樓宏強，高素華，李旭升，陳浩浩，胡 野

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基于OMP18的B細胞抗原表位的空腸彎曲菌ELISA檢測方法的建立

樓宏強，高素華，李旭升，陳浩浩，胡 野

目的 以OMP18的B細胞抗原表位多肽為包被抗原，建立檢測空腸彎曲菌感染的ELISA方法。方法 以不同濃度梯度(0.1，1，10 μg/mL)OMP18的B細胞抗原表位多肽進行包被，以空腸彎曲菌全菌兔抗IgG為一抗，HRP標記的羊抗兔抗體IgG為二抗，檢測對原濃度1 mg/mL的不同稀釋度(1∶10，1∶100，1∶1 000)抗體IgG水平。分別以空腸彎曲菌感染兔血清、健康兔血清及沙門菌感染兔血清為一抗，1∶3 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，比較各抗原表位多肽的免疫特異性。結果 OMP18的B細胞抗原3個表位多肽在稀釋度在1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000時免疫反應性均有明顯增高。其中稀釋度在1∶1 000時增高最明顯。OMP18的B細胞抗原表位多肽具有免疫特異性。結論 用OMP18的B細胞抗原表位多肽作為包被抗原對空腸彎曲菌感染的血清進行ELISA檢測，免疫反應性高，具有免疫特異性。

空腸彎曲菌；外膜蛋白OMP18；抗原表位；酶聯免疫吸附實驗

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是常見的人畜共患病病原菌，也是一種食物源性病原菌，可在人和動物引起多種疾病，被認為是人類細菌性腹瀉的主要致病菌?？漳c彎曲菌為革蘭氏陰性桿菌，嗜熱，微需氧，培養(yǎng)條件苛刻，在富營養(yǎng)、微需氧的環(huán)境下才能生長。其主要傳染源為動物或動物產品，廣泛分布于各種動物體內，以禽畜、寵物為常見宿主，因此研究快速而特異的分離和檢測方法具有重要的現實意義。我們前期從生物信息學角度了解空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜結構、B細胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征[1]。本研究以OMP18優(yōu)勢B細胞抗原表位多肽序列為依據，合成多肽進行抗原表位的免疫學檢測，并建立相關的ELLISA檢測方法，為空腸彎曲菌的檢測和疫苗研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 OMP18的B細胞抗原表位多肽由上海紫域生物科技有限公司合成。采用固相多肽合成技術，以N-α-Fmoc保護的氨基酸為原料，Fmoc-AA-Wang樹脂為載體，HBTU方法偶聯。經HPLC鑒定純度在95%以上，相關檢測方法已申請專利[2]?？漳c彎曲菌OMP18的B細胞抗原具有3個表位，A抗原表位肽序列為STKSTSVSGDSSVDSNRGSGGSDGWDID，B抗原表位肽序列為EGNCDEWGTDEYN，C抗原表位肽序列為SYGETNPVCTEKTKACDAQNRR。包被液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6；洗滌液為0.02 mol/LTrisHCl-Tween20，pH7.4；抗體稀釋液為0.05 mol/LPBS-Tween20，pH 7.4；封閉液為10 g/L牛血清白蛋白(BSA)；終止液為2 mol/L H2SO4；HRP標記的羊抗人IgG。均購自杭州澤衡生物科技有限公司。

1.2 抗原包被 用包被液將包被抗原稀釋成2.5、5、10、15、20 μg/mL，包被ELISA板每孔加入100 μL，于4 ℃過夜；洗滌4次并空干后，每孔加入封閉液300 μL，4℃封閉過夜；共洗滌4次，密封后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫反應性測定 96孔酶標板階梯濃度(1∶1 000，1∶4 000，1∶16 000，1∶64 000)每孔加入各抗原表位肽各50 μL，4 ℃包被過夜，各抗原表位肽樣本均重復3孔。次日用含0.05%Tween20的PBS洗滌3次，然后用5%小牛血清4 ℃封閉過夜。以1∶3 000稀釋的兔抗CJ為一抗、1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，TMB為底物，采用ELISA檢測各抗原表位肽的免疫反應性。實驗中分別設置等量BSA為包被抗原的陰性對照，以OMP18蛋白為包被抗原的陽性對照，以陰性對照樣本OD值+3SD作為陽性判斷標準。

1.5 重復性實驗 3個表位均采用上述同樣方法進行重復測定，以檢測PN值。

2 結 果

2.1 OMP18的B細胞抗原表位多肽血清最佳稀釋度 ELISA檢測結果顯示，OMP18的B細胞抗原3個表位多肽在稀釋度在1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000時免疫反應性均有明顯增高。其中稀釋度在1∶1 000時增高最明顯，A抗原表位肽OD值為2.791，B抗原表位肽OD值為2.601，C抗原表位肽OD值為2.876。見圖1。

圖1 3個表位梯度濃度ELISA檢測兔空腸彎曲菌全血抗體的結果Fig.1 Detection of rabbit’s blood antibody against Campylobacter jejuni of 3 epitopes with gradient concentrations by ELISA

2.2 OMP18的B細胞抗原表位多肽免疫特異性

采用ELISA檢測各抗原表位肽的免疫特異性結果提示，空腸彎曲菌感染兔血清免疫反應性高，A抗原表位肽OD值為1.076，B抗原表位肽OD值為0.921，C抗原表位肽OD值為0.998。健康兔血清，大腸埃希菌、痢疾志賀菌及傷寒沙門菌感染兔血清免疫反應性低，與空腸彎曲菌感染兔血清相比，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

1.Serum from a rabbit infected with Campylobacter jejuni; 2.Serum from a healthy rabbit;3.Serum from a rabbit infected with Escherichia coli;4.Serum from a rabbit infected with Shigella dysenteriae; 5.Serum from a rabbit infected with Salmonella typhi.圖2 3個表位免疫特異性ELISA檢測結果Fig.2 Detection of immunological of 3 epitopes by ELISA

2.3 重復性實驗 根據重復性實驗測定的PN值，進行統(tǒng)計學處理，t值為1.70，P>0.05，表明差異無統(tǒng)計學意義，說明此實驗有較好的重復性。

3 討 論

空腸彎曲菌是重要的食源性致病菌，也是引起人類腹瀉的主要致病菌之一，可通過食物鏈傳染給人，引起人的急性腸胃炎和發(fā)熱，進而可引發(fā)心內膜炎、骨髓炎、關節(jié)炎等全身性疾病。在病原體致病過程中，外膜蛋白在免疫反應中表現出重要作用，其通過增強巨噬細胞攝取抗原能力，促進了淋巴細胞活化，并廣泛作為病原體感染的檢測及保護性疫苗抗原篩選[3]。OMP18是空腸彎曲菌主要外膜蛋白，分子質量為18 kD，由OMPl8基因編碼。由于在彎曲菌屬中普遍存在，因此OMP18是血清學檢測空腸彎曲菌感染的重要候選抗原[4]。前期我們使用TMHMM Server V2.0, DNA Star,NCBI/Blast等生物信息分析軟件分析了空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的結構和分子特征，并對運用ELISA鑒定了其中可能存在的線性B細胞表位[1]。空腸彎曲菌OMP18無跨膜結構存在，全部定位于細菌表面。域預測蛋白功能結構表明OMP18中存在OMP A結構域，并與空腸彎曲菌的粘附能力密切相關。二級結構分析結果顯示，在OMP18蛋白中有3個線性B細胞表位，其具有良好的抗原性和親水性。應用空腸彎曲菌全菌抗體對預測表位進行ELISA鑒定結果顯示3個表位多肽均能與全菌抗體有效結合，但結合力并不一致。

空腸彎曲菌體外培養(yǎng)困難，生長條件要求苛刻，常規(guī)培養(yǎng)方法對于快速準確的檢測與鑒定有一定的難度[5]。高長航等[6]采用增菌法從180例腹瀉患者糞便中檢出空腸彎曲菌20株，較直接法陽性率高。增菌法的優(yōu)點是：空腸彎曲菌有較好的生長能力；有較強的抑制雜菌能力，一般細菌不易生長。許旭萍[7]等用Skirrow為基礎培養(yǎng)基，加入適量維生素B12、FeSO2和活性炭，以50%卵黃鹽水替代凍溶羊血，制成改良的Skirrow培養(yǎng)基，容易配制，經濟方便，用于空腸彎曲菌的分離和選擇性增菌培養(yǎng)切實可行。王曉英等[8]建立了疏水柵濾膜-酶免疫方法，其對嗜熱性空腸彎曲桿菌具有特異性和簡單方便，目前已被用于雞肉沖洗水和牛奶樣品中空腸彎曲桿菌的檢測和計數。疏水柵濾膜就是將疏水線印在膜上，從而使微生物的生長被限制在膜上的1600個方格內，增加檢測和自動計數細菌的敏感性。應用特異性抗體在疏水柵濾膜上載樣，進行酶免疫試驗。主要步驟都在室溫下進行，操作時長不足3 h，具有簡單、快速、特異特點。侯建軍等[9]采用VSl基因保守序列為模板，自行設計引物，擴增產物為516 bp片段。該方法只出現空腸彎曲菌擴增產物，而不出現其他彎曲菌和其他屬細菌的特異性片段，檢測靈敏度高達6 CFU/mL。該方法提供了一種鑒別空腸彎血菌和結腸彎曲菌的簡便方法。劉光明[10]針對空腸彎曲菌馬尿酸酶(hipO)基因和鞭毛蛋白A(flaA)基因設計了2組引物與熒光標記探針，初步建立了空腸彎桿曲菌的磁捕獲-熒光PCR的鑒定和快速檢測方法，能提高農產品及食品中空腸彎曲菌的檢出率。可見，對空腸彎曲菌的檢測方法已經有了初步的研究，進一步研究其毒力因子的功能、合成及致病機理，篩選具有免疫保護作用的表面抗原成分并建立快速特異的檢測方法等有待進一步深入和研究。

本研究在前期采用懸浮芯片技術，篩選出3個空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18優(yōu)勢B細胞線性抗原表位基礎上，建立了基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18優(yōu)勢B細胞線性抗原表位的ELISA方法，具有良好的重復性、特異性、敏感性特點，能應用于實驗室對空腸彎曲菌的鑒別分析，對于空腸彎曲菌的檢測具有一定的意義。

[1] Lou HQ, Hu Y, Wang L, et al. Analysis and identification of B cell epitopes of the OMP18 fromCampylobacterjejuni[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(7): 739-742. (in Chinese)

樓宏強, 胡野, 王嵐, 等. 空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的B細胞抗原表位分析及功能鑒定[J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(7): 739-742.

[2] Lou HQ, Shan XY, Song CH, et al. Screening and identification of B cell epitopes method of the OMP18 fromCampylobacterjejuni[P]. Chinese patent: CN103941018A, 2014.03.27 (in Chinese)

樓宏強, 單小云, 宋春涵, 等. 一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的B細胞抗原表位篩選及功能鑒定方法[P]. 中國專利：CN103941018A, 2014.03.27

[3] Sizemore DR, Warner B, Lawrence J, et al. Live, attenuatedSalmonellatyphimuriumvectoring Campylobacter antigens[J]. Vaccine, 2006, 24(18): 3793-3803. DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.07.026

[4] Qu HH, Wang J, Wang JW, et al. Research progress of pathogenic and pathogenic mechanism ofCampylobacterjejuni[J]. Prog Veter Med, 2013, 34(12): 164-169. (in Chinese)

翟海華, 王娟, 王君偉,等.空腸彎曲菌的致病性及致病機制研究進展[J].動物醫(yī)學進展, 2013, 34(12): 164-169.

[5] Sandberg M, Nygard K, Meldal H, et al. Incidence trend and risk factors forCampylobacterinfections in humans in Norway[J]. BMC Pub Heal, 2006, 6(13): 1-8. DOI: 10.1186/1471-2458-6-179

[6] Gao CH, Li RB, Huang Y. Application of selective enrichment method for detection ofCampylobacterjejunifrom feces of diarrhea patients[J]. J Huaihai Med, 1997, 15(2): 28. (in Chinese)

高長航,李瑞斌,黃永.應用選擇增菌法從腹瀉病人糞便中檢出空腸彎曲菌[J].淮海醫(yī)藥,1997,15(2):28.

[7] Xu XP, Li HZ. Study on the culture of theCampylobacterjejuniusing Egg Yolk Salt instead of frozen blood solution[J]. J Fujian Norm Univ, 1996, 12(4): 86-90. (in Chinese).

許旭萍, 李惠珍. 用卵黃鹽水代替凍溶羊血培養(yǎng)空腸彎曲菌的研究[J]. 福建師范大學學報, 1996, 12(4): 86-90.

[8] Wang XY. Rapid detection and counting method ofBacilluscoliin food[J]. Fore Med Sci (Hyg), 2003, 30(3): 180-182. (in Chinese)

王曉英. 食品中空腸彎曲桿菌快速檢測及計數方法[J]. 國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊, 2003, 30(3): 180-182.

[9] Hou JJ, Zhu JG, Hua XG, et al. Establishment of PCR detection method forCampylobacterjejuniin animals and their products[J]. Chin J Zoonoses, 2008, 24(2): 128-131. (in Chinese)

侯建軍, 朱建國, 華修國, 等. 動物及其產品中空腸彎曲菌PCR檢測方法的建立[J]. 中國人獸共患病學報, 2008, 24(2): 128-131.

[10] Liu GM, Cai HN, Cao MJ, et al. A new method for detecting viable non-cultured state ofCampylobacterjejuni[J]. J Chin Insti Food Sci Tech, 2006, 6(4): 122-126. (in Chinese)

劉光明,蔡慧農,曹敏杰,等.一種檢測活的非可培養(yǎng)狀態(tài)空腸彎曲菌的新方法[J].中國食品學報, 2006, 6(4): 122-126.

Establishment of ELISA method for detectingCampylobacterjejunibased on the B-cell antigen epitope of OMP18

LOU Hong-qiang, GAO Su-hua, LI Xu-sheng, CHEN Hao-hao, HU Ye

(MedicalSchool,JinhuaPolytechnic,Jinhua321007,China)

This study aims to establish an ELISA method for detection ofCampylobacterjejuniinfection by using the B-cell antigen epitope polypeptide of OMP18 as the coating antigen. Using the B-cell epitope peptides with different concentrations (0.1,1 and 10 μg/mL) as the coating antigens, the rabbit anti-CampylobacterjejuniIgG antibody as the primary antibody and the HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody as the secondary antibody, the researchers detect the levels of IgG antibody after different dilutions (1∶10, 1∶10 and 1∶1 000) based on its original concentration of 1 mg/mL. The researchers also compare different immunological specificities of epitope peptides via using the serum from a healthy rabbit, the serums respectively from the rabbits infected withCampylobacterjejuniandSalmonellaas the primary antibody as well as the HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody(1∶3 000) as the secondary antibody. The immunoreactivity of three B cell antigen epitope polypeptides of OMP18 significantly increase in the dilutions of 1∶1 000,1∶4 000 and 1∶16 000 and 1∶64 000,while it finds the most significant increase in a 1∶1 000 dilution.Therefore, the B-cell epitope peptides of OMP18 indeed features an immunological specificity. And the study indicates that the ELISA is a desirable method capable of detectingCampylobacterjejuniinfection by using OMP18 B cell antigen epitope polypeptide as the coating antigen with a high immune response and a specific immunity.

Campylobacterjejuni; OMP18; antigenic epitope; enzyme linked immunosorbent assay

Hu Ye, Email: huye8254@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.008

浙江省公益性技術應用研究計劃資助項目(No.2013C33215)；金華市科技研究計劃資助項目(No.2013-3-017)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計劃資助項目(No.2013KYA214)

胡野，Email:huye8254@vip.sina.com

金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院，金華 321007

R378.2

A

1002-2694(2016)10-0889-04

2016-04-11；

2016-08-16

Supported by the Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (No.2013C33215) and the Jinhua Science and Technology Research Project (No.2013-3-017),and the Zhejiang Medical and Health Project (No. 2013KYA 214)