， ， ， ， ， 林軒， 坤華(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530023)

劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)研究

韋瑩，黃寶優(yōu)，繆劍華，王一諾，李翠，李林軒，韋坤華
(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530023)

為了獲取質(zhì)地好且松散型的愈傷組織，為進(jìn)行劍葉龍血樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供材料。本試驗(yàn)以劍葉龍血樹種子、芽為外植體，研究不同培養(yǎng)基、不同激素組合對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)和質(zhì)地的影響。結(jié)果表明：以MS為基本培養(yǎng)基，增加適當(dāng)濃度的2，4-D和6-BA能促進(jìn)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)率的提高，長(zhǎng)勢(shì)良好，產(chǎn)生的疏松愈傷組織也最多，最佳疏松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L。

劍葉龍血樹； 疏松愈傷組織； 誘導(dǎo)技術(shù)

劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen) 又名千年木、血竭樹、交趾龍血樹，是漸危種，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[1]。劍葉龍血樹具有很高的藥用價(jià)值，從其樹脂提取的血竭被稱為麒麟竭，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國(guó)已有1 500年以上的使用歷史[2]。據(jù)《本草綱目》記載，龍血竭性溫、平，味甘、咸，無毒，入血分，歸肺、脾、腎三經(jīng)[3]，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅(jiān)散結(jié)，生肌斂瘡等功效，有“活血圣藥”的美譽(yù)[4-5]，主要分布于云南、廣西、海南等地。

近年來，由于其需求量大再加上高昂的價(jià)格致使人們對(duì)劍葉龍血樹野生資源實(shí)施了掠奪性采伐，劍葉龍血樹野生資源日趨枯竭，瀕臨滅絕，已被列入國(guó)家二類中藥保護(hù)品種，中國(guó)珍稀瀕危植物品種之一[6]。因此利用生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行組培快繁尤為重要。對(duì)劍葉龍血樹的研究主要集中在藥物化學(xué)成分、組織培養(yǎng)[7-8]等方面的研究，目前尚未有細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面研究的報(bào)道。疏松愈傷組織容易散碎，增殖能力旺盛，有利于愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時(shí)能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。本實(shí)驗(yàn)通過探究不同激素對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織的影響，篩選出能促進(jìn)愈傷組織快速生長(zhǎng)且質(zhì)地松散的最佳激素組合，為進(jìn)一步進(jìn)行劍葉龍血樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供試驗(yàn)材料，為保護(hù)和合理開發(fā)劍葉龍血樹提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料種子采自廣西省靖西縣。經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園黃雪彥老師鑒定該品種為劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen)，2011年4月11日于廣西藥用植物園離體庫進(jìn)行組織培養(yǎng)和種子發(fā)芽試驗(yàn)，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得愈傷組織。

1.2 方 法

1.2.1 無菌苗的獲得

先用洗潔精水溶液清洗外植體(飽滿種子、種子播種于河沙里萌發(fā)的芽)表面臟物，再進(jìn)行流水沖洗5～8 min，移至超凈工作臺(tái)上，用75%酒精將種子和芽浸泡30 s，無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgC12浸泡，時(shí)間分別為8，12，15 min，無菌水浸泡3次。分別接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為23～27 ℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間為12～14 h/d，30 g/L蔗糖，5.0 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。培養(yǎng)8～15 d便開始出芽(圖1，圖2)，并逐漸長(zhǎng)出無菌苗。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將無菌苗剪切成0.8～1.2 cm的帶芽莖段，接種于MS基本培養(yǎng)上，培養(yǎng)基分別附加不同濃度配比的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-芐氨基嘌吟)2種植物激素。通過設(shè)計(jì)10個(gè)處理試驗(yàn)，篩選出誘導(dǎo)劍葉龍血樹疏松愈傷組織的最佳激素組合，經(jīng)培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。

圖1 種子消毒誘導(dǎo)

圖2 種子誘導(dǎo)出芽

1.2.3 繼代培養(yǎng)

將培養(yǎng)25～30 d的愈傷組織接種到MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔1個(gè)月轉(zhuǎn)接1次，接種時(shí)切除黑色、褐化或者已失去活力的愈傷組織，挑選長(zhǎng)勢(shì)好的組織進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)繼代5次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

誘導(dǎo)率(%)=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%;

褐化率(%)=褐化的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的作用

以無菌芽為外植體，在添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L激素的MS、B 5、N 6三種基本培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)40 d后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期(15 d)各處理愈傷組織變化差異不大，培養(yǎng)30 d后3個(gè)處理的愈傷組織在生長(zhǎng)速度、顏色等方面逐漸出現(xiàn)差異。由表1可見，MS培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為62.9%，褐化率也相對(duì)最低，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松；其次為B 5培養(yǎng)基，而以N 6為基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效果最差，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，顏色淺黃、愈傷組織質(zhì)地緊密，褐化率也最高。因此認(rèn)為，MS培養(yǎng)基較適合劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導(dǎo)。

表1 MS、B 5、N 6培養(yǎng)基對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率(%)褐化率(%)顏 色長(zhǎng) 勢(shì)MS62．917．1綠色，乳白色生長(zhǎng)較快，疏松型愈傷組織較多B557．131．4綠色，少量淺黃色生長(zhǎng)速度一般，愈傷組織較疏松N651．445．7少量綠色，淺黃色生長(zhǎng)慢，愈傷組織質(zhì)地緊密

2.2 疏松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度6-BA和2，4-D相結(jié)合的方法對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果見表2。

表2 6-BA、2，4-D不同濃度及組合對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

激素及濃度(mg/L)6?BA2，4?D愈傷組織誘導(dǎo)率(%)疏松程度顏色0．10．568．6++綠色0．50．574．3++淡黃色，乳白色1．00．577．1++淺綠色，部分淡黃色1．50．571．4+嫩綠2．00．568．6+綠色0．50．165．7+淺綠色0．51．080．0++綠色0．51．588．6+++乳白色、嫩綠色0．52．085．7++++淺綠色、乳白色0．53．082．9++綠色，淡黃色

在上述10個(gè)處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)10 d后，外植體切口端開始膨大，培養(yǎng)半個(gè)月逐漸形成愈傷組織。經(jīng)過培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及長(zhǎng)勢(shì)等各指標(biāo)。從表1可以看出，不同植物激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、質(zhì)地及色澤均有較大差異。在2個(gè)激素組合處理中，當(dāng)2，4-D濃度固定為0.5 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增長(zhǎng)，劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)率在很小幅度上逐漸上升，質(zhì)地變得更緊密、顏色也產(chǎn)生相應(yīng)的變化，在6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最高，為77.1%，但質(zhì)地和顏色指標(biāo)效果不是最佳，從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)材料需要來看，濃度在0.5 mg/L時(shí)較為適宜。而在同一6-BA濃度作用下，高濃度的2，4-D愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)均較高，顏色變化不規(guī)律，愈傷組織質(zhì)地由緊密逐漸疏松(圖3，圖4)。這一結(jié)果說明,在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，高濃度的2，4-D能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，其中，以激素組合為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)最好，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)85%以上，產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，大部分為嫩綠色、顆粒狀的愈傷組織。

圖3 緊密愈傷組織

圖4 顆粒狀、疏松型愈傷組織

3 結(jié) 論

不同種類培養(yǎng)基對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)分別采用MS、B 5和N 6三種培養(yǎng)基，這3種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，MS培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且褐化率最低，可能是由于其具有較高的無機(jī)鹽濃度，能夠提供組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，從而加速愈傷組織的生長(zhǎng)。B 5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，銨這一營(yíng)養(yǎng)成分有可能對(duì)培養(yǎng)基有抑制生長(zhǎng)的作用，因而愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較低。N 6培養(yǎng)基特點(diǎn)是KNO3和(NH4)2SO4含量高，褐化嚴(yán)重。未添加2,4-D的條件下，B 5和N 6培養(yǎng)基與6-BA和NAA相結(jié)合能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但生長(zhǎng)緩慢，愈傷組織質(zhì)量差，因此不是最佳選擇。

生長(zhǎng)速度快、疏松易碎的愈傷組織是進(jìn)行植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵[9]。一般選用顆粒細(xì)小、疏松易碎、外觀濕潤(rùn)、鮮艷的白色或淡黃色的愈傷組織作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料[10]。本研究采用劍葉龍血樹種子和芽作為外植體，采用MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度的2,4-D和6-BA激素組合誘導(dǎo)劍葉龍血樹愈傷組織，結(jié)果表明，激素種類和濃度對(duì)劍葉龍血樹愈傷組織的誘導(dǎo)效果有一定的影響，2，4-D不僅有利于促進(jìn)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，而且濃度不同質(zhì)地也存在差異，經(jīng)試驗(yàn)比較認(rèn)為激素組合MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5～2.0 mg/L誘導(dǎo)效果最佳，在該培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)速度較快，質(zhì)地疏松。培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長(zhǎng)勢(shì)良好。

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Study on the Loose Callus Induction Technology ofDracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen

WEIYing,HUANGBaoyou,MIAOJianhua,WANGYinuo,LICui,LILinxuan,WEIKunhua

2016-03-28

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(編號(hào)：GZPT 1234)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：桂科合14125008-2-21)。

韋 瑩(1980—)，女(壯族)，廣西都安人；碩士，助理研究員，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究；E-mail:wendy371@sohu.com。

韋坤華，女，廣西平南人；博士，主要從事中藥生物技術(shù)研究；E-mail:divinekh@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.080

S 567.1+9

A

1001-4705(2016)08-0080-03