朱 婧 李 妍 雍 莉 鄭 波 鄒曉莉* 劉 珍

1(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，成都 610041)2(四川省疾病預(yù)防控制中心，成都 610041) 3(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷中心，成都 610041)

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同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定尿液中苯系物和三氯乙烯代謝產(chǎn)物

朱 婧1李 妍1雍 莉2鄭 波1鄒曉莉*1劉 珍3

1(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，成都 610041)2(四川省疾病預(yù)防控制中心，成都 610041)3(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷中心，成都 610041)

建立同位素內(nèi)標(biāo)稀釋?zhuān)咝б合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass sepctrometry, UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定尿中苯系物和三氯乙烯代謝產(chǎn)物的方法，并用于孕婦尿樣的分析。尿樣過(guò)經(jīng)含同位素內(nèi)標(biāo)的醋酸銨緩沖液稀釋10倍后，過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣分析。采用C18色譜柱，梯度洗脫進(jìn)行UPLC分離，電噴霧負(fù)離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring，MRM) 模式檢測(cè)。方法檢出限在0.0350～1.75 μg/L之間，方法的日內(nèi)和日間精密度分別為1.2%～9.1%和2.0%～9.7%；用所建立的方法測(cè)定了650個(gè)孕婦尿液樣品，并統(tǒng)計(jì)分析了其地區(qū)差異，加標(biāo)回收率為85.0%～104%。所建立的方法快速靈敏，適合尿液樣品的批量分析。

同位素稀釋?zhuān)?超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 苯系物； 三氯乙烯； 代謝物； 尿液

1 引 言

苯系物主要包括苯、甲苯、二甲苯、乙苯和苯乙烯等物質(zhì)，在化工、建筑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，主要對(duì)人體皮膚粘膜、中樞神經(jīng)、造血功能等造成損害。其中，苯已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為強(qiáng)致癌物。三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)是一種優(yōu)良的溶劑，廣泛用于金屬清洗、干洗劑、殺蟲(chóng)劑和萃取劑等。三氯乙烯對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用，亦可引起肝、腎、心臟等損害[1]。近年來(lái)，苯系物和三氯乙烯的污染問(wèn)題受到人們的廣泛關(guān)注。特別是孕期接觸苯系物、三氯乙烯的孕婦，自然流產(chǎn)及發(fā)生先天畸形的危險(xiǎn)性增高[2]。在對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)的同時(shí)，生物監(jiān)測(cè)也十分必要，通過(guò)對(duì)生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)的測(cè)定，可以在一定程度上說(shuō)明人體對(duì)有害物質(zhì)的接觸水平。

苯系物的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)各不相同，苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和乙苯的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)通常分別為苯巰基尿酸(苯酚、反式-反式粘糠酸)、馬尿酸、甲基馬尿酸(Methylhippuric acid，MHA)、苯乙醛酸 (Phenylglyoxylic acid，PGA)和苯乙醇酸(Mandelic acid，MA)。三氯乙烯的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)為三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)。其中，因在評(píng)價(jià)低濃度苯接觸時(shí)，苯巰基尿酸(S-phenylmercapturic acid,SPMA)個(gè)體差異影響較小，用于生物監(jiān)測(cè)具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)[3,4]，因此實(shí)驗(yàn)選擇了苯巰基尿酸作為苯的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。此外，馬尿酸是甲苯的非特異產(chǎn)物，2013年美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生家協(xié)會(huì)(American Conference of Governmental Industrial Hygienists，ACGIH)已經(jīng)取消其作為甲苯的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)，因此實(shí)驗(yàn)采用了它的特異性產(chǎn)物N-乙?；?S-苯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(benzyl)-L-cysteine, BMA)作為監(jiān)測(cè)對(duì)象；三氯乙酸亦非是三氯乙烯的特異性產(chǎn)物，因此增加檢測(cè)了它的特異性代謝產(chǎn)物N-乙?；?S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine,1,2-DCVMA、N-乙酰基-S-(2,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine，2,2-DCVMA)。

目前，我國(guó)職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，這些生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)都是分別進(jìn)行檢測(cè)，多用高效液相色譜法[5～7]、氣相色譜法[8～10]和分光光度法[11]，但生物樣品基質(zhì)通常較為復(fù)雜，用這些方法進(jìn)行檢測(cè)，樣品基質(zhì)干擾會(huì)造成準(zhǔn)確度和靈敏度的下降。 結(jié)合UPLC的高分離效率和快速及串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的高特異性的UPLC-MS/MS在痕量測(cè)定領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，極大地提高代謝產(chǎn)物測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度。

為了同時(shí)測(cè)定尿樣中苯系物和三氯乙酸的代謝物，且適應(yīng)尿中基體復(fù)雜、含量低的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)校正，建立簡(jiǎn)單快速同時(shí)測(cè)定尿樣中苯系物和三氯乙酸代謝物的方法，與文獻(xiàn)[5～11]相比，檢出限降低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，更有利于痕量分析，為暴露人群的生物監(jiān)測(cè)提供了有力的檢測(cè)手段。將所建立的方法用于各地孕婦尿樣的檢測(cè)，初步分析了不同地區(qū)孕婦的暴露水平差異。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Acquity超高液相色譜儀(UPLC，美國(guó)Waters公司)，3200Q TRAP聯(lián)用質(zhì)譜儀(LC/MS/MS System，美國(guó)AB SCIEX公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：苯巰基尿酸(S-phenylmercapturic acid，SPMA，購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；N-乙?；?S-苯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(benzyl)-L-cysteine, BMA)、N-乙酰基-S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine，1,2-DCVMA)、N-乙酰基-S-(2,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine，2,2-DCVMA)，購(gòu)自Toronto Research Chemicals公司；苯乙醛酸(Phenylglyoxylic acid，PGA)、苯乙醇酸(Mandelic acid，MA)，購(gòu)自Aladdin Chemistry公司；三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)、甲基馬尿酸(Methylhippuric acid，MHA,)、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)，均購(gòu)于Sigma公司。

同位素內(nèi)標(biāo):DL-S-phenylmercapturic-3,3-d2Acid(SPMA-d2，CDN Isotopes公司)；N-acetyl-S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine-13C,d3(1,2-DCVMA-13C,d3)、N-acetyl-S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine-13C,d3(2,2-DCVMA-13C,d3)、N-acetyl-S-(benzyl-13C6)-L-cysteine (BMA-13C6)，均購(gòu)于Toronto Research Chemicals公司。

甲醇、乙腈均為色譜純；醋酸銨(優(yōu)級(jí)純)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(由Millipore Synergy 185超純水機(jī)制得，18.2 MΩ·cm)。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的各標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解SPMA，MA，DCVMA和BMA； 水溶解MHA，PGA和TCA，配制成1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用15 mmol/L醋酸銨緩沖液稀釋成適合濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間應(yīng)用液，測(cè)定前，用15 mmol/L醋酸銨緩沖液(含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(見(jiàn)2.2.3節(jié))。

表1 色譜梯度洗脫程序

Table 1 Gradient elution program of UPLC

時(shí)間Time(min)流速Flowrate(μL/min)15mmol/L醋酸銨緩沖液15mmol/Lammoniumacetatebuffer(%)乙腈Acetonitrile(%)02509822300955330090105300703063006040730080207.5300901083009829250982

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件 C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)，柱溫40℃，進(jìn)樣體積10 μL。流動(dòng)相為15 mmol/L醋酸銨緩沖液和乙腈，梯度洗脫，流動(dòng)相和流速的洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2.2 質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式；多反應(yīng)模式(Multiple reaction monitoring mode ，MRM)；離子源電壓-4400 V；離子源溫度400℃；霧化氣345 kPa；輔助霧化氣310 kPa；氣簾氣207 kPa；進(jìn)口電壓-10 V；出口電壓-10 V；駐留時(shí)間100 ms。待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜條件及其母/子離子見(jiàn)表2。2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用15 mmol/L醋酸銨緩沖液(內(nèi)含各內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度為10～100 ng/mL)將上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間應(yīng)用液分別稀釋為SPMA, PGA, TCA, BMA, DCVMA濃度為0.1, 0.2, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200和500 ng/mL，以及MA, MHA濃度為5, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800和1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)樣10 μL分析。以各待測(cè)物的濃度作為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值或待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

表2 待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜條件及其母/子離子

Table 2 Mass spectrometric parameters for target compounds and their internal standards

待測(cè)物名稱(chēng)Compounds*母離子Parention(m/z)子離子Daughterion(m/z)去簇電壓Declusteringpotential(V)碰撞能Collisionenergy(eV)SPMA238109-4218MHA192148-4522BMA252123-3520MA151107-3314PGA14977-2015TCA161117-20101,2-DCVMA257127-20102,2-DCVMA257127-2014SPMA-d3240109-42181,2-DCVMA-d3261127-20102,2-DCVMA-d3261127-2014BMA-13C625884-3520TFA11369-2010*FullnameofthecompoundsseeFig.1.

2.2.4 樣品的采集與處理 尿樣采集后立即放入冷凍小瓶，-70℃貯存。

取尿樣解凍，用HPLC方法測(cè)定肌酐濃度(WS/T98-1996)，肌酐濃度超過(guò)0.3～3.0 g/L的范圍，尿樣舍棄，符合此濃度范圍，用于檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果同時(shí)進(jìn)行肌酐校正。

尿樣經(jīng)15000 r/min離心5 min，取上清液，以15 mmol/L醋酸銨緩沖液稀釋10倍(緩沖液中含待測(cè)物同位素內(nèi)標(biāo))，過(guò)濾，取濾液上樣測(cè)定。

2.2.5 空白尿液樣品 分別稱(chēng)取氯化鈉、磷酸氰二胺、硫酸鉀、尿素、肌酐試劑12.5, 4.05, 1.74, 25.0和1.20 g，溶于1000 mL純水，配制成模擬空白尿樣[12]。按照2.2.4節(jié)進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)行UPLC/MS/MS分析，用于基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的確定

分別配制濃度為 100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，采用全掃描方式，利用針泵以 20.0 μL/min 流速進(jìn)樣，循環(huán)10次后，分別確定其母離子。在優(yōu)化的最佳錐孔電壓和碰撞能量條件下，進(jìn)行子離子的選擇。MSM方式下選擇用于分析的母離子和子離子見(jiàn)表2。

3.2 色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-甲酸、乙腈-甲酸、甲醇-醋酸銨、乙腈-醋酸銨4種流動(dòng)相體系下，各待測(cè)物質(zhì)的色譜響應(yīng)。結(jié)果表明，各待測(cè)物質(zhì)以乙腈-醋酸銨作為流動(dòng)相時(shí)分離更好，響應(yīng)更高。

固定乙腈-醋酸銨體積比為20∶80，流速為300 μL/min，實(shí)驗(yàn)在5～20 mmol/L范圍內(nèi)研究了流動(dòng)相中醋酸銨濃度的影響，結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入適量的醋酸銨能提高待測(cè)物的離子化效率，利于待測(cè)物的分子離子化，從而改善了色譜峰的峰形，提高了靈敏度。當(dāng)醋酸銨濃度為15 mmol/L時(shí)，響應(yīng)值較高且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-15 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相，并考察流動(dòng)相比例，乙腈-醋酸銨體積比為20∶80時(shí)，DCVMA保留時(shí)間已經(jīng)大于30 min，而TFA保留時(shí)間小于0.5 min，因此采用梯度洗脫以得到合適的分析時(shí)間，優(yōu)化梯度洗脫條件，程序見(jiàn)表1。在選定色譜和質(zhì)譜條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution1. 三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)； 2. 苯乙醇酸(Mandelic acid，MA); 3. 苯乙醛酸(Phenylglyoxylic acid，PGA); 4. 三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA)； 5. 甲基馬尿酸(Methylhippuric acid，MHA)； 6. 苯巰基尿酸(S-phenylmercapturic acid, SPMA)； 7. 苯巰基尿酸-d2(DL-S-phenylmercapturic-3,3-d2 Acid，SPMA-d2)； 8. N-乙?；?S-苯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(benzyl)-L-cysteine, BMA)； 9. N-乙酰基-S-苯基-L-半胱氨酸-13C6(N-acetyl-S-(benzyl-13C6)-L-cysteine,BMA-13C6); 10. N-乙?；?S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine，1,2-DCVMA)；11. N-乙?；?S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸-13C,d3(N-acetyl-S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine-13C, d3(1,2-DCVMA-13C,d3)； 12. N-乙?；?S-(2,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine，2,2-DCVMA)；13. N-乙?；?S-(2,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸-13C,d3(N-acetyl-S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine-13C,d3(2,2-DCVMA-13C,d3)

3.3 樣品前處理

為減少飲水量和排汗量的影響，采樣后需盡快測(cè)定尿肌酐含量。肌酐濃度超過(guò)0.3～3.0 g/L的范圍，尿樣舍棄，符合此濃度范圍，用于待測(cè)物檢測(cè)。

在實(shí)驗(yàn)所建立的方法下，各待測(cè)物質(zhì)的檢出限在0.035～1.75 μg/L之間，其靈敏度滿(mǎn)足了暴露人群的接觸水平的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)平衡了方法靈敏度與大批量分析檢測(cè)的實(shí)際工作要求，同時(shí)為了最大限度保證同時(shí)測(cè)定大批量尿樣的準(zhǔn)確度，采用了稀釋進(jìn)樣的樣品處理方式代替濃縮的樣品處理方式。結(jié)果表明，10倍的稀釋能夠獲得最小的離子抑制, 并且保持合適的靈敏度，此外，少于2%的樣品在分析過(guò)程中出現(xiàn)了離子抑制的現(xiàn)象，繼續(xù)稀釋能夠解決此問(wèn)題，同時(shí)得到更優(yōu)的分析結(jié)果。稀釋液用15 mmol/L 醋酸銨緩沖液最佳，在其中即便加少量的甲醇也會(huì)使得測(cè)定靈敏度下降，峰形展寬且拖尾，這對(duì)出峰靠前的待測(cè)物影響尤為顯著。

據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，苯系物的代謝產(chǎn)物前體 pre-SPMA在酸性條件下能轉(zhuǎn)化成 SPMA，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用強(qiáng)酸水解尿樣，會(huì)使SPMA以外的分析物的穩(wěn)定性降低，故省略了此步驟。

因此，尿樣經(jīng)肌酐校正后，15000 r/min 離心5 min，取上清液用15 mmol/L醋酸銨緩沖液稀釋10倍后，直接進(jìn)樣分析。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

為檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)，將6 份模擬空白尿樣品按2.2.5 節(jié)處理后，加入50 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析。與用15 mmol/L 醋酸銨緩沖液配制的同樣濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度比較，計(jì)算各待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)因子(Matrix factor，MF)[14]，其中MHA、MA、PGA的基質(zhì)效應(yīng)較小，MF在95%～105%范圍內(nèi)，而TCA、SPMA、BMA和DCVMA的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果有顯著影響，主要表現(xiàn)為使測(cè)定結(jié)果偏低，MF在30%～40%范圍內(nèi)，為了獲得更為準(zhǔn)確的定量測(cè)定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)對(duì) SPMA、BMA 和 DCVMA 采用了同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的校正(TCA同位素內(nèi)標(biāo)純度達(dá)不到要求，僅為97%，實(shí)驗(yàn)采用三氟乙酸 (Trifluoroacetic acid，TFA)作為其內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的校正)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)校正，MF可控制在90%～110%范圍內(nèi)。

3.5 方法指標(biāo)

3.5.1 線(xiàn)性范圍和檢出限 用15 mmol/L醋酸銨緩沖液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液，按照2.2.3節(jié)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，待測(cè)物SPMA, PGA, TCA, BMA和DCVMA分別在0.1～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，MA、MHA在5～1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)≥0.997。以3倍基線(xiàn)噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限，尿樣稀釋10倍處理，各待測(cè)物的方法檢出限在0.035～1.75 μg/L范圍內(nèi)。

3.5.2 精密度 在本實(shí)驗(yàn)條件下，使用5 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次和連續(xù)6 d進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)校正計(jì)算其響應(yīng)值的RSD考察儀器的日內(nèi)和日間精密度，測(cè)定結(jié)果分別為1.3%～5.9%和2.1%～6.4%。

3.5.3 加標(biāo)回收率和精密度 在方法的線(xiàn)性范圍內(nèi)，于相同的尿樣中分別加入低、中、高3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示，方法的回收率為85.0%～104%。樣品的日內(nèi)和日間精密度(RSDs,n=5)分別為1.2%～9.1%和2.0%～9.7%。

表3 加標(biāo)回收率(n=5)

Table 3 Recoveries of spiked samples (n=5)

待測(cè)物Compounds本底值Background(μg/L)加標(biāo)量Added(μg/L)測(cè)定值Detected(μg/L)回收率Recoveries(%)SPMA10.8PGA102TCA22.8BMA40.5515.186.01020.294.02030.910150146.989.8100203.7102200310.41041031.587.02039.885.05073.61022060.399.04079.898.380121101待測(cè)物Compounds本底值Background(μg/L)加標(biāo)量Added(μg/L)測(cè)定值Detected(μg/L)回收率Recoveries(%)DCVMA8.4MA466MHA1594.012.398.08.016.510112.019.794.2200657.595.8400848.695.7600988.387.1100260.9102200361.7101300471.8104

3.6 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)采集各地醫(yī)院的孕婦尿樣，用所建立的方法測(cè)定了深圳、南寧、成都、福州、石家莊、西安等地區(qū)650例孕婦尿樣中苯系物和三氯乙烯代謝物的含量，并對(duì)測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，p<0.05, 說(shuō)明各樣本所代表的總體不滿(mǎn)足正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)-Bonferroni校正的兩兩比較法。首先進(jìn)行各指標(biāo)的總體比較，各地區(qū)的各指標(biāo)中位數(shù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。當(dāng)p>0.05，尚不能認(rèn)為各地區(qū)孕婦尿樣中相應(yīng)指標(biāo)具有差異；當(dāng)p<0.05，可以認(rèn)為各地區(qū)孕婦尿樣中相應(yīng)指標(biāo)具有差異,經(jīng)成對(duì)比較得出兩地區(qū)間的差異。

表4 各地區(qū)孕婦尿樣中苯系物和三氯乙烯代謝物的中位值和p值

Table 4 Statistic analysis of urine samples of pregnant women in different regional

待測(cè)物Compounds深圳Shenzhen南寧Nanning成都Chengdu福州Fuzhou石家莊Shijiazhuang西安Xi'anpSPMA(μg/g.cr)4.423.104.593.943.542.39>0.05PGA(μg/g.cr)589537641578600655>0.05MHA(μg/g.cr)860112110051017834831>0.05MA(mg/g.cr)17.421.58.8615.230.89.63<0.05TCA(μg/g.cr)52.723.611.138.530.210.3<0.05DCVMA(μg/g.cr)8.307.767.036.286.8110.2<0.05BMA(μg/g.cr)107.995.313315211590.0<0.05

經(jīng)成對(duì)比較，得出石家莊地區(qū)孕婦尿樣中MA值分別與深圳、西寧、成都、福州、西安地區(qū)有明顯差異，石家莊地區(qū)孕婦尿樣中的MA值明顯高于上述5個(gè)地區(qū)；深圳地區(qū)孕婦尿樣中MA含量高于西安地區(qū)孕婦尿樣中MA含量。

深圳地區(qū)孕婦尿樣中TCA值分別與西寧、成都、福州、石家莊、西安有明顯差異，深圳地區(qū)孕婦尿樣中的TCA值明顯高于以上地區(qū)；此外，福州地區(qū)孕婦尿樣中TCA含量高于西寧、成都、西安地區(qū)孕婦尿樣中TCA含量。

福州地區(qū)孕婦尿樣中DCVMA值分別與深圳、西寧、西安地區(qū)有明顯差異，福州地區(qū)孕婦尿樣中的DCVMA值低于以上3個(gè)地區(qū)； 石家莊地區(qū)孕婦尿樣中DCVMA含量低于深圳、西安地區(qū)孕婦尿樣中DCVMA含量。

福州地區(qū)孕婦尿樣中BMA值分別與深圳、西寧地區(qū)有明顯差異，福州地區(qū)孕婦尿樣中的BMA值高于以上2個(gè)地區(qū)。

綜上，在各地區(qū)孕婦尿樣中苯系物和三氯乙酸的代謝產(chǎn)物含量差異比較中，尚不能認(rèn)為各地區(qū)孕婦尿樣中SPMA、PGA、MHA值具有差異；各地區(qū)之間孕婦尿樣中MA、TCA、DCVMA、BMA含量分別具有一定的差異，其中福州、石家莊、深圳地區(qū)含量較高，可能與其城市的工業(yè)發(fā)展?fàn)顩r、城市環(huán)境污染有一定的關(guān)系。

1 CHEN Wen, XU Lei, DENG Li-Xia, LI Fang-Hong, YANG Xing-Fen, ZHENG Chang-Liang, CHEN Gang.Chin.Occup.Med., 2000, 27(5): 9-11

陳 雯, 徐 雷, 鄧麗霞, 李方紅, 楊杏芬, 鄭創(chuàng)亮, 陳 剛. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2000, 27(5): 9-11

2 LI Xing-Hu, WANG Jin-Feng, ZHENG Xiao-Ying, ZHANG Ke-Li.Chin.J.PublicHealth, 2005, 21(10): 1158-1160

李新虎, 王勁峰, 鄭曉瑛, 張科利. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2005, 21(10): 1158-1160

3 Boogarrd P J, Van Sittert N J.Environ.HealthPerspect, 1996, 104(6): 1151-1157

4 Qu Q, Melikian A A, Li G, Shore R, Chen L, Cohen B, Yin S, Kagan M R, Li H, Meng M, Jin X, Winnik W, Li Y, Mu R, Li K.Am.J.Ind.Med., 2000, 37(5): 522-531

5 Inoue O,Kanno E, Yusa T, Kakizaki M, Watanabe T, Higashikawa K, Ikeda M.Biomarkers, 2001, 6(3): 190-203

6 Laffon B, Lema M, Mendez J.J.Chromatogr.B, 2001, 753(2): 385-393

7 Schad H, Schafer F, Weber L, Seidel H J.J.Chromatogr.A, 1992, 593(1-2): 147-151

8 LIU Yun-Fu, TAN Guang-Hui.ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, 2013, 23(3): 625-627

劉云富, 譚廣輝. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2013, 23(3): 625-627

9 DU Hong, KONG Yu-Mei, WANG Ping, DU Guang-Yu.TheAdministrationandTechniqueofEnvironmentalMonitoring, 2000, 12(6): 33-34

杜 宏, 孔玉梅, 王 平, 杜廣玉. 環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù), 2000, 12(6): 33-34

10 LIU Ming-Ren, YANG Xue-Yu, WANG Li, ZHANG Zhao-Liang.EnvironmentalScienceandTechnology, 2011, 34(11): 135-138

劉明仁, 楊學(xué)雨, 王 力, 張昭良. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2011, 34(11): 135-138

11 LIU Wen-Jun, DUAN Ai-Ling, GAO Lan-Zhen.GansuEnvironmentalStudyandMonitoring, 2000, 13(4): 195-197

劉文君, 段愛(ài)玲, 高蘭珍. 甘肅環(huán)境研究與監(jiān)測(cè), 2000, 13(4): 195-197

12 SUN Chen-Jun.BiomaterialsInspection, Beijing: People′s Medical Publishing House, 2006: 193

孫成均主編. 生物材料檢驗(yàn), 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2006: 193

13 Sterz K, Kohler D, Schettgen T, Scherer G.J.Chromatogr.B, 2010, 878(27): 2502-2505

14 van Eeckhaut A, Lanckmans K, Sarre S, Smolders I, Michotte Y.J.Chromatogr.B, 2009, 877(23): 2198-2207

(Received 17 June 2015; accepted 21 October 2015)

This work was supported by the State Key Development Program for Basic Research of China (No.2010CB529502)

Determination of Metabolites of Benzene Compounds and Trichloroethylene in Urinary by Isotope Dilution-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Jing1, LI Yan1, YONG Li2, ZHENG Bo1, ZOU Xiao-Li*1, LIU Zhen3

1(DepartmentofLaboratoryTechnologyandScienceofPublicHealth,WestChinaSchoolofPublicHealth,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)2(CenterforDiseaseControlandPreventionofSichuanProvince,Chengdu610041,China)3(NationalCenterforBirthDefectMonitoring,WestChinaSecondUniversityHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

A method for simultaneous determination of metabolites of benzene compounds and trichloroethylene in pregnant urine by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established. Urine samples were diluted 10 times with ammonium acetate buffer containing working mixed internal standard and the filtrate was injected into UPLC/MS/MS for analysis. UPLC-MS/MS was performed on Waters C18column and the gradient elution was used for separation. The negative electrospray ionization (ESI) source under the multiple reaction monitoring (MRM) mode was used for quantitative analysis. The limits of detection (LOD) ranged from 0.0350 μg/L to 1.75 μg/L. The inter-day and intra-day precisions of method were 1.2%-9.1% and 2.0%-9.7%, respectively. The proposed method was applied on detecting 650 urine samples of pregnant women in different region and the results were analyzed by statistical method. The spiked recoveries were in the range of 85.0%-104%. The method was quick, sensitive and suitable for batch analysis of urine samples.

Isotope dilution; Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Benzene compounds; Trichloroethylene; Metabolite; Urinary

10.11895/j.issn.0253-3820.150497

本文系國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(No.2010CB529502)資助

2015-06-17投稿；2015-10-21接受

* E-mail：zouxl_1113@163.com