林瑩瑩，聶麥茜，王 琰，賀美麗，李 虹 （西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055）

生物膜處理高含油廢水及膜表面微生物群落特性研究

林瑩瑩，聶麥茜*，王 琰，賀美麗，李 虹 （西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055）

利用單一銅綠假單胞菌NY3生物膜在敞開體系中（非無菌條件下）處理石油廢水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物膜可高效率去除高濃度含油廢水中的油類物質(zhì).在2g/L含油水樣中，連續(xù)運行25d，石油烴去除率可持續(xù)保持約91.1%.停止進水后，曝氣可使生物膜活性恢復(fù).自然環(huán)境中，配伍于NY3菌生物膜中的微生物主要有芽孢桿菌、假單胞菌和紅球菌屬，其中在實驗室能夠培養(yǎng)出來的微生物經(jīng)16SrRNA鑒定分別屬于紅球菌屬和芽孢桿菌屬，經(jīng)檢測，2株菌均有高的石油烴降解效率.

銅綠假單胞菌NY3；固定化生物膜；高濃度含油廢水；微生物群落

固定化生物膜處理技術(shù)的研究起步較早，但一直無法處理高濃度含油廢水.從文獻報道

［1-4］看，利用混合優(yōu)勢菌株固定化生物膜可處理低濃度含油廢水中油類物質(zhì)；也可經(jīng)過長期的培養(yǎng)馴化，得到固定化生物膜，用此來降解含油廢水，一般該生物膜培養(yǎng)、馴化、掛膜時間較長，且僅可處理低于 100mg/L的含油廢水［5］；近年來報道了一種新型的微生物固定化產(chǎn)品［6-7］，它是通過將微生物固定在一定數(shù)量的載體上，做成生物膜成品，這些成品大多數(shù)都是通過一些混合菌株進行固定化而形成的，對中低濃度的含油廢水處理效率較高，目前這類固定化生物膜處理技術(shù)應(yīng)用于處理高濃度含油廢水的報道相對較少.所以，開發(fā)一種單一高效的耐溫度、耐酸堿性的石油降解菌株，通過固定化的方法形成生物膜，然后用其處理高濃度含油廢水的生物處理技術(shù)非常緊迫.

課題組前期從陜北某油田受石油污染的土壤中篩選得到一株銅綠假單胞菌，命名為NY3［8］，具有高效降解石油烴的功能.前期研究發(fā)現(xiàn)單一NY3菌可固定在聚氨酯泡沫表面，形成固定化生物膜，且可處理含油廢水.本文在此基礎(chǔ)上，研究在敞開體系中，NY3菌生物膜處理高濃度含油廢水前后表面特征，處理前后及其恢復(fù)過程中自然從環(huán)境中配伍在生物膜上的微生物種群關(guān)系，并對其中可培養(yǎng)微生物的降油性能進行研究，研究結(jié)果為NY3菌生物膜處理實際高濃度含油廢水奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源 銅綠假單胞菌NY3，由實驗室分離并鑒定［8］.

1.1.2 原油來源及其特性 試驗中所用原油均來自長慶油田，其含蠟量為 10.48%，膠質(zhì)含量6.5%，瀝青質(zhì)含量 0.93%，20℃密度為 0.845t/m3，汽油比為45m3/t，50℃粘度為5.2mps.s，初餾點為55.6℃.

1.1.3 聚氨酯泡沫載體 參照文獻［9-10］中的方法，先將載體制作成5mm的立方體小塊，再用5% HCl溶液浸泡24h，用蒸餾水洗至中性；然后用5% NaOH溶液浸泡24h，用蒸餾水洗至中性，烘干備用.

1.1.4 培培培 制備種子液的培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH值為7.3～7.5，121℃滅菌30min.

NY3菌固定化培養(yǎng)液：同制備種子液的培養(yǎng)基.

無機鹽培養(yǎng)基：5g NH4NO3，1mL微量元素，0.1mL 1M MgSO4·7H2O溶液，0.05mL 1M CaCl2·2H2O溶液，100mL磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容1000mL，調(diào)節(jié)pH為7.5；121℃高壓水蒸氣滅菌30min.

原油-無機鹽降解體系（2g/L）：用移液管吸取1mL溶有原油的石油醚（4%），置于50mL錐形瓶中，再用吹風(fēng)機將石油醚吹至揮發(fā)完，向瓶中加入20mL上述無機鹽培養(yǎng)基，121℃高壓水蒸氣滅菌30min.

1.2 實驗方法

1.2.1 NY3固定化生物膜掛膜方法 基于前期研究結(jié)果［11-12］，本實驗在最佳優(yōu)化條件下，進行NY3菌生物膜的固定化，其固定化步驟為［13］：

（1）用電子天平分別準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理過的、于60℃干燥后的聚氨酯泡沫載體1.0g，將相同重量的 4份聚氨酯泡沫在使用之前于紫外燈下滅菌30min，殺死載體上的雜菌.

（2）在無菌條件下操作，將滅菌后的4份載體分別放入100mL固定化培養(yǎng)液（pH=7.5）中，分別接種等量的菌懸液，接種量為10%.

（3）將4份制備好的固定化培養(yǎng)液置于30℃，200r/min的恒溫搖床上生長固定 51h（前期已優(yōu)化的最佳固定化時間），51h后，將固定化生物膜載體用0.85%的NaCl溶液洗滌3次，洗掉殘留在載體上的菌懸液以及粘附在載體表面上的固定化液.收獲固定化菌劑.

（4）取上述2份樣品檢測聚氨酯泡沫表面生物量，采用細胞干重法測定載體上的生物量，將已知重量的聚氨酯泡沫載體和吸附在其上的菌體于 60℃烘干至恒重，減去載體重量，所得值為細胞干重，以mg/g聚氨酯泡沫表示.

1.2.2 NY3固定化生物膜的運行 取10個裝有20mL原油-無機鹽降解體系（2g/L）的50mL錐形瓶，向每瓶加入 20個上述固定化菌劑（即1.0g生物膜/100mL反應(yīng)體系［11-12］），敞開體系，置于30

℃、151r/min的恒溫搖床內(nèi)降解原油，每隔 24h更換一次原油-無機鹽培養(yǎng)液，運行60d.

1.2.3 NY3固定化生物膜生物活性的恢復(fù) 取上述運行60d后的膜測定其恢復(fù)結(jié)果.取6份相同量的運行60d后的生物膜載體，分別投入到裝有20mL無機鹽培養(yǎng)液（加入200uL 50%的甘油）的錐形瓶中，敞開體系，置于 30℃、151r/min的恒溫搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，每隔 3d取出一份樣品萃取生物膜上殘留的油類物質(zhì)，萃取液經(jīng)氣相檢測器分析.

1.2.4 NY3菌固定化生物膜表面菌群多樣性分析 分別取掛膜初始、運行過程中，恢復(fù)過程中的樣品做 PCR-DGGE分析.用細菌通用引物968F（AACGCGAAGAACCTTAC）和1401R （CGGTGTGTACAAGACCC）進行16SrRNA V3區(qū)擴增［14］.

PCR反應(yīng)體系（50μL）如下：10xbuffer 5μL，dNTP 4μL， ExTaq酶 6μL，引物各 0.2μL，模板DNA 5μL，補ddH2O至50μL.

反應(yīng)條件［15］：95℃預(yù)變性 5min；94℃變性30s，59℃退火 45s，72℃延伸 45s，30個循環(huán)；72℃延伸7min.

DGGE變性梯度為 35%～55%，電泳溫度60℃，電壓130V預(yù)跑10min，然后70V跑13h［16］，電泳完畢后用 gelred染色 30min，超純水脫色10min，通過凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，割膠.經(jīng)回收的膠再次擴增后跑瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收，然后連接到PMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)入DH5ɑ感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆送上海生工測序.

1.2.5 天然復(fù)配菌種分離與鑒定 在上述恢復(fù)過程中，每隔 3d取出的樣品經(jīng)石油醚萃后，放入10mL無菌水中，置于超聲波中超聲以制備菌懸液［17］，再將菌懸液稀釋倒平板，37℃培養(yǎng)24h.從平板上挑出不同形態(tài)的菌落培養(yǎng)，然后通過劃線分離法得到各個單株菌菌落.

利用基因組DNA提取試劑盒分別提取各個分離菌株的基因組DNA，用通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R （AAGGAGGTGATCCAGCCGCA）［18］進行菌株 16SrRNA序列擴增.PCR反應(yīng)體系同上.

PCR擴增條件為［19］：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 40s，58℃退火 40s，72℃延伸 90s，32個循環(huán)；72℃延伸10min.克隆轉(zhuǎn)化方法同上.

1.2.6 天然復(fù)配菌降解原油 無菌條件下，向50mL錐形瓶中加入已滅菌的原油-無機鹽降解體系10mL，接種量為10mL，30℃、175r/min恒溫培養(yǎng)5d，用60～90℃石油醚萃取剩余原油3次，合并萃取液，揮發(fā)石油醚，2mL正己烷定容后，做氣相分析.

1.3 分析測試方法

1.3.1 NY3固定化生物膜表面結(jié)構(gòu)的觀察 分別取剛制備的和恢復(fù)期間（萃油后）的NY3固定化生物膜，用2%～4%的戊二醛溶液固定4h，再用0.2M pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗 3次，每次15min，然后，用濃度梯度不同的乙醇水溶液（50%、70%、80%、90%、95%、100%）按從稀到濃的次序，進行脫水處理，每種濃度處理15min，再將樣品浸泡于醋酸異戊二酯中［20］，4℃過夜，最后把樣品放入臨界點干燥儀（HCP-2型）樣品室中，干燥后，借助掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其表觀結(jié)構(gòu).

1.3.2 氣相色譜測定原油組分的方法和色譜條件 用安捷倫6890N單檢測器氣相色譜儀分離原油組分，用戊烷、己烷、辛烷、十二烷、十四烷、正十六烷、十八烷等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及烷烴氣相色譜分離規(guī)律，確定原油中烴的組分.以正十一烷為內(nèi)標(biāo)物，與未投加菌對照組相應(yīng)色譜圖對比，計算降解效率.色譜條件［21］：5% phenyl Methyl Siloxane HP-5 毛細管氣相色譜柱（30m×320μm× 0.25μm），載氣：99.99%高純氮氣，進樣口溫度300℃，分流比 30：1.檢測器溫度：300℃，氫氣流量40mL/min，空氣流量 450mL/min.程序升溫，初始50℃，保留7min，再以20 /min℃ 升溫至100℃，保留1min，最后以5 /min℃ 升溫至290℃保留5min.

1.3.3 測序結(jié)果分析及進化樹構(gòu)建 將16SrRNA序列測序結(jié)果進行序列拼接和去除多余堿基后，在 NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）中進行blast分析，采用clustalX1.81和mega4.0軟件進行序列比對和進化樹構(gòu)建.

2 結(jié)果與討論

2.1 NY3菌固定化生物膜及其處理高濃度含油水樣的特性

按照1.2.1中實驗方法，預(yù)處理聚氨酯泡沫表面，處理好的表面如圖1a所示.將NY3菌接種于含預(yù)處理過的聚氨酯泡沫的培養(yǎng)基中，51h后，按照1.3.1中方法利用掃描電鏡（SEM）觀察NY3菌固定化生物膜的表面特征如圖1b所示.圖1b結(jié)果表明，聚氨酯泡沫表面 NY3菌分布均勻，生物量大，利用重量法測得聚氨酯泡沫表面生物量為430～460mg干菌/g聚氨酯.利用該生物膜以序批式處理含油2g/L的實驗室配制的水樣，水力停留時間保持在24h，運行60d后，生物膜特征如圖1c所示.生物膜運行過程中石油烴去除效率如圖 2所示.從運行效果看，在敞開反應(yīng)體系中，NY3菌生物膜至少在25d內(nèi)一直保持降解活性，石油烴凈去除率83%～95%之間.在前25d的運行過程中出水一直清澈，透明，但運行約 30d時，明顯看出，出水渾濁度大，OD600nm可達到約0.7，這是因為生物膜脫落造成的，這直接導(dǎo)致石油烴凈去除率降低 15%～20%.隨運行時間延長，生物膜活性逐漸恢復(fù)，當(dāng)運行至45d時，石油烴凈去除率可恢復(fù)到80%左右.隨后生物膜活性逐漸降低，這是由于生物膜表面油量負荷過高，且包含異構(gòu)烷烴、烯烴、炔烴、芳香烴及其它難降解物質(zhì)［22］.

圖1 聚氨酯泡沫表面及其NY3菌固定化生物膜的SEM圖Fig.1 SEM photos of the surface of carrier with and without immobilized NY3 strain （a） surface of the carrier without NY3 strain （b） surface of the carrier with NY3strain （c） surface of the carrier with NY3strain after sixty recycles in treated oil-bearing wastewater

圖2 NY3菌固定化生物膜序批式降解高濃度含油水樣運行圖Fig.2 The removal efficiency of immobilized bio-film of NY3 strainin treated high concentration oil-bearing wastewater

2.2 NY3固定化生物膜運行后自行恢復(fù)可行性

上述運行過程生物膜對油的吸附和降解同時進行，從氣相色譜圖看，降解量遠大于吸附量.按照 1.2.3中實驗方法，停止進水，恢復(fù)生物膜活性.將運行60d后生物膜取出，平均分為6組，其中一組生物膜用于在掃描電鏡上觀察生物膜特征，如圖1c所示.5組各放入含500mg/L甘油的無機鹽培養(yǎng)基中，與運行過程相同，曝氣，分別在0、5、10、12、15d取出一組，用石油醚萃取，定容后測定石油醚層紫外光譜，如圖3所示.石油醚揮發(fā)后，用正己烷定容做氣相分析，結(jié)果如圖4所示.結(jié)合圖3和圖4結(jié)果看，膜上的石油烴逐漸被降解，恢復(fù)12d后，生物膜上的石油烴基本降解完全，但仍殘留一些難降解油類物質(zhì).從恢復(fù)后生物膜表面顏色逐漸變淺也說明生物膜活性逐漸恢復(fù).

圖3 恢復(fù)過程中從生物膜表面所萃取油類的紫外光譜圖變化趨勢Fig.3 UV spectra of oil from the surface of immobilized bio-film of NY3 strain in the process of recovery

圖4 恢復(fù)過程中從生物膜表面所萃取油類的氣相色譜圖Fig.4 Gas Chromatogram of oil from the surface of immobilized bio-film of NY3 strain in the process of recovery

2.3 NY3固定化生物膜表面微生物菌群DGGE分析結(jié)果

盡管初期僅用NY3菌獲得固定化生物膜，然而運行是在敞開體系中，為掌握運行過程中微生物多樣性的變化特性，按照 1.3.3中實驗方法，收集運行前、運行過程及其恢復(fù)過程中生物膜表面細胞，提取DNA，然后進行PCR擴增，DGGE分析和目標(biāo)條帶的克隆轉(zhuǎn)化.微生物多樣性如圖 5所示.從圖5結(jié)果看，運行前，生物膜上主要是NY3菌株，在運行5d和10d時，微生物多樣性逐漸增加，當(dāng)運行達到60d時，生物膜上NY3菌細胞所占比例已非常少，因此，出現(xiàn)圖 2中石油烴降解效率無法恢復(fù)到新鮮生物膜的活性的現(xiàn)象.按照2.2中方法恢復(fù)生物膜的活性，明顯看出在恢復(fù)6d和12d后，生物膜上NY3菌細胞量逐漸增加.結(jié)合圖3、圖4和圖5結(jié)果，說明停止進水，在含甘油的無機鹽培養(yǎng)基中曝氣生物膜的活性可逐漸恢復(fù).

運行過程中自然與NY3菌配伍于生物膜表面的微生物，經(jīng)16SrRNAV3區(qū)序列測序鑒定，結(jié)果如表1所示，細菌菌群結(jié)構(gòu)之間的相似性如圖6所示.從表1結(jié)果看，能自動配伍于NY3菌生物膜、并共同作用于石油烴降解的微生物種類主要有銅綠假單胞菌（Pseudomonas）、紅球菌（Rhodococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）、污泥溶桿菌（Lysobacter）、酸酐菌（Pelosinus），黃單胞菌（Stenotrophomonas）等，其中芽孢桿菌、假單胞菌和紅球菌為優(yōu)勢菌群.

圖5 不同時期生物膜上微生物DGGE圖譜Fig.5 DGGE map of bacteria from biofilm at different periods

表1 DGGE優(yōu)勢條帶的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果Table 1 Tentative identification of dominant DGGE bangs by sequencing the excised and NCBI analysis

續(xù)表1

圖6 聚類分析DGGE圖譜中細菌菌群結(jié)構(gòu)之間的相似性Fig.6 Analysis of the similarity among bacterial communites in DGGE map

2.4 NY3固定化生物膜上天然復(fù)配菌的分離與鑒定以及降解原油特性研究

圖7 芽孢桿菌LH和紅球菌F對原油中各直鏈烷烴的降解特性Fig.7 The removal rate of petroleum hydrocarbons by LH（Bacillus） and F（Rhodobacterales）

由方法1.2.6可知，其中可分離、培養(yǎng)的菌株有2株，分別命名為LH和F，經(jīng)16SrRNA鑒定細菌LH和F分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）和紅球菌屬（Rhodococcus），并且分別與Bacillus sp. AM2（芽孢桿菌 AM2）和 Rhodococcus erythropolis R138（紅串紅球菌R138）菌株最為接近.2株可培養(yǎng)菌株經(jīng)檢測均能降解石油烴，結(jié)果如圖7所示，尤其是紅球菌屬菌株 F對高濃度石油烴的平均降解率可達95%.

3 結(jié)論

3.1 在固定化培養(yǎng)基中，51h銅綠假單胞菌NY3能在聚氨酯泡沫表面掛膜，最大膜生物量為430～460mg干菌/g聚氨酯泡沫；HRT為24h時，在含油量為2g/L水樣中，該膜連續(xù)運行約25d保持高達約91.1%的油去除率.

3.2 運行60d的 NY3固定化生物膜恢復(fù)12d，吸附在膜表面的石油烴基本降解完全，微生物活性恢復(fù)，使生物膜可重復(fù)利用.

3.3 運行初期，NY3固定化生物膜表面菌群僅為NY3菌，隨運行時間延長微生物多樣性增加，60d時，膜上 NY3菌細胞所占比例已非常少，天然復(fù)配了芽孢桿菌、假單胞菌和紅球菌等.但隨著恢復(fù)時間的延長膜表面NY3菌的細胞量又逐漸增多，恢復(fù)至12d時，NY3菌的細胞量已占較大比重.

3.4 自然配伍于NY3菌生物膜中的紅球菌F和芽孢桿菌 LH分別單獨降油時均具有高效的石油烴降解效率.

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Study on the high concentration oil-containing wastewater by biofilm treatment of P.aeruginosa strain NY3 and the characteristics of microbial community in biofilm.

LIN Ying-ying， NIE Mai-qian*， WANG Yan， HE Mei-li， LI Hong （School of Environmental and Municipal Engineering， Xi’an University of Architecture and Technology， Xi’an 710055， China）. China Environmental Science， 2016，36（9）：2800～2807

Single P. aeruginosa NY3 can grow and be immobilized on the surface of polyurethane foam carrier， the biofilm was used in an open system （non sterile conditions） to treat the oil-containing wastewater. The results showed that the biofilm can efficiently removeoil material of high concentrationoily wastewater. After continuously running for 25 d in the oil-bearing wastewater of 2g/L， the removal rate of petroleum hydrocarbons can be maintained at 91.1%. When the entrance of water was stopped， the bioactivityof the biofilm can be recovered by aeration. Under the natural environment，the bacterial accompanied and survived with NY3 in bacteria biofilmmainly includedBacillus， Pseudomonas and Rhodococcus strain. Two cultured strains were isolated and identified through the 16SrRNAsequence， which showed they belonged toRhodococcusand Bacillus separately， and they were also proved to have the capabilty to efficiently remove petroleum hydrocarbon.

Pseudomonas aeruginosa NY3；immobilized biological membrane；high concentration of oily wastewater；microbial community

X172，X703

A

1000-6923（2016）09-2800-07

2016-02-01

國家自然科學(xué)基金（51278405）；陜西省國際科技合作重點項目（2012KW-25）；榆林市2011年產(chǎn)學(xué)研合作項目

* 責(zé)任作者， 教授， niemaiqian@xauat.edu.cn

林瑩瑩（1990-），女，陜西人，碩士，從事微生物降解石油烴研究.發(fā)表論文 篇.