扎格樂，邊鑫，趙莉，徐敏，王娜娜，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

沙棘籽提取物抑菌能力的研究及其生物活性成分分析

扎格樂，邊鑫，趙莉，徐敏，王娜娜，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

選取蒙古國(guó)不同產(chǎn)地和不同培育方式的5種沙棘籽的活性成分進(jìn)行了提取，研究了提取物對(duì)常見致病菌的抑菌能力，并對(duì)其中的生物活性成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，野生沙棘籽1號(hào)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)（12.3±0.5）mm，而3號(hào)提取物具有廣譜抑菌能力，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別達(dá)到(11.5±0.5）mm、（12.3±0.2）mm和（11.9±0.3）mm，并且隨著沙棘籽提取物的用量增加，其抑菌能力增強(qiáng)。沙棘籽提取物中主要的生物活性成分主要為植物甾醇、黃酮類物質(zhì)、植物磷脂和維生素C，其中植物甾醇含量越高，對(duì)應(yīng)的抑菌能力越強(qiáng)。

沙棘籽；生物活性成分；抑菌能力

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn）原產(chǎn)于溫帶、亞熱帶的歐亞地區(qū)。中國(guó)是世界上對(duì)沙棘利用率最高的國(guó)家，早在古代，許多醫(yī)學(xué)名著中均有對(duì)沙棘果補(bǔ)脾健胃、活血化瘀和清熱止瀉等醫(yī)藥功效的記載。據(jù)國(guó)內(nèi)外專家研究發(fā)現(xiàn)，沙棘的果實(shí)、葉、種子和皮等各器官均有多種營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[1-3]，除此之外，沙棘酸奶、沙棘果汁和果醬等產(chǎn)品也倍受人們歡迎[4-5]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，沙棘中含有各種生物活性成分，諸如沙棘葉子中的黃酮類物質(zhì)及多糖類物質(zhì)。其中，萬(wàn)方瓊等[6]研究了沙棘葉中總黃酮的提取方法，為相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)；李淑珍等[7]優(yōu)化了沙棘葉中黃酮的純化工藝，經(jīng)優(yōu)化得黃酮精制品1.29 g，總黃酮含量為14.89%，比粗制品的黃酮含量提高了103倍，且優(yōu)化的工藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；趙二勞等[8]優(yōu)化了沙棘葉中多糖的提取，在微波輔助的條件下可有效提高多糖的提取率。

為了防止食品的腐敗變質(zhì)，各種化學(xué)防腐劑越來(lái)越多的添加到食品中，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人們的身體健康造成潛在的危害，隨著人們消費(fèi)水平的提高，無(wú)毒、無(wú)害的天然食品防腐劑成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。沙棘中富含生物活性成分，而且，研究證實(shí)其具有較強(qiáng)的抑菌潛力[9]。本實(shí)驗(yàn)選取蒙古國(guó)不同產(chǎn)地和不同培育方式的5種沙棘籽的活性成分進(jìn)行了提取，然后研究了提取物對(duì)常見致病菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌）的抑菌能力、抑菌譜以及不同的用量對(duì)抑菌能力的影響，并對(duì)其中的生物活性成分進(jìn)行了初步分析。旨在為沙棘籽提取物作為生物防腐劑提供理論依據(jù)，開發(fā)一種新型的天然防腐劑具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料與菌株

分別選取蒙古國(guó)3個(gè)不同地區(qū)的野生沙棘1號(hào)（鄂爾渾）、2號(hào)（達(dá)爾汗烏勒）、3號(hào)（肯特）和兩個(gè)不同地區(qū)人工培養(yǎng)的沙棘A（戈壁松布爾）和B（戈壁阿爾泰）。綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC 10419、大腸桿菌（Escherichia coli）CICC 10004、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC10201和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CICC 10732、卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）CICC2632、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）CICC 40658、白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 18804、黃曲霉（Aspergillus flavus）CICC 2091、拜耳接合酵母（Zygosaccharomycesbailii）CICC1281、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）CICC 1714、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）CICC 32519和蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CICC21290均購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Chinacenterofindustrialculturecollection，CICC）；單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115、沙門氏菌（Salmonella）ATCC 14028、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 1.0344、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）KLDS 1.0381、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）KLDS AD1、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）KLDS 1.8701、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）KLDS4.0325、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）KLDS1.0205和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）KLDS3.0207均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase（tryptic）soy broth，TSB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L。

腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，脫水小牛腦浸粉12.5 g/L，脫水牛心浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖2 g/L，磷酸氫二鈉2.5 g/L（固體培養(yǎng)基中加15 g/L瓊脂），調(diào)pH值為7.4。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取馬鈴薯浸取液1.0 L加入葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，維生素B1微量，瓊脂15.0 g/L，調(diào)pH為6.0。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁150 mL，pH自然（6.4）。以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌15 min。

1.1.3試劑

所有試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

XS104分析天平：瑞士METTLERTOLEDO公司；DU-800紫外分光光度計(jì)：美國(guó)BECKMAN公司；BCN1360生物潔凈工作臺(tái)、HH-8電熱恒溫水浴鍋：上海智城分析儀器制造有限公司；LTI-700電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海佳勝試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1沙棘籽提取物的制備

將沙棘清洗干凈，晾干后用坩堝桿將其搗碎，取出沙棘籽。用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)清洗沙棘籽3～4次，沙棘籽烘干后用坩堝桿將其搗碎；然后以甲醇∶水為6∶4（V/V）的溶液為提取溶劑，在料液比1∶1（g∶mL）、提取溫度50℃條件下，提取2次，每次3 h，取濾液制得沙棘籽提取物，放置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2沙棘籽提取物抑菌能力的測(cè)定

選取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其中金黃色葡萄球菌用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用濾紙片法測(cè)定抑菌活性，即將指示菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期，然后在無(wú)菌平板中加入已接入指示菌的瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，用無(wú)菌鑷子放入濾紙片，取沙棘籽提取物溶解在丙二醇的溶液（0.5 mg/mL）并在濾紙片（直徑為6 mm）上加入50 μL不同組沙棘籽提取物溶液，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑的大小。以等量的慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照，為無(wú)菌蒸餾水為陰性對(duì)照，研究不同來(lái)源沙棘籽提取物活性成分的抑菌能力。

1.3.3沙棘籽提取物的抑菌譜

為了確定沙棘1號(hào)和沙棘3號(hào)提取物的抑菌譜，選取了18株指示菌包括食源性致病菌、霉菌、枯草芽孢桿菌以及部分乳酸菌進(jìn)行了評(píng)價(jià)。具體評(píng)價(jià)方法參照1.3.2中的濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，濾紙片直徑6 mm，并對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量。

1.3.4沙棘籽提取物含量與抑菌能力關(guān)系的研究

選取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌，加大沙棘籽提取物溶液至100 μL、150 μL，探究沙棘籽提取物活性成分含量與抑菌能力關(guān)系。

將指示菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期，然后在無(wú)菌平板中加入已接入指示菌的瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，用無(wú)菌鑷子放入濾紙片（直徑為6 mm），并在濾紙片上加入100 μL、150 μL不同組沙棘籽提取物溶液，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑的大小。

1.3.5沙棘籽提取物生物活性成分的測(cè)定

植物甾醇含量參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.128—2003[10]《食品中膽固醇的測(cè)定》中鐵礬顯色法和竇巍巍等[11]所述的方法進(jìn)行測(cè)定；總黃酮含量參考蔡定建等[12]所述的方法進(jìn)行測(cè)定；植物磷脂、維生素C含量參照中華人民共和國(guó)水利行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SL 493—2010《沙棘籽油》[13]中活性物質(zhì)的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理均通過(guò)SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較采用Duncan法，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有顯著性意義；圖表運(yùn)用Excel 2007進(jìn)行繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1沙棘籽提取物活性成分提取物對(duì)常見致病菌的抑菌作用

由于沙棘籽提取物中含有豐富的生物活性物質(zhì)，其中大多數(shù)成分均對(duì)常見致病菌有抑制作用[15]。不同沙棘籽樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌能力，結(jié)果如圖1所示。

由圖1a可知，1號(hào)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到12.0 mm，但與慶大霉素抑菌圈直徑（23.5±0.4）mm相比還有一定差距；由圖1（b～d）可知，3號(hào)樣品對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為（11.5±0.5）mm、（12.3± 0.2）mm和（11.9±0.3）mm，但與慶大霉素（抑菌圈直徑分別為（20.6±0.4）mm、（22.4±0.7）mm和（21.8±0.5）mm）相比還有一定差距，這可能由于沙棘籽活性物質(zhì)提取物中有效成分的濃度未達(dá)到閾值，因此，需要進(jìn)一步濃縮純化提高其濃度和純度。

整體來(lái)說(shuō)，野生沙棘籽1號(hào)和3號(hào)樣品對(duì)指示菌的抑菌能力于其他樣品強(qiáng)，這可能由于是天然培養(yǎng)條件下的沙棘中有效成分種類更為豐富或有效成分含量更多，而人工培養(yǎng)條件可能改變了有效營(yíng)養(yǎng)成分種類和含量，從而導(dǎo)致其抑菌能力稍差，該結(jié)果與HANDIQUE P J等[14]的研究結(jié)果一致。因此，選擇野生沙棘籽1號(hào)和3號(hào)樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2沙棘籽野生提取物的抑菌譜

為了考察沙棘籽1號(hào)和3號(hào)提取物對(duì)其他菌種的抑菌能力，選取了部分食源性致病菌、霉菌以及部分乳酸菌作為考察對(duì)象進(jìn)行了抑菌譜試驗(yàn)，所得結(jié)果如表1所示。

圖1　不同沙棘籽提取物對(duì)致病菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activities of different sea-buckthorn seed extracts on pathogenic bacteria

由表1可知，沙棘籽3號(hào)提取物對(duì)提供的致病菌、霉菌和酵母菌均具有明顯的抑制作用，而沙棘籽1號(hào)提取物對(duì)提供的致病菌、霉菌和部分酵母菌有抑制作用，其中其對(duì)拜耳接合酵母和漢遜德巴利酵母沒有抑制作用，而且整體的抑菌活性低于沙棘籽3號(hào)提取物。值得注意的是，沙棘籽1號(hào)及3號(hào)提取物對(duì)所提供的乳酸菌均沒有抑制作用，這些乳酸菌通常用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)，因此，沙棘可作為原料或輔料用于發(fā)酵制品生產(chǎn)，而且對(duì)其中的乳酸菌生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生影響。

表1　沙棘籽1號(hào)提取物和沙棘籽3號(hào)提取物的抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of sea-buckthorn seed No.1 and No.3 extracts

2.3沙棘籽提取物活性成分含量與抑菌能力關(guān)系的研究

選取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌為指示菌，加大沙棘籽提取物溶液體積至100 μL、150 μL，探究沙棘籽提取物活性成分含量與抑菌能力關(guān)系，不同來(lái)源沙棘籽提取物對(duì)致病菌抑菌效果分別如圖2A、2B所示。

由圖2A可知，增大沙棘籽提取物溶液至100 μL時(shí)，不同品種沙棘籽提取物的抑菌性均有一定的提高。自然條件下選育的沙棘籽1號(hào)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果（見圖2A-a），抑菌圈直徑達(dá)到12.9 mm，其次為自然條件下選育的品種3號(hào)沙棘籽提取物，抑菌圈直徑約12.3 mm。繼續(xù)增大沙棘籽提取物溶液至150 μL時(shí)（見圖2B），沙棘籽1號(hào)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達(dá)到13.2 mm，其次為自然條件下選育的品種3號(hào)沙棘籽提取物，抑菌圈直徑約12.8 mm。結(jié)果表明，加大沙棘籽提取物的添加劑量，可以提高其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

圖2　不同用量沙棘籽提取物對(duì)致病菌抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of different addition of sea-buckthorn seed extracts on pathogenic bacteria

增大沙棘籽提取物活性成分的含量至100 μL和150 μL，不同品種沙棘抗枯草芽孢桿菌（見圖2A-b和2B-b）潛力也有一定的提高，具體表現(xiàn)在5種沙棘籽提取物中，自然條件下選育的沙棘籽3號(hào)提取物對(duì)枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑達(dá)到11.9 mm和12.1 mm，其次為自然條件下選育的品種1號(hào)沙棘籽提取物，抑菌圈直徑約11.3 mm和11.9 mm，再次為自然條件下選育的品種2號(hào)沙棘籽提取物，而人工培育出的沙棘籽提取物具有較弱的抗枯草芽孢桿菌潛力。由圖2A-c、2B-c、2A-d和2B-d可知，增大沙棘籽提取物活性成分的含量至100 μL和150 μL，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在不同品種沙棘籽對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌能力試驗(yàn)中。結(jié)果表明，加大沙棘籽提取物的添加量，可以提高其對(duì)致病菌的抑菌活性。

2.4沙棘籽提取物中的生物活性物質(zhì)含量分析

同一植物在不同地區(qū)會(huì)因氣候、土壤和環(huán)境等因素的影響，在生長(zhǎng)過(guò)程中累積不同的生物活性物質(zhì)。對(duì)不同地區(qū)人工培養(yǎng)和自然生長(zhǎng)條件下的沙棘籽中的生物活性成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果如表2所示。

表2　不同地區(qū)沙棘籽中的生物活性成分含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of bioactive components contents in sea-buckthorn seed from different regions

由表2可知，5個(gè)品種的沙棘籽提取物質(zhì)中含有的生物活性成分種類相同，主要為植物甾醇，黃酮類物質(zhì)、植物磷脂和維生素C，但活性成分含量存在一定差異。沙棘籽3號(hào)提取物中含有較高含量的植物甾醇和總黃酮；沙棘籽2號(hào)品種具有較高植物磷脂及維生素C；而沙棘籽1號(hào)提取物、沙棘籽A號(hào)提取物和沙棘籽B號(hào)提取物中各成分含量相對(duì)適中。值得注意的是，5種沙棘籽提取物中植物甾醇含量顯著高于其他活性成分（P＜0.05），而且結(jié)合圖1的結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，植物甾醇含量高的沙棘籽提取物，其抑菌能力也越強(qiáng)。這說(shuō)明，沙棘籽提取物的抑菌活性來(lái)自于植物甾醇的作用。國(guó)內(nèi)外研究表明，沙棘籽提取物中的植物甾醇具有抑菌、抗氧化等作用[15]，這與本研究得出的結(jié)果相吻合。

3　結(jié)論

本研究對(duì)蒙古國(guó)不同產(chǎn)地和不同培育方式的5種沙棘籽提取物的抑菌作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，沙棘籽1號(hào)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，而沙棘籽3號(hào)提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘籽3號(hào)提取物具有廣譜抑菌作用，其對(duì)一些常見的有微生物（致病細(xì)菌、霉菌、酵母菌）抑制作用明顯，而對(duì)于乳酸菌的生長(zhǎng)則沒有抑制作用。不同劑量沙棘籽提取物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘籽提取物的抑菌作用隨著添加劑量的增加而增加。另外，本研究分析了沙棘籽中的植物甾醇、黃酮類物質(zhì)、植物磷脂和維生素C等生物活性成分，其中植物甾醇是沙棘籽提取物中發(fā)揮抑菌作用的主要活性成分。

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Research on the antimicrobial activity of the sea-buckthorn seed extract and analysis of its bioactive components

BAYARAA Zoljargal,BIAN Xin,ZHAO Li,XU Min,WANG Nana,HUO Guicheng*
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The active constituents of five kinds of sea-buckthorn seed with different regions and different cultivation ways from Mongolia were extracted.The antimicrobial activity of extracts on common pathogenic bacteria was researched,and the bioactive components were analyzed.The results showed that the antimicrobial activity of wild sea-buckthorn seed NO.1 extract againstStaphylococcus aureuswas the strongest,and the diameter of inhibition zone was(12.3±0.5)mm.But wild sea-buckthorn seed NO.3 extract had a broad-spectrum antibacterial ability,and the its antimicrobial activity onBacillus subtilis,Escherichia coliandPseudomonas aeruginosawas the strongest,the diameters of inhibition zone were (11.5±0.5)mm,(12.3±0.2)mm and(11.9±0.3)mm,respectively.With the increasing of sea-buckthorn seed extract addition,its antimicrobial activity was stronger.The main bioactive components in sea-buckthorn seed extracts were phytosterol,flavonoids,plant phospholipids and vitamin C,and the higher phytosterols content was,the stronger antimicrobial activity was.

sea-buckthorn seed;bioactive components;antimicrobial activity

TS201.3

0254-5071（2016）08-0110-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.025

2016-03-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401512）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2011AA100902）

扎格樂（1985-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

霍貴成（1958-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。