努爾孜亞，管建華，賈培松，魏鵬，羅影，賈文捷，郝敬吉吉，3

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2. 青河縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆青河 836200；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

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一株抗木霉菌解淀粉芽孢桿菌的篩選與鑒定

努爾孜亞1，管建華2，賈培松1，魏鵬1，羅影1，賈文捷1，郝敬吉吉1，3

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2. 青河縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆青河 836200；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

【目的】將一株從阜康市食用菌栽培基地棉籽殼發(fā)酵料中的分離得到的芽孢桿菌FKB-1，依據(jù)形態(tài)學(xué)與16S rDNA序列比對(duì)明確其分類地位?！痉椒ā坎捎脤?duì)峙平板法進(jìn)行初篩、復(fù)篩，然后利用抑菌圈法測定抑菌效果，并鏡檢菌絲生長情況。通過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化及16S rDNA 基因序列對(duì)比分析研究其分類地位?！窘Y(jié)果】生防細(xì)菌FKB-1對(duì)綠色木霉菌具有穩(wěn)定的抑菌效果，抑菌直徑率達(dá)57%；同時(shí)16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果顯示其為解淀粉芽孢桿菌。【結(jié)論】FKB-1是一株抗木霉菌的生防解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌；綠色木霉菌；抑菌作用；生理生化

0 引 言

【研究意義】 蘑菇綠霉病又稱木霉病，可對(duì)阿魏蘑菇、雙孢蘑菇等多種食用菌菌絲與子實(shí)體造成危害，木霉是一類普遍存在的真菌，常見于土壤中，是土壤微生物的重要群落，也見于植物殘?bào)w及動(dòng)物糞便上，從植物根圍，葉圍及種子、球莖表面經(jīng)?？梢苑蛛x到[1-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】木霉可侵染阿魏蘑菇、雙孢蘑菇、香菇、銀耳、杏鮑菇、毛木耳、靈芝等多種食用菌，各種食用菌的菌種、菌筒、栽培料和子實(shí)體上均可發(fā)病，如阿魏菇受害后菌柄和菌蓋背面變褐腐爛，病部產(chǎn)生綠色霉層；食用菌早期染病的子實(shí)體萎縮不長，后期感染的子實(shí)體逐漸腐爛，產(chǎn)量損失巨大[4]。常見的病原菌是綠色木霉菌(TrichodermaviridePers.)。廣泛存在于阿魏蘑菇等食用菌生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)，是食用菌生產(chǎn)和袋料栽培的一種重要的競爭性病害。其分解纖維素能力強(qiáng)，不僅與阿魏菇等蘑菇爭奪營養(yǎng)，而且還分泌毒素影響蘑菇菌絲的定植及子實(shí)體的形成。分生孢子通過氣流、水滴、昆蟲等傳播擴(kuò)散，高溫高濕有利該病害的發(fā)生[5]。防治綠霉病傳統(tǒng)的主要方法是培養(yǎng)料中拌入化學(xué)藥劑。但是這種方法不僅帶來環(huán)境污染，同時(shí)也威脅著人類健康。隨著化學(xué)農(nóng)藥的使用，病原菌抗藥性不斷增加，使防效降低。近年來。生物農(nóng)藥具有成本低，無污染，無殘留，不產(chǎn)生抗藥性等與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比較的優(yōu)點(diǎn)[6]，被廣大生產(chǎn)者認(rèn)同?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于生防菌株的研究主要是生防細(xì)菌包括芽孢桿菌、土壤放射桿菌、假單孢桿菌等。芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)抑菌廣譜性強(qiáng)，對(duì)炭疽病(Anthracnose.spp )[7]、青霉病(Penicilliumitalicum)[8]、柑桔青霉菌(Penicilliumdigitatum)[9]等都有抑制作用，因此在生物防治中有廣闊的應(yīng)用前景?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究室從阿魏蘑菇培養(yǎng)料中采用抑菌實(shí)驗(yàn)法篩選鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌。利用對(duì)峙平板法，菌絲鏡檢等證明其抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

FKB-1篩選自阜康市魚兒溝3隊(duì)阿魏蘑菇栽培基地棉籽殼發(fā)酵料中。

木霉病菌株(T.viride),由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(固體)：胰化蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL ，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基(固體)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2 方 法

1.2.1 菌株初篩

將1 g棉籽殼加入100 mL 蒸餾水中，制備懸濁液，分別稀釋獲得濃度為10-6，10-7，10-8(W/V)的樣品溶液，分別移取0.1 mL 涂布于固體初篩培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株復(fù)篩

以對(duì)峙平板法復(fù)篩[10]，從上述初篩平板上挑取形態(tài)不同的菌落在木霉病菌瓊脂塊的一側(cè)劃線，以不劃線的作為對(duì)照組，培養(yǎng)4 d , 測其抑菌率。

抑菌率(%)=[(對(duì)照組木霉菌直徑-處理木霉菌直徑)/對(duì)照組木霉菌直徑]×100%。

1.2.3 形態(tài)學(xué)特性

將有抑菌效果的菌株接種于固體初篩培養(yǎng)基平板中，27℃培養(yǎng)，觀察單菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)特征。采用革蘭氏染色法，觀察菌體形狀、革蘭氏染色反應(yīng)。

1.2.4 生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》等相關(guān)內(nèi)容[11-13]，菌株對(duì)應(yīng)生理生化進(jìn)行驗(yàn)證。測定項(xiàng)目包括：革蘭氏染色，生長溫度測定，甲基紅，淀粉水解，明膠液化，厭氧性測定，葡萄糖、甘露醇產(chǎn)酸，V-P測定，過氧化氫酶，氧化酶, 菌落顏色等。

1.2.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用酚氯仿抽提法提取菌株的DNA。以16S rDNA 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Forward primer P1(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)；Reverse primerP2(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系25 uL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.0 uL，MgCl22 mmol/L,dNTPs 400 mmol/L,ITS4,ITS5為0.8 umol,模版DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶1U。PCR反應(yīng)條件：105℃預(yù)熱，94℃ 5 min；94℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min, 擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。檢測后送北京鼎國公司測序。PCR 產(chǎn)物測序，與NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)[9]，并以MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

拮抗菌FKB-1的鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]及《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[16]的方法對(duì)拮抗菌F1 的菌體形態(tài)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定及16S rDNA 測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

在營養(yǎng)瓊脂板上菌落為圓形，乳白色，表面初始光澤，幾天后變?yōu)轳薨櫍吘壜N起。平板中可獲得直徑為5 mm 的菌落，如圖1(A)。通過革蘭氏染色驗(yàn)證為革蘭氏陽性，菌體呈現(xiàn)橢圓形，兩端紫色，中間較透明，如圖1(B)(10×100oil)。圖1

圖1 FKB-1菌落形態(tài)及菌體革蘭氏染色

2.2 抑菌效果驗(yàn)證

2.2.1 抑菌效果的平板驗(yàn)證

通過對(duì)峙平板法檢驗(yàn)FKB-1的抑菌效果，其抑菌率為57%。圖2

圖2 FKB-1對(duì)木霉菌的抑菌效果

2.2.2 抑菌效果的鏡檢

研究表明，正常菌絲(B)粗壯，孢子濃密，有明顯的孢子束。受抑制的菌絲(A)出現(xiàn)彎曲、褶皺、斷裂、畸形等現(xiàn)象，且沒有孢子囊和孢子束。因細(xì)胞膜通透性的增加，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)外流，使菌絲明顯變細(xì)，并影響染色效果。圖3

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化結(jié)果

FKB-1的部分生理生化特征表現(xiàn)為，菌株不能厭氧生長，生長溫度范圍5～50℃，最適生長溫度30～37℃。甲基紅反應(yīng)陰性，V-P反應(yīng)陰性。能分解葡萄糖、甘露醇、水解淀粉、明膠等。過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性，革蘭氏染色呈陽性，菌落乳白色。表1

圖3 FKB-1對(duì)木霉菌菌絲作用顯微形態(tài)(10×40)

2.3.2 FKB-1菌株的16S rDNA鑒定

FKB-1菌株經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增的16S rDNA序列全長1 190 bp。將序列提交GenBank經(jīng)與GenBank中相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株FKB-1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的DNA 重合率100%同源性達(dá)到99%。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，供試菌16S rDNA與解淀粉芽孢桿菌親緣最近。鑒定結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacien)。表1，圖3～5

圖4 FKB-1菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

特征CharacteristicsFKB-1特征CharacteristicsFKB-1厭氧生長Anaerobiccondition-生長溫度/℃Growthtemperature5～50℃-甲基紅M．Rreaction-V-P反應(yīng)V-Preaction-葡萄糖產(chǎn)酸Acidroductionfromglucose+甘露醇產(chǎn)酸AcidproductionfromMannito+淀粉水解Starchhydrolysis+明膠液化試驗(yàn)Glutinhydrolysis+過氧化氫酶Peroxidase+氧化酶Oxidase-革蘭氏染色Grams-staining陰性(G-)陽性(G+)G+菌落顏色Colorofcolony乳白色

注：“ + ”陽性反應(yīng)(表示存在或有反應(yīng)) ,“ - ”陰性反應(yīng)(表示不存在或無反應(yīng))

Note:“ + ”Positive ( show existence or reaction) ， “ -”Negative ( show no existence or no reaction)

表2 FKB-1菌株同源性分析

圖5 FKB-1菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討 論

自Baker 等1965 年提出生物防治土傳病害以來，關(guān)于利用生防菌防治植物生長病害的報(bào)道屢見不鮮[17]。相對(duì)于食用菌競爭性雜菌綠色木霉菌生物有抑制作用的生防細(xì)菌的報(bào)道相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)室從阜康市篩選出一株對(duì)綠色木霉病的拮抗菌。通過形態(tài)學(xué)、16S rDNA 鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。根據(jù)抑菌效果推測，解淀粉芽孢桿菌可分泌多種抑菌物質(zhì)，引致綠色木霉菌菌絲的細(xì)胞壁改變結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)外流，使受抑制的木霉病菌絲無法完成菌絲生長、孢子萌發(fā)等代謝過程，最終死亡。

芽孢桿菌作為生防細(xì)菌的重要組成部分，解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)理復(fù)雜，利用生防菌防治植物病害，不但要考慮生防菌對(duì)病原菌的抑制作用，而且還要考慮生防菌在農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中的生存能力[18]。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣闊。同時(shí)能夠?qū)Χ喾N真菌與細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產(chǎn)物。 因此在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以適當(dāng)?shù)拇鎮(zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥。同時(shí)，隨著分子研究技術(shù)的提高．解淀粉芽孢桿菌的基因功能更多地被了解，增加可應(yīng)用的可行性。

4 結(jié) 論

采自阜康市棉籽殼基料中，利用對(duì)峙平板法篩選出的一株對(duì)木霉病有拮抗作用的芽孢桿菌FKB-1菌株。通過形態(tài)學(xué)鑒定與主要生理生化指標(biāo)測定結(jié)合16S rDNA檢測，該菌株菌落為圓形，乳白色，表面初始光澤，幾天后變?yōu)轳薨?，通過革蘭氏染色驗(yàn)證為革蘭氏陽性，菌體呈現(xiàn)橢圓形，兩端紫色，中間較透明。擴(kuò)增的16S rDNA序列全長1 190 bp，同源性比對(duì)認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌。抑菌圈法的結(jié)果顯示，其對(duì)綠色木霉菌的抑菌率為57%，鏡檢菌絲可以觀察到受抑制的菌絲出現(xiàn)彎曲、褶皺、斷裂、畸形等現(xiàn)象，且沒有孢子囊和孢子束。因細(xì)胞膜通透性的增加，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)外流，使菌絲明顯變細(xì)，并影響染色效果。證明其有良好的抑菌效果。

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Fund project:Supported by The Construction Project of Science and Technology Infrastructure in Xinjiang Uygur Autonomous Region "The wild Germplasm Resources and Genetic Diversity of Pleurotus Preservation Research Platform Construction" (PT1505)and Special Funds for National Modern Agriculture Industry Technology System Construction (CARS-24)

Screening Identification of Bacillus amyloliquefaciens Resisting to Trichoderma Viride

Nuerziya1, GUAN Jian-hua2, JIA Pei-song1, WEI Peng1, LUO Ying1,JIA Wen-jie1, HAO Jing-zhe1 ,3

(1.Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Oasis, MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；2.QingheCountyAgriculturalTechnologyExtensionStation,QingheXinjiang836200，China; 3.CollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

【Objective】 In order to study the bio-control bacteria FKB-1 screened from cottonseed hull of the Experimental Station of edible fungus in Fukang City. Morphological and 16S rDNA sequence alignment were used to identify its species.【Method】he plate-confrontation method and antibacterial circle method were used for preliminary screening and antimicrobial testing in vitro, respectively. Meanwhile, we identified its species by physiological and biochemical characteristics, as well as 16S rDNA gene sequence alignment.【Result】FKB-1 showed a stable inhibitory effect againstTrichodermavirideand inhibition zone diameter was 57%. This bacterium was identified asBacillusamyloliquefaciens.【Conclusion】FKB-1 was a kind of bacillus amyloliquefaciens with bio-control to Trichoderma viride.

Bacillusamyloliquefaciens;Trichodermaviride; inhibition effect; physiological and biochemical characteristics

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.017

2016-03-15

野生阿魏菇種質(zhì)資源保藏與遺傳多樣性研究平臺(tái)建設(shè)(PT1505)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-24)

努爾孜亞(1977-)，女，新疆伊犁人，助理研究員，研究方向?yàn)榘⑽汗椒N質(zhì)資源保藏與病蟲害防控，(E-mail)823037554@qq.com

郝敬喆(1970-)，男，新疆烏魯木齊人，副研究員，研究方向?yàn)樵O(shè)施食用菌栽培病蟲害防控，(E-mail)urmqhjz@163.com

S182

A

1001-4330(2016)07-1297-06