康文博， 李曉紅， 陳 羽中， 王景景， 涂 悅， 張 賽， 梁海乾△

(1. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院， 腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所， 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室， 天津 300162；2. 河北醫(yī)科大學(xué)， 石家莊 050017)

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亞低溫對脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響*

康文博1，2， 李曉紅1， 陳 羽中1， 王景景1， 涂 悅1， 張 賽1，2， 梁海乾1△

(1. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院， 腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所， 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室， 天津 300162；2. 河北醫(yī)科大學(xué)， 石家莊 050017)

目的：觀察在不同溫度條件下脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷活化后的形態(tài)和活性改變，以探討亞低溫對脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響。方法：體外原代培養(yǎng)新生SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，以劃痕實驗制備反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。亞低溫選擇33℃，細(xì)胞培養(yǎng)48 h。實驗分為對照組、劃痕組、亞低溫組和劃痕+亞低溫組。各組在相應(yīng)的時間點觀察細(xì)胞形態(tài)，采用免疫熒光染色方法檢測Nestin陽性率，MTT比色法觀察細(xì)胞活性，PI染色方法觀察細(xì)胞凋亡程度。結(jié)果：與對照組和亞低溫組相比，劃痕組和劃痕+亞低溫組細(xì)胞胞體肥大，周圍突起增多、延展以及胞漿豐富，細(xì)胞生長率明顯升高。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組細(xì)胞變化減慢，周圍突起減少，細(xì)胞長入劃痕處所需時間增加，細(xì)胞Nestin陽性率、PI陽性率和細(xì)胞生長率明顯降低，各結(jié)果差異顯著(P<0.01)。結(jié)論：劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞并會增生，亞低溫明顯抑制脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，并可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

亞低溫；反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞；脊髓損傷；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.001

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見疾病。隨著社會經(jīng)濟(jì)和交通業(yè)的迅速發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率日益增長，給社會、家庭和個人造成經(jīng)濟(jì)、身體和心理上的嚴(yán)重打擊。脊髓損傷后神經(jīng)元缺失，并伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生[1]，形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(reactive astrocytes，RAS)。RAS前期可以保護(hù)神經(jīng)元，誘導(dǎo)成體神經(jīng)干細(xì)胞分化為新生神經(jīng)元[2]，但是其過度增生會形成膠質(zhì)瘢痕，嚴(yán)重阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-4]。近年來，很多研究證實亞低溫可以保護(hù)神經(jīng)元[5-6]，但是，亞低溫對于RAS影響的研究甚少。本研究通過觀察在不同溫度條件下脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷活化后的形態(tài)和活性改變，以探討亞低溫對RAS過度增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD孕鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑

DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12)培養(yǎng)基(HyClone，美國)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，Gibco，美國)、小鼠抗Nestin抗體(Abcam，英國)、兔抗GFAP抗體(Sigma，美國)、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(Life technology，美國)、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(Life technology，美國)，MTT(Methyl Thiazolyl Tetrazolium Salt)試劑(Solarbio，中國)，PI(Propidium Iodide，Sigma，美國)。

1.3 實驗分組

實驗分為對照組、劃痕組、亞低溫組和劃痕+亞低溫組。對照組細(xì)胞直接置于37℃孵育箱中培養(yǎng)7 d，劃痕組細(xì)胞劃痕處理后置于37℃孵育箱中培養(yǎng)7 d，亞低溫組細(xì)胞先置于33℃孵育箱中培養(yǎng)48 h后再置于37℃孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，劃痕+亞低溫組細(xì)胞劃痕處理后置于33℃孵育箱中培養(yǎng)48 h后置于37℃孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d。33℃是人體的最低耐受溫度，既可以降低人體機能代謝，又能保證機體所需溫度[5-6]。

1.4 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取培養(yǎng)和鑒定

取1～3 d新生SD大鼠3只，用75%的酒精浸泡5 min，無菌條件下分離后背皮膚肌肉與脊椎暴露脊髓，取出脊髓放入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，0.01 mmol/L)中去除脊髓膜和血管等組織，置于DMEM/F12培養(yǎng)基中用200目不銹鋼濾網(wǎng)進(jìn)行研磨，將濾液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化1～2 min，用含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化，再次離心，棄上清，加入含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀置于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h差速黏附，更換培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)至長滿80%～90%，置于恒溫?fù)u床260 r/min振蕩16 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)并檢測純度[7]，以備后用。免疫熒光檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞純度：第3次傳代后，星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×104種植于48孔板，采用兔抗GFAP多克隆抗體進(jìn)行熒光染色。在熒光顯微鏡下取6個視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比并拍照。

1.5 劃痕損傷制備RAS

將星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×104種植于48孔板，用10 μl無菌加樣槍頭沿“井”字劃痕，劃痕間距0.3 mm，劃痕時保持勻速和相同力度。劃痕后換液除去脫落和死亡細(xì)胞及碎片，每隔3 d半量換液[8]。

1.6 免疫熒光染色檢查細(xì)胞Nestin陽性率

培養(yǎng)7 d后，各組細(xì)胞行免疫熒光雙染。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS浸洗3×5 min，0.5% Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5% BSA封閉孵育20 min，加入一抗(1∶1 000)兔抗大鼠GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，再加入Nestin(1∶300)小鼠抗大鼠標(biāo)記活化的RAS，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，后續(xù)操作避光，加入二抗(1∶200)羊抗兔抗體綠色，37℃孵育1 h，PBS浸洗3×10 min，再加入二抗(1∶200)羊抗小鼠抗體紅色，37℃ 1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI染核(1∶100)，37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 PI染色觀察細(xì)胞凋亡情況

分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、5 d、7 d后，各組細(xì)胞行免疫熒光共染。用含有終濃度PI為10 μg/ml和DAPI為10 μg/ml的PBS混合液染料進(jìn)行實驗，加入混合液避光37℃孵育30 min，PBS浸洗3×10 min，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS浸洗3×5 min。熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 MTT比色法觀察細(xì)胞生長率

分別在培養(yǎng)0 d、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d行MTT實驗，MTT試劑用PBS配制成5 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾，避光-20℃保存。星形膠質(zhì)細(xì)胞種96孔板，加入無血清DMEM培養(yǎng)基180 μl，再加入MTT試劑20 μl，37℃孵育4 h，棄上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀振蕩孵育10 min，570 nm波長測量吸光度，記錄結(jié)果[9]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度檢測

第3次傳代后星形膠質(zhì)細(xì)胞純度檢測，在熒光顯微鏡200倍下觀察，取6個視野計數(shù)共染陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，純度=(共染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%，均為95%以上，符合實驗要求(圖1，圖1見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變

光學(xué)顯微鏡下分別在培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d、5 d、7 d觀察各組的細(xì)胞形態(tài)和劃痕處細(xì)胞的改變。劃痕后6 h內(nèi)，劃痕組和劃痕+亞低溫組細(xì)胞胞體肥大，周圍突起增多、延展以及胞漿豐富等，相鄰細(xì)胞開始聚集，劃痕處可見細(xì)胞碎片且間距拉大。劃痕組細(xì)胞6 h后細(xì)胞之間連接緊密，呈扁平不規(guī)則形狀，細(xì)胞長出很多突起，并伸向劃痕處，48 h后劃痕處出現(xiàn)細(xì)胞生長，劃痕間距縮短，5 d后劃痕處出現(xiàn)大量細(xì)胞。劃痕+亞低溫組細(xì)胞12 h后細(xì)胞才會長出很多突起并伸向劃痕處，3 d后劃痕處出現(xiàn)細(xì)胞生長，7 d劃痕處出現(xiàn)大量細(xì)胞。劃痕+亞低溫組細(xì)胞與劃痕組細(xì)胞相比，變化速率明顯降低，說明亞低溫抑制RAS的增生(圖2，圖2見彩圖頁Ⅰ)。

2.3 觀察細(xì)胞Nestin陽性率

免疫熒光染色在倒置熒光顯微鏡下觀察，各組取6個視野記錄Nestin陽性細(xì)胞數(shù)和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。RAS可以特異性表達(dá)Nestin[10]，因此Nestin陽性率可以表示RAS的活化程度，RAS同時可以表達(dá)GFAP。Nestin陽性率=(Nestin陽性細(xì)胞數(shù)/GFAP陽性細(xì)胞數(shù))×100%。與對照組的陽性率(11.58±6.80)%和亞低溫組的陽性率(10.67±8.52)%相比，劃痕組的陽性率(82.60±3.33)%和劃痕+亞低溫組的陽性率(60.76±4.74)%明顯升高，且后兩者分別與前兩者相比都具有顯著性差異(P<0.01)，說明劃痕損傷引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。與劃痕組的陽性率相比，劃痕+亞低溫組的陽性率又較低，且具有顯著性差異(P<0.01)，說明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化(圖3，圖3見彩圖頁Ⅱ)。

2.4 觀察細(xì)胞凋亡率

熒光顯微鏡200倍下觀察，取6個視野記錄PI陽性細(xì)胞數(shù)和DAPI陽性細(xì)胞數(shù)。PI陽性率可以反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡程度，PI陽性率=(PI陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù))×100%。分別在1 d、2 d、3 d、5 d、7 d計算各組的PI陽性率。與對照組和亞低溫組相比，劃痕組和劃痕+亞低溫組PI陽性率升高，說明劃痕造成損傷。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組在1 d、2 d、3 d PI陽性率降低，以上都具有顯著性差異(P<0.01，表1)，表明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡(圖4，圖4見彩圖頁Ⅲ)。

Tab.

A： Control group； B： Scratches group； C： Mild hypothermia group； D： Scratch + mild hypothermia group

**P<0.01vsA group;##P<0.01vsB group;△△P<0.01vsC group

2.5 觀察不同時間點星形膠質(zhì)細(xì)胞生長率

測定每組每個時間點6個復(fù)孔的OD值，取平均值。計算每組的生長率，生長率=(各時間點OD均值-初始OD均值)/初始OD均值，初始OD均值為0 d的OD均值，分別在1 d、2 d、3 d、5 d、7 d計算各組的生長率。與對照組和亞低溫組相比，劃痕組和劃痕+亞低溫組生長率在第3天后明顯升高。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組各時間點生長率在第2天后明顯降低，且具有顯著性差異(P<0.01，表2)，再次表明亞低溫可以抑制細(xì)胞活化增生。

Tab.

A： Control group； B： Scratches group； C： Mild hypothermia group； D： Scratch + mild hypothermia group

**P<0.01vsA group;##P<0.01vsB group;△△P<0.01vsC group

3 討論

近年來，亞低溫治療技術(shù)廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。很多研究證實亞低溫對神經(jīng)元有保護(hù)作用，但是對星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究很少，對于研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在亞低溫保護(hù)神經(jīng)元機制中的作用更少。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)元缺失的同時會伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，而后者形成RAS。在損傷的早期，RAS對神經(jīng)元是一種保護(hù)作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)適量的炎性因子誘導(dǎo)成體神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生[11]，還可以分泌成纖維生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等來促進(jìn)神經(jīng)元軸突和樹突的形成[12-13]。但是在損傷的后期，RAS過度增生會形成膠質(zhì)瘢痕，產(chǎn)生硫酸軟骨蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan, CSPG)等生長抑制因子，可阻止軸突生成和神經(jīng)發(fā)生[14]，釋放促炎因子，導(dǎo)致過度免疫反應(yīng)，損傷軸突，并形成一種物理屏障，阻礙再生軸突跨越病變區(qū)域[15]。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增生可以間接保護(hù)神經(jīng)元。

細(xì)胞處于亞低溫環(huán)境當(dāng)中，新陳代謝處于一個低水平狀態(tài)，這一水平的溫度既可以保證細(xì)胞不會被凍死，也可以降低細(xì)胞活性。實驗結(jié)果表明：星形膠質(zhì)細(xì)胞處于亞低溫狀態(tài)時，活化程度明顯被抑制，并且進(jìn)一步復(fù)制增生的進(jìn)度也被顯著阻礙，但是又不會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反而抑制其凋亡。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞被抑制在一個損傷的初始，甚至為損傷階段。正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元是一種保護(hù)支持作用，而活化后的RAS對神經(jīng)元是一種損傷作用，這樣，亞低溫就通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生而保護(hù)神經(jīng)元[16-17]。

綜上所述，劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為RAS并增生，亞低溫明顯抑制脊髓RAS的過度增生，并可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。結(jié)果充分證明亞低溫治療技術(shù)對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。

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The effect of inhibition of hyperplasia on spinal cord reactive astrocytes by mild hypothermia

KANG Wen-bo1，2, LI Xiao-hong1, CHEN Chong1, WANG Jing-jing1, TU Yue1, ZHANG Sai1，2, LIANG Hai-qian1△

(1. Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology, Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces,Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair, Tianjin 300162； 2. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective: To observe changes in the morphology and activity of astrocytes in spinal cord at different temperatures after scratches treatment, and to investigate the effect of mild hypothermia on hyperplasia of reactive astrocytes. Methods: Spinal cord astrocytes were cultured from the neonatal SD rat, and reactive astrocytes were prepared by scratches treatment. Mild hypothermia choose 33℃, cell culture 48 h. Cells were divided into control group、scratches group、mild hypothermia group and scratch + mild hypothermia group. Cell morphology of each group were observed in 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d、5 d、7 d. Nestin positive rate were detected by using immunofluorescence staining method. Cell activity were observed by methyl thiazolyl tetrazolium salt (MTT) assay. The degree of apoptosis was observed by using PI staining method. Results: Compared with control group and mild hypothermia group, cell body in both scratches group and scratch + mild hypothermia group was hypertrophy, the protrusion around was increased and extend, the cytoplasm was enrich, and the growth rate was significantly increased. Compared with scratches group, scratch + mild hypothermia group cells grew slowly, the protrusion around was decreased, and cells of the scratched area ingrowth significantly slowly. Nestin and PI positive rate of cells were also significantly lower. All the results had statistically significant differences (P<0.01). Conclusion: After scratch injury, astrocytes were activated to be reactive astrocytes and hyperplasia. Mild hypothermia significantly inhibited spinal cord reactive astrocytes overgrowth and restrain astrocytes apoptosis.

mild hypothermia; spinal cord injury; rats

國家自然科學(xué)基金項目(81301050，81271392，81401067)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(14JCQNJC10200，15JCYBJC28100)；中國博士后基金項目(2013M542583)

2015-04-07

2015-10-13

R651.2

A

1000-6834(2016)04-289-07

△【通訊作者】Tel: 022-60577125； E-mail： lianghaiqian@163.com