人的外周靜脈血備用作為對照。血樣置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將抽取的外周靜脈血2 ml 分離白細(xì)胞后用DNA抽提試劑盒（Amersham公司）抽提基因組DNA。采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，針對TSC1基因和TSC2基因全部外顯子設(shè)計(jì)引物。所有引物均由上海庚思生物科技有限公司合成，引物擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、直接測序均由該公司完成。采用Chromas2.0軟件對測序出的基因序列進(jìn)行對比分析。

2　結(jié)果

經(jīng)過測序，基因序列對比發(fā)現(xiàn)患者TSC1基因的第15外顯子發(fā)生了一缺失突變C.1884 -1887del AAAG（P.Leu628Leu fsX23）（圖2a），即第1884位與1887位堿基之間缺失AAAG 4個堿基，其后密碼子發(fā)生移位，導(dǎo)致在其突變后的第23個氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼子TGA。該突變未見報道，故為新突變?；颊吒改讣?00名無關(guān)正常對照者均未檢測到該位點(diǎn)突變，所以排除了單核苷酸多態(tài)性（SNP）的可能性。

3　討論

TSC 是以錯構(gòu)瘤為主，累及多個系統(tǒng)和器官的常染色體顯性單基因遺傳性疾病。本病的發(fā)病年齡及嚴(yán)重程度變異很大，甚至在一個家系內(nèi)部的臨床表現(xiàn)輕重不一。據(jù)統(tǒng)計(jì)85%的患者表現(xiàn)為癲癇、智力低下、神經(jīng)行為異常等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，由大腦皮層結(jié)節(jié)、室管膜下結(jié)節(jié)和室管膜下星形細(xì)胞瘤所致[11]。TSC 患者中約70%曾出現(xiàn)過癲癇癥狀或一過性癡呆；約20%～30%的患者在嬰幼兒時期可發(fā)生嬰兒性痙攣，反復(fù)多次發(fā)作后可導(dǎo)致患兒智力低下，預(yù)后較差；患者中約10%可致腦脊液循環(huán)障礙、顱內(nèi)高壓及腦水腫等[12]。約90% TSC患者出現(xiàn)皮膚表現(xiàn)，除最常見的面部血管纖維瘤外，還可見甲周纖維瘤、鯊革樣斑、色素減退斑等。TSC1和TSC2為腫瘤抑制基因，是該病的兩個致病基因。TSC1基因編碼錯構(gòu)瘤蛋白和TSC2基因編碼馬鈴薯球蛋白相互作用形成一種復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、黏附和囊泡運(yùn)輸?shù)?。?dāng)TSC基因發(fā)生突變時，激活mTOR信號通路，使細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)失控，致使腫瘤形成[8]。

迄今為止，在TSC1基因上發(fā)現(xiàn)836個突變（www. lovd.nl/TSC1），在TSC2基因上發(fā)現(xiàn)2 345個突變（www. lovd.nl/TSC2）。突變類型主要有錯義突變、無義突變、剪接位點(diǎn)突變、移碼突變，少數(shù)大片段缺失和插入突變等。目前在這兩個基因上尚未發(fā)現(xiàn)突變熱點(diǎn)，但TSC2基因?yàn)橥蛔兏甙l(fā)基因[13]，而且TSCl 基因和TSC2基因在突變類型、分布等方面存在一定的差異。TSCl基因以無義突變和移碼突變?yōu)橹鳎鳷SC2基因上錯義突變與大片段缺失居多[14,15]。筆者在TSC1基因第15外顯子上發(fā)現(xiàn)了一處缺失突變C.1884-1887delAAAG ( P.Leu628Leu fsX23)，即第1884與1887位堿基之間缺失AAAG 4個堿基，該突變位于少見突變基因TSC1上。經(jīng)查閱文獻(xiàn)及人類基因突變數(shù)據(jù)庫證實(shí)該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，這一發(fā)現(xiàn)豐富了中國漢族人群 TS 致病基因的突變譜。突變致其后密碼子發(fā)生移位，在其后的第23個氨基酸提前出現(xiàn)TGA終止密碼子，導(dǎo)致錯構(gòu)瘤蛋白功能結(jié)構(gòu)域的改變，致復(fù)合體的功能缺乏。

致病基因TSCl和TSC2的突變與TSC臨床表型之間存在一定的相關(guān)性。研究表明，攜帶TSC1突變的患者臨床癥狀普遍比攜帶TSC2突變的患者癥狀輕；TSC2突變通常會導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床表型，較易發(fā)生癲癇、智力障礙、面部血管纖維瘤及腎錯構(gòu)瘤等，臨床表型變異亦較大，且與結(jié)節(jié)大小有關(guān)[15]。該例患者除腰部鯊革樣斑較明顯外，面部血管纖維瘤和甲周纖維瘤均較輕。雖然患者常有短暫發(fā)呆，但其為大專文化，且在交流中表現(xiàn)的自我認(rèn)知能力較強(qiáng)，也說明了患者皮膚及神經(jīng)系統(tǒng)方面的表型較輕，同時也證實(shí)TSC1基因突變導(dǎo)致的臨床表型較輕的特點(diǎn)。本研究通過基因直接測序法對該例TS患者進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)了其基因C.1884-1887delAAAG（P.Leu628Leu fsX23）發(fā)生新的移碼突變，這一發(fā)現(xiàn)有利于給患者及后代進(jìn)行遺傳咨詢、基因診斷，條件具備時可根據(jù)需求進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

[1] O'Callaghan FJ, Shiell AW, Osborne JP, et al. Prevalence of tuberous sclerosis estimated by capture-recapture analysis [J]. Lancet, 1998, 351:1490.

[2] Curatolo P, Bombardieri R, Jozwiak S.Tuberous sclerosis [J]. Lancet, 2008, 372:657-668.

[3] Tee AR, Fingar DC, Manning BD ,et al. Tuberous sclerosis complex-1 and -2 gene products function together to inhibit mammalian target of rapamycin (mTOR)-mediated downstream signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:13571-13576.

[4] Rosser T, Panigrahy A, McClintock W. The diverse clinical manifestations of tuberous sclerosis complex: a review [J]. Semin Pediatr Neurol, 2006, 13(1):27-36.

[5] Krymskaya VP. Tumour suppressors hamartin and tuberin: intracellular signalling [J]. Cell Signal, 2003, 15(8):729-739.

[6] Franz DN. Everolimus in the treatment of subependymal giant cell astrocytomas, angiomyolipomas, and pulmonary and skin lesions associated with tuberous sclerosis complex [J]. Biologics, 2013, 7:211-221.

[7] European Chromosome16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identifi cation and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16 [J]. Cell, 1993, 75(7):1305-1315.

[8] Crino PB. mTOR: A pathogenic signaling pathway in developmental brain malformations [J]. Trends Mol Med, 2011, 17(12):734-742.

[9] Au KS, Williams AT, Roach ES, et al.Genotype/phenotype correlation in 325 individuals referred for a diagnosis of tuberous sclerosis complex in the United States [J]. Genet Med, 2007, 9(2):88-100.

[10] Jones AC, Shyamsundar MM, Thomas MW, et al. Comprehensive mutation analysis of TSC1 and TSC2-and phenotypiccorrelationsi n150 families with tuberous sclerosis [J]. Am J Hum Gene, 1999, 64(5):1305-1315.

[11] Curatolo P, Moavero R, de Vries PJ. Neurological and neuropsychiatric aspects of tuberous sclerosis complex [J]. Lancet Neurol, 2015, 14(7):733-745.

[12] Marcotte L, Crino PB. The neurobiology of the tuberous sclerosis complex [J]. Neuromolecular Med, 2006, 8(4):531-546.

[13] Hoogeveen-Westerveld M, Ekong R, Povey S, et al.Functional assessment of TSC1 missense variants identifi ed in individuals with tuberous sclerosis complex [J]. Hum Mutat, 2012, 33(3):476-479.

[14] Chu-Shore CJ, Major P, Camposano S, et al: The natural history of epilepsy in tuberous sclerosis complex [J]. Epilepsia, 2010, 51(7):1236-1241.

[15] Kothare SV, Singh K, Chalifoux JR, et al. Severity of manifestations in tuberous sclerosis complex in relation to genotype [J]. Epilepsia, 2014, 55(7):1025-1029. .

（本文編輯耿建麗）

Gene mutation detection for a patient with tuberous sclerosis complex

LVYong-mei，ZHANGZheng-zhong，CHENLi，etal
DepartmentofDermatology,theSecondHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China

Objective To identify pathogenic mutation of the TSC1 and TSC2 gene in a Chinese Han patient with tuberous sclerosis complex. Methods All the coding exons of TSC1 and TSC2 genes of the patient, unaffected members in the family and 100 unrelated population-matched controls, were amplified by polymerase chain reaction. The products were analyzed by sequencing. Result One frame-shift mutation C.1884-1887delAAAG (P.Leu628Leu fsX23) from the patient was detected in the exon 15 of the TSC1 gene causing a reading frame shift and an early termination codon TGA followed by 23 amino acids. This novel mutation was not found in unaffected family members and 100 unrelated healthy controls. Conclusion The novel frame-shift mutation C.1884-1887delAAAG in the TSC1 gene may be the underlying cause of this case with tuberous sclerosis complex.

Tuberous sclerosis complex；TSC1 gene；TSC2 gene；Mutation [J Pract Dermatol, 2016, 9(3):168-170]

R744.51

A

1674-1293(2016)03-0168-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160303

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81201226）

230601合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科（呂永梅）；川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科（張正中，牟韻竹）；安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心（陳麗）

呂永梅，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事遺傳性皮膚病、自身免疫性皮膚病方面的研究E-mail:yongmei_lv830@163.com

張正中，E-mail:laowaiaeo@163.com

（2016-01-25

2016-03-12）