張俊苗，李文勝，曹倩，史進(jìn)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

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短枝條紅型紅富士蘋果芽變的ISSR鑒定

張俊苗，李文勝，曹倩，史進(jìn)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

【目的】利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對選擇的富士芽變優(yōu)系和12個蘋果品種為材料進(jìn)行分子鑒定，構(gòu)建指紋圖譜，并且根據(jù)聚類分析的結(jié)果確定這13個蘋果品種的親緣關(guān)系?！痉椒ā繌?00條ISSR引物中對供試樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，采用NTSYSpc2.10t軟件根據(jù)Nei’s遺傳相似系數(shù)采用UPGMA法進(jìn)行聚類，此分析親緣關(guān)系，并采用POPGENE1.32軟件計算多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性點百分率，最終篩選出條帶清晰、多態(tài)性較高、穩(wěn)定且重復(fù)性好的引物?！窘Y(jié)果】從100個ISSR引物中篩選出3個多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，分別為UBC846、UBC881和UBC899，共在57個位點擴(kuò)增出條帶，其中50個為多態(tài)性位點，平均多態(tài)性位點百分率為86.11%。利用3條多態(tài)性ISSR引物構(gòu)建的數(shù)字化指紋能夠有效地區(qū)分出所有供試材料，且建立了13個蘋果品種的親緣關(guān)系聚類圖，這13個品種的相似系數(shù)的變化范圍在0.67～0.82，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。【結(jié)論】ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地用于蘋果種質(zhì)資源評價、指紋圖譜的構(gòu)建和蘋果芽變品種的鑒定，為蘋果的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性檢測和栽培育種提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

紅富士蘋果；芽變；ISSR鑒定

0 引 言

【研究意義】DNA指紋圖譜技術(shù)是通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來診斷生物內(nèi)在基因排布規(guī)律及其外在的表現(xiàn)規(guī)律[1]。由于直接以DNA的形式表現(xiàn)，其差異體現(xiàn)的是不同的基因型差異，因而更加準(zhǔn)確、客觀，因此是目前應(yīng)用最為廣泛的指紋圖譜技術(shù)[2]。近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為在DNA分子水平上鑒定蘋果品種提供了強(qiáng)有力的工具[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ISSR(inter-simple sequence repeats)標(biāo)記是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)[4]，具有多態(tài)性高、共顯性、操作簡便、穩(wěn)定性好和重復(fù)性高等特點[5]，是一種可靠、快捷的分子標(biāo)記技術(shù)，可用于大規(guī)模DNA指紋分析，在果樹種質(zhì)鑒定中發(fā)揮著重要的作用[6]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已成功用于梨[7]、李[8]、核桃[9]、葡萄[10]、棗[11]、杏[12]、柑橘[13]和蘋果[14]等果樹的品種鑒定、遺傳多樣性或指紋圖譜構(gòu)建等研究報道。宣繼萍等[14、15]以富士蘋果為材料對ISSR反應(yīng)體系中的主要影響因子的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行了探索，建立了適合于蘋果的ISSR反應(yīng)體系，并用兩個引物將7個品種區(qū)分開來，初步證明利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能很好地將不同蘋果品種鑒別出來；郭長奎等[16]用一個引物就將17個蘋果品種清楚地鑒別出，表現(xiàn)出ISSR分子標(biāo)記在品種鑒定和親緣關(guān)系分析中的穩(wěn)定性和可行性?！颈狙芯壳腥朦c】短枝條紅型芽變的ISSR鑒定研究文獻(xiàn)較少，利用以優(yōu)化好的ISSR反應(yīng)體系，對12個蘋果品種和芽變優(yōu)系構(gòu)建ISSR指紋圖譜，并進(jìn)行親緣關(guān)系分析，該芽變優(yōu)系經(jīng)觀察鑒定表明其生物學(xué)性狀和主要經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定，是一個綜合性狀優(yōu)良的短枝條紅型的變異材料。【擬解決的關(guān)鍵問題】選用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探討蘋果在DNA水平上的差異，尋找不同蘋果品種的DNA特征譜帶，分析其種質(zhì)資源遺傳多樣性，為新品種的選育提供理論依據(jù)，為種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料于2015年4月采自新疆阿克蘇地區(qū)紅旗坡農(nóng)場蘋果果園內(nèi)，共13個品種：藤牧一號、青香蕉、紅元帥、金冠、嘎啦、新紅星、新世紀(jì)、天紅2號、長富2號、富士芽變優(yōu)系、樂樂、早熟富士、新紅1號。材料均采于春季嫩梢萌動時期，采幼嫩健康無病斑的幼嫩葉片，置于盛有硅膠的自封袋中干燥，搖動使葉片與硅膠充分均勻接觸，干燥過程中一旦發(fā)現(xiàn)硅膠從深藍(lán)色變成粉紅色時必須及時更換，將干燥好的材料帶回實驗室室溫保存即可。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取

基因組DNA的提取采用CTAB法[17]，稍有改進(jìn)，將濃度稀釋到50 ng/μl，置于-20℃保存?zhèn)溆?。?.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量和濃度。

1.2.2 引物篩選及擴(kuò)增反應(yīng)

PCR擴(kuò)增選用的引物根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，PAGE純化。對13個供試樣品進(jìn)行引物篩選，最終篩選出條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性較好的3個引物，其編號分別為UBC846、UBC881、和UBC899。

基本反應(yīng)體系參照郭長奎[16]對17個蘋果品種進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增時優(yōu)化的體系，最終體系為：總體積為25 μL，含有雙蒸水18.3 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，DNA模板50 ng，引物1 μL(濃度為10 mmol/L)，dNTPs2μL(濃度為2.5 mmol/L)，TaqDNA酶0.2 μL(濃度為5 U/μL)。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；54.2℃退火(因不同引物而定)45 s；72℃延伸2 min，反應(yīng)40個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

電泳及拍照：將制好的2%的瓊脂糖凝膠浸入裝有的緩沖液的電泳槽中，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。其電極緩沖液為1×TAE溶液，電壓為120V，30～40 min；電泳結(jié)束后放入EB染色液中10 min，最后在紫外投射凝膠的成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對ISSR電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，按照DNA marker DL2000(100～2 000 bp)相同相對分子質(zhì)量片段的有無進(jìn)行統(tǒng)計。

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，選取穩(wěn)定性、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計分析。電泳圖譜的每個DNA片段，為一個分子標(biāo)記，代表一個引物的結(jié)合位點。根據(jù)凝膠上相對分子質(zhì)量相同片段的有無進(jìn)行人工統(tǒng)計，擴(kuò)增出條帶的記1，沒有擴(kuò)增出條帶的記0，從而得到由1和0組成的二元數(shù)據(jù)的矩陣。采用POPGENE version1.32軟件計算每個引物的多態(tài)性位點百分率和多態(tài)性位點百分?jǐn)?shù)；相似系數(shù)及遺傳距離用NTSYSpc2.10t軟件計算，并以加權(quán)類平均法UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建各個品種的樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽變材料的鑒定與擴(kuò)增多態(tài)性

從100個引物中篩選出3條引物的擴(kuò)增結(jié)果表明，共擴(kuò)增出57個位點，其中有50個多態(tài)性位點，引物的多態(tài)性點的百分率為73.33%～100%，平均多態(tài)性點百分率高達(dá)86.11%，擴(kuò)增片段大小在200～2 000 bp范圍內(nèi)。每個ISSR引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為15～22條，平均每條引物擴(kuò)增出16.67個多態(tài)性條帶，表現(xiàn)出所選的3個引物適于蘋果品種之間遺傳多樣性的分析和指紋圖譜的標(biāo)記。其中引物899擴(kuò)增出多態(tài)性條帶最多，為22個，多態(tài)性位點百分率最高，為100%；其次是引物846，多態(tài)性位點百分率為85.00%；引物881的多態(tài)性百分率相對較低為73.33%。引物899、引物846和引物881對13個蘋果品種的擴(kuò)增結(jié)果，并能夠清楚地將富士芽變材料和長富2號區(qū)別開。引物899擴(kuò)增結(jié)果中長富2號在擴(kuò)增片段大小950 bp，850 bp左右比芽變優(yōu)系各多一條譜帶；引物846擴(kuò)增結(jié)果中長富2號在擴(kuò)增片段大小600 bp左右比芽變優(yōu)系多一條譜帶；而引物881擴(kuò)增結(jié)果中長富2號在1 800 bp擴(kuò)增出清晰條帶，芽變優(yōu)系沒有擴(kuò)增出對應(yīng)的條帶；這3個引物芽變優(yōu)系和長富2號擴(kuò)增的條帶差異較明顯，證明芽變材料發(fā)生了較明顯的遺傳變異。表1，圖1-3

圖1 引物899在13份蘋果品種的擴(kuò)增圖譜

M：DNA Marker DL2000；1藤木一號；2青香蕉；3早熟富士；4新世紀(jì)；5新紅1號；6新紅星；7金冠；8嘎啦；9天紅2號；10樂樂；11紅元帥；12長富2號；13富士芽變優(yōu)系。下同

M：D2000Marker；1：Mato 1#; 2:Green banana; 3:Early fuji; 4:Xinshiji; 5:Xinhong1#; 6:Starkrimson; 7:Golden Delicious; 8:Gala; 9:Tianhong2#; 10:Lele; 11:Red delicious; 12:Nagafu2#; 13:Bud sports，the same as below.

圖2 引物846在13份蘋果品種的擴(kuò)增圖譜

圖3 引物881在13份蘋果品種的擴(kuò)增圖譜

2.2 ISSR指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)引物846、引物881和引物899對13份供試蘋果的擴(kuò)增圖譜中條帶的有無或缺失用0和1進(jìn)行數(shù)字化賦值，構(gòu)成一個數(shù)字化的指紋圖譜。列出了由3個引物擴(kuò)增出的13個品種的數(shù)字指紋圖譜，可以看出根據(jù)品種間的數(shù)字指紋譜的不同，將13個品種完全區(qū)分開來。表2

2.3 親緣關(guān)系

利用3條ISSR引物的標(biāo)記信息計算出材料間的遺傳系數(shù)和遺傳距離，得到各品種間的遺傳相似系數(shù)介于0.67～0.82存在顯著地遺傳變異，平均相似系數(shù)為0.746，其中芽變優(yōu)系和長富2號的遺傳相似系數(shù)最高為0.82。基于UPGMA法構(gòu)建的樹狀聚類圖顯示，在相似系數(shù)為0.67時，所有供試品種被分為兩大類群，藤牧一號單獨為一類；當(dāng)相似系數(shù)為0.71時，供試品種可以分為3個主要類群，第二類群為雜類有：青香蕉、紅元帥、新紅星、金冠和嘎啦等5個品種；第三類群為富士類有：早熟富士、新世紀(jì)、新紅1號、天紅2號、樂樂、長富2號和芽變優(yōu)系等7個品種。當(dāng)相似系數(shù)為0.75時，第二類群又可分為兩部分，金冠和嘎啦為一部分，青香蕉、紅元帥和新紅星為一部分。圖4

表1 3個ISSR引物對13個供試蘋果品種擴(kuò)增

研究聚類結(jié)果與實際蘋果品種間的親緣關(guān)系基本相同。張傳峰[18]研究表明天紅2號的親本是長富2號；郭長奎等[16]研究表明新紅1號是長富2號的芽變品種，故天紅2號和新紅1號被聚在一起，相似系數(shù)為0.794。嘎啦是由元帥系的紅基橙×金冠雜交而成，因此金冠和嘎啦被聚在一起，且遺傳相似系數(shù)為0.774，顯示出比較近的親緣關(guān)系[19]。當(dāng)相似系數(shù)為0.71時，第二類為富士類被分在一起，主要原因是這些品種都是由富士系芽變而來的，與富士有直接或間接的血緣關(guān)系，具有相同的遺傳背景。但有些品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)卻有極相似的帶型，如不屬于元帥系的青香蕉卻被聚在一起，可能是由于所用特異性引物不夠多。當(dāng)相似系數(shù)為0.794時青香蕉和元帥系的紅元帥被聚類在一起，而新紅星屬于元帥系的芽變品種[19]，和紅元帥的遺傳相似系數(shù)為0.758，表明較近的品種間也存在復(fù)雜的遺傳多樣性，可能與自身品種在芽變過程中基因組發(fā)生較大的變化。表2，圖4

表2 UBC846、UBC881和UBC899對13份蘋果品種的特異性指紋

圖4 13份蘋果品種的UPGMA聚類樹狀圖

3 討 論

果樹種質(zhì)資源的鑒定和評價對于育種親本選擇、豐富遺傳基礎(chǔ)以及種質(zhì)資源合理開發(fā)利用等方面都是非常重要的。但由于基因型與環(huán)境互作使以往根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、染色體核型、同工酶標(biāo)記等鑒定分類方法受到了很大的限制。而DNA分子標(biāo)記中的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具備高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境及主觀因素影響等特點。研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對構(gòu)建的13個蘋果品種的指紋圖譜進(jìn)行了分析，從100個引物中篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好的且對品種具有較高鑒別力的UBC846、UBC881、UBC899共3個引物。而引物899的擴(kuò)增結(jié)果中，長富2號在分子大小950 bp，850 bp左右擴(kuò)增出清晰的條帶，而富士芽變優(yōu)系沒有擴(kuò)增出對應(yīng)的條帶；引物846中長富2號在擴(kuò)增片段大小600 bp左右比芽變優(yōu)系多一條譜帶；引物881中長富2號在片段大小為1 800 bp左右擴(kuò)增出清晰條帶，都說明短枝型芽變優(yōu)系與長富2號相比發(fā)生了較明顯的遺傳變異，且利用篩選出的3個引物構(gòu)建的聚類樹狀圖表明芽變優(yōu)系與長富2號的遺傳相似系數(shù)最高，親緣關(guān)系最近；這與郭長奎等[16]的研究結(jié)果一致，用一個引物證明長富2號在1 200 bp處比富士芽變優(yōu)系明顯多一個特異擴(kuò)增帶，說明富士芽變優(yōu)系較長富2號發(fā)生了較明顯的遺傳變異。吳亞維等[20]用ISSR分子標(biāo)記證明短枝芽變材料在210 bp擴(kuò)增出清晰條帶，而紅富士母本在此位點沒有明顯的條帶，表明短枝型芽變材料在DNA水平上發(fā)生了穩(wěn)定的變異。研究涉及的富士芽變優(yōu)系性狀之一主要表現(xiàn)在枝條節(jié)間變短，在目前和將來短枝型品種是芽變選種的重要目標(biāo)之一。宋楊[21]研究認(rèn)為，蘋果短枝型芽變‘龍富短枝’的GA20ox和KO的下調(diào)表達(dá)使植物體內(nèi)GA含量降低，可能是枝條變短的主要原因，排除由于基因編碼區(qū)的堿基突變、缺失、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入而導(dǎo)致的短枝型芽變。因此對該芽變初選優(yōu)系進(jìn)一步探討短枝型芽變形成的機(jī)理和對芽變的分子機(jī)制的認(rèn)識還有待深入，對蘋果品種遺傳改良具有重要意義。

根據(jù)供試蘋果品種樹狀圖的構(gòu)建，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)譜系的親緣關(guān)系基本相同。但在相似系數(shù)為0.794時紅元帥和青香蕉聚在一起，可能的原因是檢測的位點較少，不能完全代表整個基因組的情況，范付華等[22]在用ISSR分子標(biāo)記對23個水稻品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析時也出現(xiàn)過同樣的情況。因此ISSR分子標(biāo)記方法雖然是一種多態(tài)性高、重復(fù)性好的指紋圖譜的構(gòu)建方法，但由于它也是一種基于PCR的分子標(biāo)記，對反應(yīng)條件較敏感，所以必須保持嚴(yán)格一致的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序才能保證結(jié)果的可靠性[23]，如果能與品種的染色體核型、同工酶標(biāo)記等互為補(bǔ)充，則可以更好地為蘋果的管理、保護(hù)及品種登錄提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對13個蘋果品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析和分類，品種間的遺傳相似系數(shù)幅度變化較大，變化范圍在0.67～0.82，同時通過3條引物擴(kuò)增的譜帶可準(zhǔn)確地將13個蘋果品種鑒別出，并從DNA分子水平上證實了富士短枝型芽變優(yōu)系與長富2號相比發(fā)生了較明顯的遺傳變異，結(jié)合植物學(xué)特征、生物學(xué)特性的研究觀察，認(rèn)為芽變優(yōu)系為在DNA上發(fā)生了穩(wěn)定的變異，且綜合性狀明顯優(yōu)于長富2號。ISSR作為一種分子標(biāo)記，能較好地從分子水平上解釋蘋果品種資源間的遺傳多樣性，同時也證實了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在蘋果品種鑒定中的高效性和有效性，為富士優(yōu)良品系的發(fā)展和鑒定提供科學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)蘋果種質(zhì)資源的品種選育與合理開發(fā)利用。

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Fund project:Special funds for scientific research projects of national forestry public welfare industry "Breeding and extension of Xinjiang featured fruit varieties" (201304701-1) and Fruit development project of featured forest genetics and tree breeding in Xinjiang. (2014)

ISSR Identification of Bud Mutation of Spur and Red Stripe Fuji Apple

ZHANG Jun-miao, LI Wen-sheng, CAO Qian, SHI Jin

(College of Forestry and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

【Objective】 This project aims to do molecular identification of bud sprouts of the Fuji apples and 12 apple cultivars chosen and construct the fingerprint by using ISSR molecular markers technique, and according to the result of clustering analysis to determine the genetic relationships of the 13 apple cultivars.【Method】From 100 ISSR primers on the tested samples for PCR amplification and selection, using NTSYS-pc2.10t according to Nei's genetic similarity coefficient UPGMA clustering, in order to analyze the genetic relationship. The number of polymorphism and the percentage of polymorphic loci were calculated by POPGENE 1.32 and eventually were screened out with clear stripe, rich polymorphism, repeatability, and the varieties with high resolution.【Result】Four ISSR primer pairs with high polymorphism and good repeatability were selected from 100 ISSR primer pairs, and they were named as UBC846, UBC881 and UBC899. Four primer pairs produced 57 loci, which 50 were polymorphic. The percentage of polymorphic loci was 86.11%. Three polymorphic ISSR primers used to construct the digital fingerprint could effectively distinguish all the materials, and establish the phylogenetic relationships of 13 apple varieties. The similarity coefficient of the 13 varieties ranged between 0.67-0.82, showing a higher genetic diversity.【Conclusion】ISSR molecular marker technology can be effectively used to identify apple germplasm resources evaluation, fingerprint construction and bud mutation varieties identification and it is suitable for the germplasm identification and genetic relationship analysis of apple, thus providing a biological theoretical foundation for breeding and cultivation.

Red Fuji; bud mutation; ISSR identification

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.008

2016-02-15

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項課題“新疆特色林果優(yōu)良品種選育和推廣”(201304701-1)；自治區(qū)特色林果發(fā)展專項林木遺傳育種項目(2014年)

張俊苗(1989-)，女，江蘇人，碩士研究生，研究方向為果樹種質(zhì)與資源，(E-mail)839141787@qq.com

李文勝(1968-)，男，湖南人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為果樹種質(zhì)與資源，(E-mail)252500755@qq.com

S661.1

A

1001-4330(2016)07-1230-07