康品方， 胡俊鋒， 湯 陽， 葉紅偉， 高 琴， 武文娟， 唐 碧， 張 恒， 王洪巨△

(1. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科； 2. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 安徽 蚌埠 233004， 3. 蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，4. 蚌埠醫(yī)學院生化與分子生物學教研室, 安徽 蚌埠 233030)

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低濃度乙醇對糖尿病大鼠心肌損傷后線粒體融合素2表達的影響*

康品方1， 胡俊鋒2， 湯 陽1， 葉紅偉3， 高 琴3， 武文娟4， 唐 碧1， 張 恒1， 王洪巨1△

(1. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科； 2. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 安徽 蚌埠 233004， 3. 蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，4. 蚌埠醫(yī)學院生化與分子生物學教研室, 安徽 蚌埠 233030)

目的：探討低濃度乙醇對糖尿病大鼠心肌損傷后線粒體融合素2(mfn2)表達的影響。方法：糖尿病大鼠模型采用鏈脲佐菌素55 mg/kg腹腔注射，分為正常對照組(Control組)，糖尿病組(DM組)和糖尿病+乙醇組(DM+EtOH組)(n=6)；糖尿病+乙醇組于造模成功 1 周后給予 2.5%乙醇日常飲用，1 周后改為5%的乙醇持續(xù)至 8 周，8周后行離體心臟灌流，測定心室血流動力學指標，應用自動生化分析儀測定血清乳酸脫氫酶(LDH) 和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST) 的水平。Western blot測定左心室組織線粒體融合素2(mfn2)蛋白表達，免疫組化測定心肌組織mfn2蛋白表達。結(jié)果：與control組大鼠心肌相比，DM組大鼠心率、左室發(fā)展壓、左室做功下降，左室舒張末壓抬高，血清LDH及AST升高明顯，心室mfn2蛋白表達降低；與DM組大鼠心肌相比，DM+EtOH組明顯促進心率、左室發(fā)展壓、左室做功的恢復，降低左室舒張末壓，同時降低LDH的水平和AST的釋放，mfn2的蛋白表達增高。結(jié)論：糖尿病大鼠心肌損傷時，心肌mfn2表達降低；低濃度乙醇增強mfn2在心肌組織中的表達，提示mfn2的增加可能參與低濃度乙醇對糖尿病誘發(fā)的心肌損傷的保護作用。

線粒體融合素2；糖尿?。恍募p傷；低濃度乙醇；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.016

Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004; 3. Department of Physiology, Bengbu Medical College,Bengbu 233030; 4. Department of Biochemistry and Molecular, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是嚴重危害人類生活質(zhì)量的重大疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計：2013年約有3.5億人糖尿病患者，糖尿病每年的發(fā)病率還在不斷增加，到2030年，DM將成為全球第七大死亡原因，糖尿病患者的心血管疾病發(fā)生率高達25.3%。活性氧(reactive oxygen species, ROS)和氧化應激是糖尿病發(fā)生的關鍵因素，ROS可導致DNA損傷、蛋白質(zhì)的錯誤折疊及線粒體等細胞器的損害。作為細胞物質(zhì)與能力代謝的核心，線粒體不僅是細胞的“動力工廠”，還是信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡等途徑的重要環(huán)節(jié)。線粒體功能障礙與糖尿病心肌損傷的發(fā)病機制關系密切。

近年來研究顯示：乙醇的攝入與糖尿病患病風險之間呈“U”型關系，適量乙醇攝入者糖尿病的發(fā)病風險較不攝入乙醇或大量攝入乙醇的患者低。Yuan等研究也發(fā)現(xiàn)：外源性的乙醇預處理可以通過增強抗氧化能力，減輕腎小管上皮細胞的缺血/再灌注損傷[1]。在前期實驗中：我們通過外源性的乙醇干預增強ALDH2的表達，減輕了糖尿病所造成的心肌和腎臟損傷[2-3]。本實驗中，我們通過低濃度乙醇作為工具藥日常飲用，觀察其通過何種機制參與糖尿病損傷的心肌保護。

線粒體融合素2(mitofusin-2, mfn2)位于線粒體外膜，是促進線粒體融合所必須的，其可調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和代謝，維持線粒體膜的穩(wěn)定性。Mfn2除了維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性外，還調(diào)節(jié)細胞的增殖與凋亡，參與細胞的功能活動，是細胞信號轉(zhuǎn)導通路的一個新的調(diào)控點，與多種心血管疾病的病理生理過程密切相關[4]。然而，低濃度乙醇干預的糖尿病大鼠心肌保護作用是否與mfn2相關尚不明確，本研究通過建立糖尿病心肌損傷模型，采用適度的乙醇干預，觀察其對糖尿病心肌損傷后mfn2表達的影響，并探討其發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

選取18只體重在180～200 g的清潔級雄性SD大鼠，由蚌埠醫(yī)學院動物實驗中心提供。

乙醇(ethanol，EtOH)：安徽安特食品股份有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)：Sigma公司；ECL發(fā)光試劑盒：Millipore公司；羊抗小鼠二抗：武漢博士德公司；羊抗mfn2、β-actin單克隆抗體：美國Santa Cruz 公司。

1.2 制備糖尿病心肌損傷模型及實驗分組

雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組(n=6): 對照(Control)組、糖尿病(DM)組及糖尿病+乙醇(DM+EtOH)組。糖尿病大鼠模型的制備采用腹腔注射STZ 55 mg/kg，3 d后測定大鼠空腹血糖，模型復制成功指標：血糖≥16.7 mmol/L持續(xù)1周。DM+EtOH組大鼠先以2.5%的乙醇日常飲用適應性喂養(yǎng)1周，之后以5%的乙醇持續(xù)喂養(yǎng)至8周。Control組和DM組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)持續(xù)至8周[2]。

1.3 血清LDH及AST水平測定

動物麻醉后，腹主動脈取血2 ml，離心分離血清，自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)的水平。

1.4 糖尿病大鼠心肌左心室功能評定

采用Langendorf離體心臟灌流方法，測定左室心功能指標，左心室舒張末壓(left ventricular and diastolic pressure, LVEDP)維持于0.53 kPa～1.07 kPa，應用Medleb生物信號采集系統(tǒng)記錄和分析生物學和分析動力學指標，連續(xù)記錄實驗過程中的左心室發(fā)展壓(left ventricular development pressure, LVDP)，心率(heart rate , HR)和LVEDP等各項指標，計算心肌做功量(rate pressure product, RPP)[2]。

1.5 蛋白印記測定心肌mfn2表達

剪取100 mg心肌組織，組織勻漿后裂解蛋白，離心機離心后取上清液，制膠后進行樣品處理，取蛋白60 μg加樣，轉(zhuǎn)膜封閉后，加入mfn2及內(nèi)參β-actin抗體，4℃冰箱過夜，次日，TBST洗膜5 min，重復4次，加入2抗37℃孵育1 h，洗膜10 min，重復3次，ECL系統(tǒng)進行檢測；mfn2蛋白相對表達量=mfn2/β-actin條帶灰度比值。

1.6 免疫組化檢測心肌組織mfn2的蛋白表達

石蠟切片脫蠟水化，修復抗原，滴加封閉液后加mfn2一抗，沖洗，加二抗，孵育后DAB顯色，蘇木青復染，封片。免疫組織結(jié)果判斷標準：陽性強度：無色或少量棕黃色：(-)；淺棕色：弱陽性(+)；中等棕黃色：中等陽性(++)，深棕黃色：強陽性(+++)。采用計算機圖像分析技術進行定量分析：HPLAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告系統(tǒng)對蛋白進行分析，每張切片隨機選取10個視野，陽性面積率=陽性反應總面積/單位面積中細胞總面積×100%[5]。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清LDH及AST水平比較

與Control組比較，DM組LDH及AST酶的活性增加(P<0.01)，而DM+EtOH組LDH及AST酶的活性無明顯差異(P>0.05)，與DM組相比，DM+EtOH組LDH及AST酶的活性降低(P<0.01，表1)。

GroupLDH(IU/L)AST(U/L)Control802．75±167．86127．02±37．39DM1328．50±279．10??196．62±24．89??DM+EtOH873．60±181．23##119．00±10．31##

LDH: Lactate dehydrogenase; AST: Aspartate aminotransferase; DM: Diabetes mellitus; DM+EtOH: Diabetes+ethanol

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM group

2.2 大鼠血流動力學改變

與Control組比較，DM組及DM+EtOH組HR、LVDP、RPP下降(P<0.01，P<0.05)，LVEDP升高(P<0.01)，與DM組相比，DM+EtOH組明顯促進HR、LVDP、RPP的恢復，降低LVEDP(P<0.01, 表2)。

2.3 各組大鼠心肌組織mfn2的蛋白表達

與Control組比較，DM組mfn2的蛋白表達降低，而DM+EtOH組mfn2的蛋白表達無明顯差異，與DM組相比，DM+EtOH組mfn2的蛋白表達增加(圖1，表3)。

Tab. 2 Ventricular hemodynamic parameters in the rat hearts ±s, n=6)

HR: Heart rate; LVDP: Left ventricular development pressure; RPP: Rate pressure product; LVEDP: Left ventricular and diastolic pressure

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM group

Fig. 1 The expression of mfn2 protein by Western blot in myocardium of diabetic rats

2.4 免疫組化檢測心肌組織mfn2的蛋白表達變化

Control組心肌細胞胞漿內(nèi)可見廣泛分布的棕黃色顆粒，陽性表達(+++)(圖2A，表3)，DM組心肌mfn2蛋白表達面積率明顯低于正常對照組(P<0.01，圖2B，表3)，DM+EtOH組心肌mfn2蛋白表達面積明顯高于DM組(P<0.01)，與Control組無明顯差異(P>0.05，圖2C，表3，圖2見彩圖頁Ⅴ)。

Groupmfn2/β?actinproteinArearatioofmfn2proteinControl1．21±0．080．85±0．05DM0．64±0．04??0．24±0．06??DM+EtOH1．15±0．10##0．78±0．10##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM group

3 討論

糖尿病可通過代謝紊亂和氧化應激等途徑引起心肌細胞凋亡、心室重構(gòu)及收縮功能的異常，最終導致心力衰竭。本實驗通過復制糖尿病心肌損傷模型發(fā)現(xiàn)：與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心室LVDP、HR及RPP明顯降低，LVEDP及血清中LDH及AST水平明顯增高，而mfn2的蛋白表達降低；低濃度乙醇干預組糖尿病大鼠，促進了心室LVDP、HR及RPP的恢復，LVEDP降低，心肌損傷減輕，LDH及AST水平降低，mfn2的蛋白表達也較前增加。這些結(jié)果表明，低濃度的乙醇可能通過增強mfn2的表達發(fā)揮心肌保護作用。

心肌發(fā)生損傷時，血液中的AST及LDH活性增高加重缺血對心肌的損傷。我們研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，糖尿病大鼠心室LVDP、HR及RPP明顯降低，LVEDP升高，同時血清中AST及LDH的釋放增加，提示心肌損傷加重。

長期大量飲酒(>3-4次/天，或>45～60 g乙醇)，可造成多器官功能和器質(zhì)性的改變，引起心血管系統(tǒng)疾病，導致患者發(fā)生心力衰竭甚至死亡，同時也可降低胰島素的敏感性，使糖尿病發(fā)生的危險增加[6-7]；而少至中量飲酒(1-2次/天，或>15～30 g乙醇)則對身體有益，酒中的活性成分可發(fā)揮抗氧化、改善內(nèi)皮功能、清除氧自由基等重要的生物學作用[8-9]。適度的飲酒有利于減緩腎臟缺血/再灌注損傷導致的氧化應激，增強組織的抗氧化能力和抑制脂質(zhì)過氧化作用[10]；還可通過調(diào)控mTOR信號通路減輕缺血和非缺血心肌細胞的凋亡[11]，Antonio D等也證實：適度的乙醇攝入可以增加慢性缺血心肌小動脈的密度及內(nèi)皮依賴性的血管舒張，使心肌灌注增加[12]。我們的研究觀察到，長期給低濃度的乙醇干預，可以促進糖尿病大鼠心肌血流動力學的恢復，降低血清LDH及AST表達水平，進一步提示低濃度乙醇對糖尿病大鼠心肌可發(fā)揮保護作用。

線粒體大量存在于心臟中，占其重量的30%～40%，提供了超過90%的能量。同時，線粒體還是重要的信號細胞器，在調(diào)控細胞生理機制中起著重要作用，氧化應激和鈣超載都可導致線粒體功能缺失。Mfn2是線粒體內(nèi)介導線粒體融合的關鍵蛋白，在心肌組織中表達較高。Mfn2除了維持線粒體形態(tài)和功能外，與細胞凋亡也密切相關，是信號調(diào)控通路中的新的調(diào)控點之一。Mfn2過表達不僅能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖，還可能通過活化線粒體途徑影響B(tài)cl-2/Bax的表達，促進細胞色素C的釋放繼而激活caspase-3誘導VSMCs的凋亡[13]。Mfn2高表達可保護小腦顆粒神經(jīng)元細胞對抗損傷誘導的細胞死亡，減少線粒體斷裂和氧自由基的釋放，減輕凋亡的發(fā)生[14]，陳春蕾等通過復制心肌肥大模型發(fā)現(xiàn)：心肌細胞肥大時mfn2表達明顯下降，過表達mfn2后可抑制α腎上腺素受體持續(xù)激動時引起心肌細胞蛋白合成的增加，mfn2基因可以發(fā)揮抑制大鼠心肌細胞肥大的發(fā)生[15]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的增加，mfn2在心肌組織中的表達逐漸降低[16]，本實驗中，低濃度乙醇干預組糖尿病大鼠， mfn2的蛋白表達較糖尿病組明顯增加，大鼠心功能較前好轉(zhuǎn)，血清LDH及AST的表達降低，這些結(jié)果提示，低濃度的乙醇攝入可能通過增強mfn2的表達發(fā)揮心肌保護作用。

關于mfn2與低濃度乙醇攝入的關系鮮有報道。本實驗中，我們觀察到：心肌組織mfn2的表達在糖尿病大鼠心肌中明顯降低，而低濃度乙醇攝入促進了糖尿病損傷心肌的恢復，血漿中LDH及AST水平增加，同時，mfn2的表達也增加明顯。本研究揭示了心肌mfn2的表達增加可能參與低濃度乙醇對糖尿病誘發(fā)的心肌損傷的保護作用，這為糖尿病患者臨床治療的研究提供新的方向，但具體機制仍需進一步探討。

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Effects of low-concentrations alcohol consumption on the expression of mitofusin-2 in myocardial injury of diabetic rats

KANG Pin-fang1, HU Jun-feng2, TANG Yang1, YE Hong-wei3, GAO Qin3,WU Wen-juan4, TANG Bi1, ZHANG Heng1, WANG Hong-ju1Δ

(1. Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004; 2. Department of

Objective: To observe the effects of low- concentrations of alcohol consumption on the expression of mitofusin-2 (mfn2) in myocardial injury of diabetic rats. Methods: Diabetic rat model was simulated by intraperitoneal injection of 55 mg/kg streptozotocin (STZ) and divided into control group, diabetes mellitus(DM)and diabetes+ethanol (DM+EtOH) groups (n=6). When diabetic model was succeed, daily consumption of 2.5% ethanol was used in ethanol + diabetic group after one week, then changed to 5% ethanol continued until 8 weeks. Eight weeks after the modeling, heart perfusion ex vivo. The ventricular hemodynamic parameters were recorded, the serum levels of lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (AST) were determined by automatic biochemistry analyzer, the mfn2 protein expression of left anterior myocardium was evaluated by Western blot and immunohistochemistry. Results: Compared with control group, the left ventricular development pressure (LVDP), heart rate (HR) and rate pressure product (RPP) were decreased, however, left ventricular and diastolic pressure (LVEDP) and LDH, AST release were increased, the expression of mfn2 protein was decreased in DM group. Compared with DM group, LVDP, HR and RPP and the expression of mfn2 protein were increased, LVEDP and LDH, AST were decreased in DM+EtOH group. Conclusion: The expression of mfn2 protein was decreased in myocardial injury of diabetic rats, low- concentrations of alcohol consumption increased the expression of mfn2. It suggests that mfn2 may be participated in the cardiac protective role of low- concentrations alcohol intervene in diabetic rat.

mitofusin-2; diabetes mellitus; myocardial injury; low-doses of alcohol; rat

國家自然科學基金資助項目(81550036，81000074)；安徽省自然科學基金資助項目(1508085MH169)；蚌埠醫(yī)學院科技發(fā)展基金資助項目(Bykf13A16)；教育部回國留學人員啟動基金資助項目(第46批-教外司留〔2013〕693號)

2016-01-08

2016-04-18

R363.2

A

1000-6834(2016)04-347-05

△【通訊作者】Tel: 0552-3086103; E-mail: docwhj1101@163.com