， ， 銀河， (.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院和工程中心, 昆明 65020;2.昆明市官渡區(qū)第五中學(xué)， 云南 昆明 6500)

蓮瓣蘭大雪素FT基因克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析

何衛(wèi)1,2，趙靚1，趙銀河1，王云月1
(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院和工程中心, 昆明 650201;2.昆明市官渡區(qū)第五中學(xué)， 云南 昆明 650011)

控制植物開花的途徑有光周期現(xiàn)象、GA、春化途徑、自主途徑，在光周期途徑中，CO基因促進(jìn)開花通過直接上調(diào)FT和SOC1基因表達(dá)，F(xiàn)T(FLOWERINGLOCUST)是光周期途徑植物開花時(shí)間決定關(guān)鍵基因，并認(rèn)為FT基因表達(dá)產(chǎn)物可能就是長(zhǎng)期追尋的開花刺激物質(zhì)，這種開花刺激物質(zhì)經(jīng)過葉片到莖尖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，最終引起莖頂端花器官分化的起始。本研究以蓮瓣蘭大雪素作為實(shí)驗(yàn)材料，用RACE方法快速地克隆全長(zhǎng)cDNA，生物信息學(xué)分析全長(zhǎng)cDNA為662 bp，含有編碼框和3′UTR,具有完整的開放閱讀框 (ORF) 522 bp,編碼173氨基酸的蛋白質(zhì)。通過系統(tǒng)發(fā)育分析獲得一個(gè)FT同源基因。本研究為進(jìn)一步對(duì)這個(gè)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

植物花器官； 蓮瓣蘭大雪素；FT基因克隆； 系統(tǒng)發(fā)育

植物完整的生命周期分為營養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)2個(gè)階段，其中由營養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的過程稱為開花誘導(dǎo)。高等植物的開花過程受內(nèi)因和外因2方面決定，是開花基因在時(shí)空表達(dá)的結(jié)果[1]。開花相關(guān)基因的表達(dá)則是實(shí)現(xiàn)由營養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，環(huán)境因子以及細(xì)胞自身的生長(zhǎng)狀況對(duì)這些基因的表達(dá)起著調(diào)控作用。在眾多的外界環(huán)境(如溫度，光照等)中，植物開花尤其對(duì)光周期信號(hào)非常敏感，并對(duì)其作出適應(yīng)性反應(yīng)。目前已了解到光周期信號(hào)被植物成熟葉片接收和感知并產(chǎn)生開花刺激物質(zhì)，這種開花刺激物質(zhì)經(jīng)過葉片到莖尖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，最終引起莖頂端開花起始。FT(FLOWERINGLOCUST)是光周期途徑植物開花時(shí)間決定關(guān)鍵基因，并認(rèn)為FT基因的表達(dá)產(chǎn)物FT蛋白可能就是人們長(zhǎng)期追尋的開花刺激物質(zhì)，即開花素(florigen)[2-3]。

FT基因是植物開花的誘導(dǎo)因子。植物的開花時(shí)間受到光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑和自發(fā)途徑的調(diào)控，并通過FT將以上4種途徑所感知的信號(hào)整合。FT促進(jìn)植物從營養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，是促進(jìn)開花的信號(hào)整合因子。在光周期調(diào)控途徑中，光受體接收外界光信號(hào)后，經(jīng)過生物鐘基因?qū)⒐庑盘?hào)傳遞到CO(CONSTANS)，在長(zhǎng)日照條件下CO誘導(dǎo)下游基因FT表達(dá)，F(xiàn)T蛋白在莖端分生組織中與FD(FLOWERINGLOCUSD)蛋白結(jié)合促進(jìn)AP1(APETALA1)的表達(dá)。AP1是花發(fā)育的早期標(biāo)記基因，它的表達(dá)意味著花發(fā)育的開始。

FT基因編碼的蛋白可能是開花素的組分之一。Knott早在1934年就注意到葉片感知光周期的信號(hào)，而花的形成則在植株頂端，由此推測(cè)經(jīng)光周期誘導(dǎo)后的葉片中必定有信號(hào)物質(zhì)長(zhǎng)距離運(yùn)輸至莖端，導(dǎo)致頂端分生組織形成花器官。1937年，Chailakhyan明確提出開花素的概念，認(rèn)為開花素是在適宜光周期下形成的特異性促進(jìn)開花的激素類物質(zhì)。在此后的70年里，開花素的研究一直未取得突破。近年來，在擬南芥等植物光周期途徑的分子生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因與開花素有關(guān)?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CO誘導(dǎo)FT在葉片的韌皮部表達(dá)，F(xiàn)T蛋白經(jīng)韌皮部的伴胞運(yùn)輸?shù)街仓觏敹?，與FD相互作用促進(jìn)花分生組織特征基因AP1的表達(dá)，引起植株開花，F(xiàn)T蛋白是可以運(yùn)輸?shù)幕ㄕT導(dǎo)信號(hào)，由此推測(cè)FT蛋白是開花素的組分之一[4]。

FT基因是在模式植物擬南芥中克隆得到，F(xiàn)T蛋白是開花素的主要成分，控制著擬南芥等植物的開花時(shí)間。目前，已經(jīng)在水稻、小麥、葫蘆、番茄、柑橘等其他植物中克隆出了FT的同源基因，并對(duì)部分植物進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植物中FT類基因的過量表達(dá)均不同程度地引起了轉(zhuǎn)基因植株的早期開花[5]。已有的研究表明，在不同植物中，F(xiàn)T基因的表達(dá)和功能具有一定的差異，但是均具有促進(jìn)植物開花的作用，這表明不同植物中FT基因的功能有很大的保守性。

蓮瓣蘭(Cymbidiumtortisepalum)是中國春蘭的一個(gè)新品系，亦稱小雪蘭。大雪素是蓮瓣蘭中較為常見的一種，滇蘭四大名品之首，于春節(jié)前后開花，已有數(shù)百年的栽培歷史，原產(chǎn)于滇西的部分地區(qū)[6]。本研究以蓮瓣蘭大雪素做實(shí)驗(yàn)材料，用RACE方法快速地克隆全長(zhǎng)cDNA ，從花的器官材料中分離開花相關(guān)FT基因并進(jìn)行克隆。通過對(duì)蓮瓣蘭大雪素FT基因的初步研究，了解FT基因在開花調(diào)控中的作用。

在蘭花中FT基因的研究還缺乏，本研究是通過RACE方法，克隆出全長(zhǎng)cDNA，進(jìn)一步通過系統(tǒng)發(fā)育分析從蓮瓣蘭大雪素中獲得與蘭花開花相關(guān)的FT基因。因此，從蓮瓣蘭大雪素分離與開花時(shí)間有關(guān)的FT基因，研究其在促進(jìn)蓮瓣蘭大雪素開花過程中的作用是非常必要的，這對(duì)闡明蓮瓣蘭大雪素開花機(jī)制有一定的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為蓮瓣蘭大雪素(Cymbidiumtortisepalum)，主產(chǎn)于滇西[7]。它盛開在元旦春節(jié)期間，花枝高挺出架，花朵潔白，具有暗香。

1.2 必要培養(yǎng)液的配置

200 mL LB培養(yǎng)液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl(pH=7)，若配制固體培養(yǎng)基則加3 g瓊脂。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

計(jì)算機(jī)、PCR儀、電泳槽、離心機(jī)、振蕩床、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、滅菌鍋、烘箱、移液設(shè)備、容器、刮子等。

1.4 RNA的提取

選用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取大雪素花器官的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。

1.5 特異性引物設(shè)計(jì)

3′-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

FT-F 5-TTCACTTAAATTCTCTCCAGCC-3

FT-R 5-CTATCTGAATAATTAAAAGACCTTG-3

1.6 cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進(jìn)行。3’SMART-RACE PCR加入以下試劑于滅菌的PCR反應(yīng)管中：Total RNA, 2μg；10×Advantage PCR Buffer,5μL;dNTP mix(10 mmol/L), 4μL;Primers (10μmol/L),各0.75μL; Advantage 2 Polymerase Mix,2μL;ddH2O 17.75μL?；旌弦陨显噭虝弘x心，將反應(yīng)管放在預(yù)熱的PCR儀上，按下列程序進(jìn)行循環(huán)：

35的循環(huán)；94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,55 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞。

循環(huán)結(jié)束后，取5μL 樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)合成情況。

1.7 電泳檢測(cè)，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，克隆方法參照文獻(xiàn)[8]，隨機(jī)篩選白色菌落，送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 FT 基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列

1.8 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用Blast在NCBI中搜索，利用CLUSTAL-x和MEGA-5軟件進(jìn)行分析[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE克隆蓮瓣蘭大雪素(Cymbidium tortisepalum)FT基因的全長(zhǎng)

用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法獲得了FT基因的序列,在NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/database中進(jìn)行功能預(yù)測(cè)是FT的 5′端序列。為了進(jìn)一步研究這些基因的功能及表達(dá)特性，克隆了全長(zhǎng)序列cDNA。對(duì)蓮瓣蘭大雪素不同發(fā)育時(shí)期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合樣品進(jìn)行Total RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳方法監(jiān)測(cè)RNA的質(zhì)量；以Total RNA為模板，按照RACE試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到3′端和5′端cDNA模板, 對(duì)3′端的cDNA模板進(jìn)行特異引物和Outprimer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得3′端片段，然后5′端與3′ 端的序列進(jìn)行拼接，在5′和3′端設(shè)計(jì)特異引物，再一次進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的克隆，對(duì)菌液PCR進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序，獲得了這個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA。這個(gè)基因cDNA 全長(zhǎng)為 662 bp, 包含1個(gè)長(zhǎng)為34 bp的5′UTR和103 bp的3′UTR非翻譯區(qū)，具有完整的開放閱讀框 (ORF) 522 bp, 編碼173氨基酸的蛋白質(zhì)，如圖1。從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的FT基因。

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

用ClastalX[9]對(duì)從蓮瓣蘭大雪素中克隆的FT基因與GenBank下載的有關(guān)FT的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)齊，從蓮瓣蘭大雪素中分離出來與促進(jìn)植物開花的基因FTcDNA全長(zhǎng)為662 bp，包含有編碼框和3′UTR,具有完整的開放閱讀框 (ORF) 522 bp, 編碼173氨基酸的蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)與其他的FT基因一樣，在其第2個(gè)外顯子的85位上的氨基酸為保守的酪氨酸，是對(duì)于FT的激活時(shí)必要的；另外還有一個(gè)非常重要的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是具有14個(gè)氨基酸的P-loop domain,這2個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域是PEBP蛋白家族很普遍(如圖2)。

從全長(zhǎng)FTcDNA序列和蛋白質(zhì)，與其它已經(jīng)基因進(jìn)行基因序列和蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，對(duì)開花起重要作用的基因家族之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。分別用Maximum likelihood (ML) tree構(gòu)建的系統(tǒng)樹分析的結(jié)果。用ClastalX[8]對(duì)在蓮瓣蘭大雪素克隆的FT基因與GenBank下載的有關(guān)的FT的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)齊，以及用 MEGA version 5.0[10]對(duì)齊輸出。A Maximum Likelihood (ML) tree方法構(gòu)建樹。在P-distance model下估計(jì)遺傳距離。ML樹的構(gòu)建來自500 bootstrap replicates。用ML法對(duì)來自于蓮瓣蘭大雪素的FT基因進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，從圖3可看出，蓮瓣蘭大雪素的FT基因與從大豆和小果野蕉中分類出來的FT基因聚為一枝,支持率為67%，但并不與來自于蘭科的FT蛋白聚為一枝，從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的FT基因并沒有與其他蘭花中分離出來的基因具有支持率(圖3)。

圖2 FT蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的比較

圖3 FT 基因的進(jìn)化分析

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以蓮瓣蘭大雪素作為材料，分離出FT基因，通過RACE方法快速克隆出全長(zhǎng)cDNA，獲得全長(zhǎng)約為662 bp的cDNA，通過測(cè)序分析，確定該基因?yàn)?22 bp的全長(zhǎng)cDNA序列，共編碼173個(gè)氨基酸。將獲得的序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blastx分析,發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)榫幋a磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)的基因家族成員中的FT，并具有極高的保守性。

PEBP在進(jìn)化上相當(dāng)保守的蛋白家族，但許多基因的功能還不清楚。一般認(rèn)為PEBP家族基因是植物開花的主要調(diào)節(jié)者[10]。PEBP家族基因由FT-LIKE、MFT-LIKE、TFL-LIKE 3個(gè)亞家族組成，F(xiàn)T基因?qū)儆谄渲械腇T-LIKE亞家族。

從營養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的成花轉(zhuǎn)變是植物適應(yīng)外界環(huán)境，確保物種和個(gè)體繁衍的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成花轉(zhuǎn)變的時(shí)間受內(nèi)部和外部環(huán)境信號(hào)的調(diào)控。在各種環(huán)境信號(hào)中，光周期信號(hào)可促使植物在最適季節(jié)開花。在光周期途徑中，對(duì)光和晝夜的反應(yīng)最終導(dǎo)致CO基因的激活，CO基因進(jìn)一步激活葉片中的FT基因，F(xiàn)T蛋白通過韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸，從葉片中達(dá)到植物的頂端分生組織，再在頂端分生組織與FT結(jié)合，進(jìn)一步激活下游的基因，從而控制開花。

控制開花的途徑除光周期外，還有春化、GA、自主調(diào)節(jié)途徑。這些開花調(diào)控途徑間彼此相互作用，構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但它們最終匯集于被稱為“開花整合因子”的開花調(diào)控基因FT、SOC1 (SUPPRESSOROFOVEREX-PRESSIONOFCO1)和LFY(LEAFY)。其中，F(xiàn)T的表達(dá)除受光周期途徑的調(diào)控外，還部分地受春化和自主途徑的調(diào)控，表明FT是一植物開花調(diào)控途徑的重要整合因子。

FT是光周期途徑促進(jìn)開花的關(guān)鍵基因，已有很多植物中分離和克隆了FT基因并進(jìn)行了研究，如長(zhǎng)日照植物擬南芥、金魚草等，短日照植物水稻、大豆等，日中性植物番茄等，并通過轉(zhuǎn)基因證明FT基因的表達(dá)可促進(jìn)植物提早開花，并發(fā)現(xiàn)FT家族基因的結(jié)構(gòu)和功能在不同物種間存在著高度的保守性[11-12]。FT基因的研究已取得了很大的進(jìn)展，但仍然存在很多問題有待深入研究。例如，開花素基因FT蛋白是如何完好無損地從葉片傳輸?shù)巾敹朔稚M織的；同一植物體內(nèi)同時(shí)存在多個(gè)拷貝FT同源基因時(shí)，它們之間如何協(xié)同合作等問題。所有問題若能得到解決，將不僅有助于深入了解FT基因控制植物開花時(shí)間的分子機(jī)制，而且對(duì)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行觀賞植物花期調(diào)控具有重要的理論指導(dǎo)意義。

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Isolation and Phylogenetic Analysis of aFTGene fromCymbidiumtortisepalum

HEWei1,2,ZHAOJing1,ZHAOYinhe1,WANGYunyue1
(1.College of Agronomy and Biotechnology and Engineering Center，Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Guandu No.5 High School of Kunming,Kunming Yunnan 650011,China)

There are photoperiod, GA, vernalization, and independent pathways to control plant flowering.COgene promotes flowering through regulatingFT(FLOWERINGLOCUST)andSOC1(SUPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1) genes expression directly in the photoperiod pathway.FTis considered that it is a key gene to regulate flowering time in pathway,and its expression productions are flowering stimulating substances for a long time.The kind of flowering stimulating substances transport from leaves to the top of stems,and ultimately causes flowering.Using rapid amplification of cDNA ends (RACE),FTgene was cloned quickly.Bioinformatics analysis showed that the full length was 662 bp,with the open reading frame (ORF) of this gene was 522 bp，encoding 173 amino acids.We obtained theFTgene fromCymbidiumtortisepalumwith phylogenetic analysis.It is the basic for further study of this gene function.

floral organ；Cymbidiumtortisepalum；FTgene clone； phylogenetic analysis

2016-04-11

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：NSFC 31060166 and NSFC 31460053)和云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金(編號(hào)：2012 HB 018)資助。

何 衛(wèi)(1981—)，男，博士研究生，主要從事植物學(xué)遺傳學(xué)研究。

趙銀河(1967—)，女，副教授，遺傳學(xué)博士，主要從事發(fā)育生物學(xué)研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.009

S 682.31

A

1001-4705(2016)08-0009-05