高梅，曹沖，王功霞，湯連升，賈慶文

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

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文蛤肉水解液的致突變性

高梅，曹沖，王功霞，湯連升，賈慶文

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

目的 評價(jià)文蛤肉水解液的致突變性，為文蛤的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 采用Ames試驗(yàn)、小鼠嗜多染紅細(xì)胞骨髓微核試驗(yàn)和CHL細(xì)胞體外染色體畸變試驗(yàn)3項(xiàng)致突變性試驗(yàn)，檢測文蛤肉水解液有無致突變作用。結(jié)果 Ames試驗(yàn)中文蛤肉水解液各劑量組回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，在加與不加S9時(shí)5株試驗(yàn)菌株結(jié)果為陰性。CHL細(xì)胞體外染色體畸變試驗(yàn)，文蛤肉水解液各劑量組的染色體畸變率與陰性對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)，結(jié)果為陰性。小鼠骨髓微核試驗(yàn)，各劑量組的微核率與陰性對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)，結(jié)果為陰性。結(jié)論 在本試驗(yàn)條件和范圍下，文蛤肉水解液未見潛在的致突變作用。

文蛤；致突變性；Ames試驗(yàn)；染色體畸變試驗(yàn)；微核試驗(yàn)

文蛤(Meretrix Meretrix Linnaeus) 又稱為蛤蜊，是沿海地區(qū)常見的經(jīng)濟(jì)貝類，不僅肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，而且具有極高的藥用價(jià)值，古書籍《本草綱目》、《傷寒論》、《方脈正宗》、《本草備要》中均記載了文蛤的藥用功效[1]。近代研究表明，文蛤中的一些成分，具有廣泛的藥理活性，除具有降血糖、降血脂作用外，還有增強(qiáng)免疫功能、抗艾滋病、抗衰老，抗腫瘤等作用[2-13]，因此，文蛤無論食用、藥用，開發(fā)應(yīng)用前景看好，但對文蛤的毒性研究報(bào)道較少，特別是致突變性?；诖耍瑸榱私馕母蛉馑庖旱闹峦蛔冃?，根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[14]，本文選用標(biāo)準(zhǔn)組合中的體外細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))、體外細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)3項(xiàng)經(jīng)典試驗(yàn)，按照GLP要求對文蛤肉水解液進(jìn)行了致突變性安全性毒理學(xué)評價(jià)，為安全用藥提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

KM小鼠50只，SPF級，體重25～30 g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，試驗(yàn)在本中心屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK(魯)2014 0008】。試驗(yàn)期間動物房環(huán)境溫度為20～26℃，濕度為40%～70%。

1.2 菌株

TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535購自美國Moltox公司。

1.3 細(xì)胞株

中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.4 主要試劑

文蛤肉水解液由山東省藥學(xué)科學(xué)院中醫(yī)藥研究所提供，批號140319；敵克松購自Supelco，批號408-98A；疊氮鈉購自Amresco，批號416A052；2-氨基芴購自Sigma，批號S90850V；1，8-二羥基蒽醌購自Sigma，批號STBC1841V；RPMI 1640購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號NZD1128；新生牛血清購自杭州四季青公司，批號130105；注射用絲裂霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號130607；環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號14010425；肝微粒體酶(S9)，美國Moltox公司。

1.5 主要儀器

LMQ.C立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；TXB622L電子天平，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Thermo 3111二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DM LS2顯微鏡，德國Leica公司；SW-CJ-2FXS超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；HFsafe-1500TE生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司。1.6 試驗(yàn)方法[15-19]

1.6.1 Ames試驗(yàn)

采用TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535 5株試驗(yàn)菌株，對5株菌株分別進(jìn)行組氨酸需求特性鑒定、結(jié)晶紫敏感特性鑒定、紫外線敏感特性鑒定、抗氨芐青霉素特性鑒定、抗四環(huán)素特性鑒定、自發(fā)回變鑒定、回變診斷性鑒定，經(jīng)鑒定合格。每一菌株分別設(shè)5個(gè)劑量組，各劑量組濃度分別為每皿5000、2500、1250、625、312.5 μg，試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對照組和陽性對照組。采用平皿摻入法，每組均做3個(gè)平行皿，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)每皿的回變菌落數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)一次。

1.6.2 染色體畸變試驗(yàn)

CHL細(xì)胞檢測無支原體污染。將指數(shù)生長的CHL細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(每瓶5 mL)，接種濃度為每毫升10×104個(gè)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入受試物，文蛤肉水解液高、中、低劑量組的終濃度分別為5、2.5、1.25 mg/mL，陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)，陽性對照組[-S9：環(huán)磷酰胺，20 μg/mL；+ S9：絲裂霉素，0.15 μg/mL(4 h)、0.05 μg/mL(24 h)]。分別培養(yǎng)4、24 h，4 h組設(shè)+S9組。各組觀察200個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)數(shù)每組細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)畸變率。

1.6.3 小鼠骨髓微核試驗(yàn)

選取25～30 g的KM小鼠50只，每組10只，文蛤肉水解液高、中、低劑量分別為2000、1000、500 mg/kg，同時(shí)設(shè)立陰性對照組、陽性對照組(注射用環(huán)磷酰胺，40 mg/kg)。各劑量組按20 mL/kg體重灌胃給予實(shí)驗(yàn)動物，給藥1次/日，給藥2 d，間隔24 h，末次給藥后20 h取材制備骨髓涂片，陽性對照組單次腹腔注射給藥。計(jì)數(shù)2000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率，計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)所觀察到的正染紅細(xì)胞(NCE)，計(jì)算PCE/(PCE+NCE)的比值。

1.6.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn)

文蛤肉水解液Ames試驗(yàn)結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果可見，不同劑量的文蛤肉水解液在有和無S9活化系統(tǒng)的條件下，其回變的菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，均為超過陰性對照組的兩倍，且各劑量組間無明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，陽性對照組均高于相應(yīng)的陰性對照菌落數(shù)兩倍以上，差異有顯著性(P<0.01)，兩次試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)Ames試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，文蛤肉水解液的Ames試驗(yàn)為陰性。

2.2 染色體畸變試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見表2(觀察細(xì)胞數(shù)為200個(gè))。試驗(yàn)結(jié)果可見，在有和無S9活化系統(tǒng)的條件下，無論染毒4 h還是24 h，陰性對照組染色體畸變率均<5%，不同劑量的文蛤肉水解液染色體畸變率均<5%，與陰性對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)且未呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系；陽性對照組畸變率均>20%，與陰性對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)。顯示文蛤肉水解液的染色體畸變試驗(yàn)為陰性。

2.3 小鼠骨髓微核試驗(yàn)

文蛤肉水解液的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響結(jié)果見表3(觀察細(xì)胞數(shù)2000個(gè))。結(jié)果顯示，各劑量組的PCE/(PCE+NCE)與陰性對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)。各劑量組的小鼠骨髓微核率與陰性對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，而陽性對照組微核率與陰性照組比較差異有顯著性(P<0.01)，有極高的致突變性。結(jié)果表明，文蛤肉水解液對小鼠骨髓微核率的發(fā)生沒有明顯升高作用。

3 討論

致突變性研究在藥物研發(fā)尤其是在藥物篩選階段，處于比較重要的位置，在很大程度上將影響新藥研發(fā)的進(jìn)程。目前我國指導(dǎo)原則中致突變性試驗(yàn)推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合為：① 1項(xiàng)體外細(xì)菌基因突變試驗(yàn)；② 1項(xiàng)采用哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行的體外染色體損傷評估試驗(yàn)，或體外小鼠淋巴瘤tk試驗(yàn)；③ 1項(xiàng)采用嚙齒列動物造血細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)染色體損傷試驗(yàn)[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取了Ames試驗(yàn)、CHL細(xì)胞體外染色體畸變試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)3項(xiàng)經(jīng)典試驗(yàn)對文蛤肉水解液進(jìn)行了致突變性安全性研究。其中，Ames試驗(yàn)是檢測基因突變的最常用方法，染色體畸變試驗(yàn)是反應(yīng)細(xì)胞染色體損傷的敏感指標(biāo)，試驗(yàn)通過顯微鏡直接觀察染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，骨髓微核試驗(yàn)是以誘發(fā)小鼠骨髓紅細(xì)胞微核為指標(biāo)來推斷受試物致染色體或有絲分裂器損傷的一種哺乳動物體內(nèi)試驗(yàn)。

表1 文蛤肉水解液 Ames試驗(yàn)結(jié)果

注：與陰性對照組比較，*P<0.01。

Note. Compared with the negative control, the difference is statistically significant (*P<0.01).

表2 文蛤肉水解液染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

注：pol，多倍體；ctb，染色單體斷裂；f，斷片；dic，雙著絲點(diǎn)；r，環(huán)狀染色體；cte，染色單體交換；g，裂隙；pvz，粉碎；在計(jì)算染色體畸變率時(shí)裂隙不計(jì)入其中。與陰性對照組比較，*P<0.01。

Note. Pol: Polyploidy; ctb: Chromatid break; f: Fragment; dic: Dicentrics; r: Circular chromosome; cte: Chromatid exchange; g: Gap; pvz: Crush; Excluding gaps. Compared with the control group,*P<0.01.

表3 文蛤肉水解液小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果±s，n=5)

注：與陰性對照組比較，*P<0.01。

Note. Compared with the negative control, the difference was statistically significant (*P<0.01).

文蛤肉水解液、各種文蛤提取物、文蛤蛋白、文蛤多糖幾乎都是從鮮文蛤軟體部分提取而來，對這些成分的研究主要集中在其抗腫瘤、抗氧化、抗突變等藥理活性方面[21-25]，隨著對文蛤應(yīng)用的擴(kuò)展，較大量攝入文蛤的安全性受到研究者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用Ames試驗(yàn)、CHL細(xì)胞體外染色體畸變試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)，對文蛤肉水解液進(jìn)行了體外致突變變作用的評價(jià)，從體內(nèi)外比較全面的反映了受試物對原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的致突變性。三個(gè)試驗(yàn)劑量都是根據(jù)指導(dǎo)原則要求所設(shè)計(jì)的最大劑量，使得藥物暴露量得到了保證，同時(shí)均設(shè)立陰性、陽性對照，保證了試驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性。本研究的Ames試驗(yàn)，受試物各劑量組在有無代謝活化系統(tǒng)時(shí)回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組菌落數(shù)2倍，亦無劑量-效應(yīng)關(guān)系，鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 5株試驗(yàn)菌株，在加與不加S9時(shí)，均未呈現(xiàn)遺傳毒性；CHL細(xì)胞體外染色體畸變試驗(yàn)，陽性對照組細(xì)胞畸變率明顯高于陰性對照組，差異有顯著性(P<0.01)，文蛤肉水解液高、中、低劑量組的染色體畸變率均小于<5%，與陰性對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，表明文蛤肉水解液無直接或間接的誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變作用；小鼠骨髓微核試驗(yàn)，陽性對照組細(xì)胞畸變率明顯高于陰性對照組，差異有顯著性(P<0.01)，文蛤肉水解液高、中、低劑量組微核率與陰性對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，表明在所測劑量范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)受試物導(dǎo)致小鼠微核發(fā)生率增加。綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件和劑量范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)文蛤肉水解液致突變性作用。

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Mutagenicity evaluation of the hydrolysate ofMeretrixmeretrixLinnaeus soft tissue

GAO Mei, CAO Chong, WANG Gong-xia, TANG Lian-sheng, JIA Qing-wen

(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Chemical Drugs, Jinan 250101, China)

Objective To evaluate the mutagenicity of hydrolysate ofMeretrixmeretrixLinnaeus soft tissue, so as to provide experimental basis for its exploitation. Methods Three mutagenicity tests were used to evaluate the mutagenic effects, including Ames test, CHL chromosome aberration assay and bone marrow micronucleus assay in mice. Results In Ames test, the revertant colonies numbers in each group were twice less than the numbers of spontaneous revertant colonies, five bacterial strains showed negative results with or without S9 activation, and the result of Ames test was negative. The CHL chromosome aberration assay and bone marrow micronucleus assay showed that the chromosome aberration rate and micronucleus rate of each dose group showed no significant difference compared with the negative control group, respectively (P>0.05). Conclusions Under this condition, the results show that all of the Ames test, chromosome aberration assay and bone marrow micronucleus assay are negative, and no mutagenicity is observed in the hydrolysate ofMeretrixmeretrixLinnaeus soft tissue.

Meretrix Meretrix Linnaeus; Mutagenicity; Ames test; Chromosome aberration assay; Micronucleus assay

GAO Mei. E-mail: gaomei729@163.com

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(項(xiàng)目編號：2014ZZCX02104)。

高梅(1983-)，女，碩士研究生，主管藥師，研究方向：藥物安全性評價(jià)，E-mail： gaomei729@163.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0521-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.015

2016-02-29