趙嘉詠，張白帆，申曉靖，夏勝利，黃學勇，許汴利

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河南省2008-2014年5歲以下腹瀉兒童A組輪狀病毒病原學及流行病學特征研究

趙嘉詠，張白帆，申曉靖，夏勝利，黃學勇，許汴利

目的 分析2008-2014年河南省5歲以下腹瀉兒童A組輪狀病毒的感染狀況及流行病學特征。方法 采集河南省兩個監(jiān)測哨點醫(yī)院5歲以下兒童腹瀉病例的糞便樣本2 098份，雙抗體夾心法ELISA檢測A組輪狀病毒，陽性樣本抽提病毒RNA，兩步巢式多重RT-PCR進行G-P基因分型，同時收集病例臨床與流行病學信息進行分析。結(jié)果 2 098份腹瀉樣本共檢出A組輪狀病毒688份，總陽性率32.8%。年檢出率最高46.4%(2013年)，最低26.7%(2009年)。輪狀病毒檢出率的季節(jié)性特征顯著，存在秋季和春季兩個高峰。A組輪狀病毒型別組合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]為主，還存在部分混合感染型別。感染病例集中于4個月到1歲，以無臨床癥狀或輕癥為主。結(jié)論 河南省5歲以下腹瀉患兒中存在較高的A組輪狀病毒感染率，病原體可分為多種基因型別，感染人群具有顯著的流行病學特征。

A組輪狀病毒；兒童；基因分型；流行特征

人感染A組輪狀病毒(Human Rotavirus A，簡稱HRVA)是引起5歲以下兒童秋季腹瀉的主要病原體之一，其通過感染小腸粘膜上皮細胞，造成細胞損傷，引起滲透性(水性)腹瀉病。A組輪狀病毒在每年的秋冬季流行，感染途徑為糞-口途徑，臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，可導(dǎo)致發(fā)熱、嘔吐、腹瀉及脫水等嚴重并發(fā)癥[1-2]。本研究對河南省2008-2014年采集自5歲以下兒童腹瀉糞便中的A組輪狀病毒進行病原學檢測與基因型別分析，為其疾病監(jiān)測、防控策略制定、爆發(fā)疫情調(diào)查及疫苗研發(fā)提供基線數(shù)據(jù)與科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例定義 依據(jù)中國疾控中心《全國病毒性腹瀉監(jiān)測方案》制定的病毒性腹瀉病例定義，對鄭州市和開封市兩家兒童醫(yī)院5歲以下(1-59月齡)腹瀉患兒，每日排便3次或3次以上，且大便性狀有改變，呈稀便、水樣便等；大便常規(guī)鏡檢WBC<15，未見RBC的病例進行腹瀉樣本采集。

1.1.2 樣本采集與保存 糞便標本在患者發(fā)病3 d內(nèi)或入院24 h內(nèi)采集，固體便每份取5～10 g，水樣便或稀便每份取5～10 mL，放入螺口采樣盒中置于-20 ℃凍存，在檢測前避免反復(fù)凍融。2008年196份，2009年292份，2010年238份，2011年354份，2012年332份，2013年375份，2014年311份，共計2098份。

1.1.3 主要試劑與儀器 雙抗體夾心法ELISA檢測試劑盒購自英國OXOID公司；磁珠法病毒核酸提取試劑盒購自西安天隆科技公司；SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國invitrogen公司；dNTP MIX、GoTaq DNA聚合酶購自美國Promega公司；引物(HPLC純化)由上海invitrogen合成；100 bp Marker購自大連寶生物生物技術(shù)公司；電泳瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；50×TAE電泳緩沖液購自北京Solarbio公司。自動核酸提取儀購自西安天隆科技公司；去離子水系統(tǒng)購自美國Milipore公司；Minispin臺式離心機、PCR儀購自德國Eppendorf公司；核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本抗原檢測 糞便樣本置于室溫自然解凍，每人份取0.1 g固體糞便或100 μL液體糞便標本加入1.0 mL樣品稀釋液(試劑盒所配)至1.5 mL EP管中，置于漩渦震蕩器振蕩混勻(每次振蕩30 s，振蕩3次)，室溫靜置10 min， 8 000 r/min離心5 min后參照說明書取100 μL上清加入ELISA微孔板中，37 ℃孵育60 min，洗板3次，每孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺(TMP)顯色液，室溫靜置15 min后加入終止液酶標儀讀取OD450值并判定結(jié)果。

1.2.2 病毒RNA的提取及A組輪狀病毒基因分型 取樣本稀釋液200 μL，使用磁珠法自動核酸提取儀(西安天隆NP968型)進行病毒總RNA提取。提取產(chǎn)物參照世衛(wèi)組織輪狀病毒參比實驗室提供的A組輪狀病毒G(病毒外殼蛋白VP7)/P(病毒外殼蛋白VP4)基因分型引物序列及試驗方案進行，其中G分型包括G1/G2/G3/G4/G8/G9/G10/G11 8條引物，P分型包括P4/P6/P8/P9/P10/P11 6條引物。第一輪RT-PCR反應(yīng)步驟及參數(shù)為：98 ℃變性5 min，冰內(nèi)冷卻退火5 min；42 ℃ 60 min，94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35個循環(huán)，72 ℃ 7 min，反應(yīng)體積25 μL。第二輪巢式PCR取第一輪擴增產(chǎn)物2 μL作為模板，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35個循環(huán)，72 ℃ 7 min，反應(yīng)體積50 μL。

1.2.3 電泳與結(jié)果判斷 取10 μL PCR擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(140 V,30 min)。根據(jù)特異性核酸條帶大小和數(shù)目組合判斷A組輪狀病毒基因類別。

2 結(jié) 果

2.1 A組輪狀病毒ELISA檢測結(jié)果 2 098份腹瀉樣本共檢出A組輪狀病毒688份，總陽性率32.8%。其中2008年陽性率29.1%(57/196)；2009年陽性率26.7%(78/292)；2010年陽性率37.8%(90/238)；2011年陽性率27.1%(96/354)；2012年陽性率32.2%(107/332)；2013年陽性率46.4%(174/375)；2014年陽性率27.7%(86/311)。分月份看，每年的10月份陽性率最高，7年的平均陽性率為53.9%；陽性率最低的是每年的7月份，7年的平均陽性率為4.0%。檢出率的季節(jié)性變顯著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)兩個較為顯著的高峰(表1，圖1)。

2.2 A組輪狀病毒GP基因分型結(jié)果 688株A組輪狀病毒G分型為G1、G2、G3、G4、G9；以G1、G2、G3、G9為主；P分型為P[4]、P[6]、P[8]、P[9]；以P[4]、P[8]為主。A組輪狀病毒型別有G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]，G4P[9]，G9P[4]，G9P[8]，以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]為主。另外經(jīng)測序證實還存在混合感染的型別，有G13P[8]，G234P[8]，G39P[8]，G389P[6][8]，G9P[4][8]，G2P[4][10](表2，圖2)。

表1 2008年-2014年河南省5歲以下腹瀉患兒A組輪狀病毒檢測結(jié)果一覽表
Tab.1 Detection of human rotavirus A in children with diarrhea under 5 years in Henan Province, 2008-2014

month2008200920102011201220132014positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains)/samples/(%)10/5/0.01/10/10.00/2/0.00/7/0.00/10/0.02/12/16.70/6/0.021/5/20.00/5/0.00/2/0.01/13/7.71/10/10.06/17/35.30/8/0.031/4/25.01/14/7.12/8/25.02/11/18.22/8/25.06/16/37.53/12/25.044/10/40.00/6/0.03/10/30.02/12/16.73/19/15.88/22/36.43/15/20.052/12/16.74/29/13.87/21/33.37/38/18.42/22/9.16/20/30.01/17/5.963/20/15.03/20/15.02/13/15.43/27/11.12/24/8.31/19/5.31/22/4.571/20/5.01/18/5.60/9/0.02/35/5.72/29/6.90/11/0.01/20/5.080/17/0.01/21/4.8%1/7/14.32/29/6.91/18/5.62/12/16.70/16/0.099/30/30.019/48/39.620/56/35.722/44/50.019/45/42.239/58/67.229/51/56.91017/41/41.518/60/30.044/77/57.128/41/68.351/81/63.069/109/63.342/78/53.81115/23/65.227/49/55.19/24/37.523/69/33.323/55/41.828/55/50.96/60/10.0124/9/44.43/12/25.02/9/22.24/28/14.31/11/9.17/24/29.20/6/0.0總計57/196/29.178/292/26.790/238/37.896/354/27.1107/332/32.2174/375/46.486/311/27.7

表2 2008-2014年河南省A組輪狀病毒G/P基因分型結(jié)果一覽表
Tab.2 The G/P genotyping result of rotavirus A in Henan Province from 2008 to 2014

GenotypeYearRatio2008200920102011201220132014Total(%)G9P[8]1173646611215333548.7G3P[8]30312723149814220.6G2P[4]59611817147010.2G1P[8]1714138111268111.8G9P[4]010016081.2G39P[8]000104271.0G2P[4][10]112031081.2G9P[4][8]0233131131.9G4P[9]000120140.6G13P[8]000021140.6G1P[+]3333200142.0G234P[8]000010010.1G389P[6][8]000010010.1總計Total5778909610717486688100.0

注：P[+]為P未分型；G13P[8]、G389P[6][8]等表示G和(或)P型別的混合感染

圖1 2008-2014年河南省5歲以下腹瀉患兒A組輪狀病毒檢出率月分布Fig.1 Detection rate trend of rotavirus A in children under 5 years in Henan Province from 2008 to 2014

2.3 A組輪狀病毒感染病例流行病學資料分析 688例A組輪狀病毒感染病例中，男女性別比1.2∶1(377∶311)；城市陽性率23.7%(219/926)，農(nóng)村陽性率40.0%(469/1 172)，農(nóng)村顯著高于城市；陽性病例以4-12個月齡嬰幼兒為主；臨床上存在不同程度的發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀。病例年齡及臨床體征分布見表3。

M: 100 bp DNA marker；1，2，5，6，8，9，11，13，16：G9P[8]；3，7，12，14：G2P[4]；4，15：G9P[4][8]；10: G2P[4][10]；The upper half of the map is G genotyping and the lower part is P genotyping.圖2 A組輪狀病毒G/P分型 PCR結(jié)果凝膠電泳圖譜(部分)Fig.2 The gel electrophoresis map of rotavirus A G/P genotyping results (partly)

表3 A組輪狀病毒陽性病例年齡與臨床癥狀統(tǒng)計表
Tab.3 Statistics of age and clinical symptoms of group A rotavirus positive cases

agecase/(%)temperature,(℃)case/(%)diarrheatimescase/(%)vomitingtimescase/(%)dehydration(%)case/(%)0-3months78/11.3<37539/78.30-3199/28.90594/86.30589/86.34-6months187/27.237-37.5102/14.84-6369/53.61-275/10.91-591/13.27-12months189/27.537.6-3821/3.17-979/11.53-412/1.7>58/1.21-2yrs73/10.6>3826/3.810-1541/6.0>47/1.02-3yrs40/5.83-4yrs88/12.84-5yrs33/4.8

3 討 論

輪狀病毒(Human rotavirus, HRV)是病毒性腹瀉的主要病原體，根據(jù)HRV內(nèi)殼蛋白VP6抗原將HRV分為A-G 7個組，其中A、B、C 3組可以感染人[3]。A組輪狀病毒為較為少見的雙鏈RNA病毒，顆粒直徑70 nm，二十面體對稱，是5歲以下兒童感染性重癥胃腸炎(腹瀉)的主要病原，也是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉和死亡的重要疾病之一，占腹瀉住院兒童的比例超過40%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，全球范圍內(nèi)每年大約引起61.1萬嬰兒和兒童死亡，特別是在非洲，亞洲及南美洲等發(fā)展中國家[4-5]。輪狀病毒感染屬于自限性疾病，由于常規(guī)的衛(wèi)生和消毒措施對阻止病毒感染的效果并不明顯，接種疫苗成為了當前世界范圍內(nèi)預(yù)防該病的主要醫(yī)療手段。WHO在2009年已建議把輪狀病毒疫苗接種列入所有國家的免疫規(guī)劃中[6]。由于A組輪狀病毒抗原型別的復(fù)雜性、多樣性及變異性，持續(xù)開展其病原學監(jiān)測，掌握其感染狀況及基因型別的分布和變異趨勢對于開展疾病負擔調(diào)查，制定防控策略能夠提供重要的基線數(shù)據(jù)，同時為疫苗研發(fā)和改進也提供了最關(guān)鍵的參考依據(jù)。

A組輪狀病毒核衣殼蛋白可分為外殼蛋白和內(nèi)殼蛋白，外殼蛋白以VP4和VP7為主，是A組輪狀病毒主要的抗原決定子，其所對應(yīng)核酸序列是進行G/P基因分型的依據(jù)。全球不同地區(qū)流行病學調(diào)查表明，不同的時間、不同的地區(qū)其流行株有較大差異。Gl、G2、G3、G4以及P[4]、P[6]、P[8]是世界范圍內(nèi)包括中國最常見的優(yōu)勢型，直到上世紀90年代中葉，最常見的四種組合依然為G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]和G4P[6][7-8]。近年來，HRVA又呈現(xiàn)新的分子流行病學特點，G9型呈快速上升趨勢，G9P[8]型別已成為第5種新的流行型別[9]。從本研究看，河南省HRVA的基因型別以G9P[8]、G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]為主，這和目前世界范圍的HRVA的病原學特征和流行趨勢是一致的。從河南省的歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)看，G9P[8]是型別占比上升最為迅速的型別，其從2008年的1.8%上升至2014年的61.6%，已成為河南省5歲以下兒童HRVA感染的主要型別。另外河南省HRVA病原學的另一個特點就是存在混合感染型別，由于HRVA的易感性、抗原多樣性及機體感染后免疫力難以持久和交叉免疫保護力弱等特點，5歲以下兒童感染率可接近100%，且易形成不同型別的反復(fù)感染，因此在同一病人體內(nèi)檢測出多種型別的混合感染是可以解釋的。

從陽性病例的流行病學資料來看，河南省HRVA感染的男性多于女性，年齡分布以4個月到1歲為主，2到5歲間感染率呈下降趨勢。農(nóng)村感染率顯著高于城市，這與河南省細菌性腹瀉感染率的城鄉(xiāng)差別一致。臨床癥狀主要是以輕癥腹瀉為主，少量病人伴有發(fā)熱、嘔吐、脫水等癥狀，體現(xiàn)了輪狀病毒致病力、毒力較弱的特點。從檢出率的時間變化趨勢看，河南省的HRVA感染除了具有“秋季腹瀉”的季節(jié)性特點外，在春季也存在一個小高峰。研究表明，HRVA的環(huán)境存活狀況與溫度和濕度密切相關(guān)[10]，河南省作為中部偏北地區(qū)，春季和秋冬季大氣環(huán)境方面近似，溫度與濕度相差不大，客觀上為HRVA的繁殖和傳播提供了一個相對適宜的環(huán)境，也是春季檢出率偏高的主要原因之一。

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Etiologic and epidemiological research of rotavirus group A in children with diarrhoea under five years in Henan Province from 2008 to 2014

ZHAO Jia-yong, ZHANG Bai-fan, SHEN Xiao-jing, XIA Sheng-li, HUANG Xue-yong, XU Bian-li

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

To investigate the infectious status and epidemiological characteristics of group A rotavirus from children under five years old from 2008 to 2014 in Henan Province, stool samples were collected from two sentinel hospitals and detected by double antibody sandwich ELISA method, then the viral RNA were extracted from positive samples and made G/P genotyping with two-step nested multiplex RT-PCR. Meanwhile, clinical and epidemiological information of positive cases were also analyzed. Results showed that 688 positive samples of group A rotavirus were detected from 2 098 diarrhea samples and the total positive rate was 32.8% with the highest positive rate in 2013 (46.4%) and the lowest positive rate in 2009 (26.7%). There were two seasonal positive rate peaks in autumn and spring season. G9P[8],G2P[4],G3P[8]and G1P[8]were the main combination genotypes. It also existed mixed infection types. The cases distributed from age of 4 months to 1 years old mainly, with no or mild clinical symptoms mostly.In conclusion a higher infection rate of group A rotavirus is in children under 5 years old in Henan Province, the pathogen can be divided into various genotypes and infection cases had significant epidemiological characteristics.

group A rotavirus; children; genotyping; epidemiologic features

Xu Bian-li, Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.016

許汴利，Email: xubl@hncdc.com.cn

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所，鄭州 450016

R373.2

B

1002-2694(2016)10-0934-05

2016-03-21；

2016-09-20

十二五科技重大專項“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治專項”(No.2013ZX10004203；2012ZX10004215)，河南省科技攻關(guān)課題(No.152102310133)

Supported by the National Science and Technology Major Projects of China (Nos. 2012ZX10004215 and 2013ZX10004203), the Scientific and technological project of Henan Province “Molecular typing and network tracing technology application research of bacterial pathogens” (No. 152102310133)