魏斐斐廖燕趙瑞強王洪學謝裕安

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室

基礎(chǔ)研究

廣西扶綏縣壯族人群ITGβ1基因多態(tài)性與肝癌家系遺傳易感性的關(guān)系

魏斐斐1廖燕1趙瑞強2王洪學1謝裕安1

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室

目的探討廣西扶綏縣壯族人群中肝癌高發(fā)家系ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）遺傳易感性的關(guān)系。方法采用病例-對照研究方法，選取廣西扶綏縣壯族人群正常對照家系組40名；肝癌高發(fā)家系組79例，其中肝癌患者20例，直系親屬59例。采用質(zhì)譜方法檢測ITGβ1基因rs2298141位點基因型分布頻率，非條件logistic回歸分析不同基因型與HCC發(fā)病風險的關(guān)系。結(jié)果ITGβ1基因rs2298141位點存在AA、AG、GG 3種基因型。ITGβ1基因rs2298141位點基因型分布遵循Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。ITGβ1基因rs2298141位點A等位基因在正常對照組、肝癌高發(fā)家系直系親屬組、肝癌高發(fā)家系肝癌患者組中的分布頻率分別為63.75%、61.02%、70%，G等位基因分布頻率分別36.25%、38.98%和30%，與A等位基因型個體比較，正常對照家系人群中攜帶G等位基因型的個體發(fā)生HCC的風險增加0.75倍（95%CI：0.33～1.7，P=0.50），肝癌高發(fā)家系直系親屬組人群發(fā)生HCC的風險增加0.67倍（95%CI：0.31～1.45，P=0.31）。正常對照家系組、肝癌高發(fā)家系直系親屬組和肝癌高發(fā)家系肝癌患者組人群AA基因型分布頻率分別為40%、42.73%和50%，AG基因型分別為47.5%、37.29%和40%，GG基因型分別為12.5%、20.34%和10%。與AA基因型個體相比，正常家系組和肝癌高發(fā)家系直系親屬組中AG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加0.67倍（95%CI：0.22～2.1，P=0.50）和0.9倍（95%CI：0.31～2.71，P=0.86）；GG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加1.05倍（95%CI：0.17～6.6，P=0.96）和2.2倍（95%CI：0.40～11.96，P=0.37），差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論未發(fā)現(xiàn)ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與廣西扶綏縣肝癌家族聚集的遺傳易感性存在顯著相關(guān)。

肝腫瘤；ITGβ1基因；單核苷酸多態(tài)性；家族聚集性；遺傳易感性

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱“肝癌”）是常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2012年約有782 500例肝癌新增病例和745 500例死亡病例，而中國占新發(fā)和死亡病例的50%左右［1］。除了環(huán)境等外在綜合致癌因素外，肝癌的發(fā)生和發(fā)展與個體間基因型的遺傳多態(tài)性密切相關(guān)。肝癌的發(fā)生存在明顯的家族聚集傾向，說明遺傳因素在肝癌發(fā)病中具有重要作用［2］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor-phisms，SNP）作為第3代遺傳標記，充分解釋了個體之間遺傳易感性的差異，是肝癌遺傳易感性研究的重要物質(zhì)［3］。整合素β1（Intergrin β1，ITGβ1）是生物體內(nèi)一類重要的黏附分子，主要通過介導細胞與胞外基質(zhì)、細胞與細胞之間的黏附而發(fā)揮作用。目前有研究提示，ITGβ1在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成、細胞增殖與凋亡等方面起重要作用［4］，但ITGβ1與肝癌的關(guān)系尚未見報道。質(zhì)譜技術(shù)具有快速、準確、自動化程度高和高通量等特點。本研究采用質(zhì)譜技術(shù)對廣西扶綏縣肝癌高發(fā)家系與正常對照家系中ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性進行檢測與分型，以探討ITGβ1基因多態(tài)性與HCC遺傳易感性的關(guān)系，為進一步探索HCC發(fā)病機制和診斷提供實驗依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象

采用病例-對照研究方法，本研究20個肝癌高發(fā)家系，10個正常對照家系均來自肝癌高發(fā)區(qū)廣西扶綏縣。20個肝癌高發(fā)家系組由肝癌患者20例及其直系親屬59例組成，共79例。肝癌患者為2003年1月至2011年10月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院進行外科手術(shù)的患者，術(shù)后均經(jīng)組織病理學診斷為HCC，術(shù)前未經(jīng)放化療或生物治療。直系親屬指與肝癌患者有直接血緣關(guān)系的未患肝癌的親屬，包括一級親屬（父母、子女、兄弟姐妹）和二級親屬（叔伯、堂兄弟、堂姐妹）。經(jīng)病史采集顯示其直系親屬中至少有1人確診為肝癌。肝癌高發(fā)家系組79例中，男性45例，女性34例，年齡16～86歲，中位年齡44歲；AFP（+）14例，AFP（-）65例；HbsAg（+）50例，HbsAg（-）29例；飲酒（≥100 g/d）64例，不飲酒（＜100 g/d）15例；吸煙（≥10支/d）19例，不吸煙（＜10支/d）60例。

正常對照家系指與肝癌高發(fā)家系居住在同一個村（或街道）或生活環(huán)境相似的臨近村（或街道），民族相同、家庭成員構(gòu)成和經(jīng)濟狀況相似，但與肝癌高發(fā)家系無血緣關(guān)系的家族。本研究正常對照家系組共入選40名，均選自扶綏縣醫(yī)院的健康體檢人群，體檢結(jié)果均正常，無肝炎、腫瘤及遺傳病史，其中男性26名，女性14名，年齡16～85歲，中位年齡47歲；飲酒（≥100 g/d）17名，不飲酒（＜100 g/d）23名；吸煙（≥10支/d）15名，不吸煙（＜10支/d）25名。正常對照家系組與肝癌高發(fā)家系組年齡、性別等比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究按照國家人類基因組研究倫理準則進行，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器血液、細胞、組織DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；iPLEX反應試劑、384-well SpectroCHIP生物芯片、質(zhì)譜檢測儀及點樣儀均購自美國Sequenom公司；HOTSTART Tap酶購自美國Agena Bioscience公司；384孔雙頭PCR儀購自美國ABI公司，PCR擴增引物、單堿基延伸引物購自深圳華大基因公司。

1.2.2DNA提取實驗分析ITGβ1基因型的基因組DNA，采用血液、細胞、組織DNA提取試劑盒提取手術(shù)切除的癌組織（20例）標本的DNA。采用血液DNA提取試劑盒提取肝癌高發(fā)家系組中的直系親屬（59例）及正常對照家系組靜脈血液標本的DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ITGβ1基因型分析

1.3.1引物設(shè)計及合成采用美國Sequenom公司Assay Designer 3.1 software設(shè)計引物，每個SNP位點對應上下游兩條PCR擴增引物和一條延伸引物。PCR上游引物序列為5′-CATGCAAGTTGCAGTTTGC-3′；下游引物序列為5′-CATGCAAGTTGCAGTTTGT-3′；延伸引物序列為5′-CATGCAAGTTGCAGTTTG-3′，引物均由深圳華大基因公司合成。

1.3.2PCR擴增及芯片點樣采用HOTSTART Tap酶在384孔板上常規(guī)進行40個循環(huán)以擴增待測片段，然后將2 μL堿性酸化酶（SAP，美國Sequenom公司）消化液（雙蒸水1.53 μL，HME緩沖液0.17 μL，SAP 0.474 U）加到PCR產(chǎn)物中，消化反應（37℃60 min，85℃10 min），以除去未用盡的dNTP。根據(jù)Sequenom程序進行引物單堿基延伸反應和延伸產(chǎn)物樹脂除鹽純化反應。最后將檢測樣品從384孔反應板轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY SpectroCHIP芯片［5］。

1.3.3飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測SNP位點采用美國Sequenom公司Mass ARRAY時間飛行質(zhì)譜技術(shù)進行ITGβ1的SNP基因分型，TYPER 4.0軟件分析實驗結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)，由深圳華大基因公司的SEQUENOM實驗平臺支持。SNP分型根據(jù)引物延伸反應產(chǎn)物質(zhì)譜峰的位置確定其分子質(zhì)量而得出SNP分型結(jié)果。同一種顏色可以對應2個或3個峰值，分別為SNP位點的延伸引物峰及兩個等位基因峰，若該位點屬于純合子，則僅存在1個等位基因峰；若為雜合子，則存在2個等位基因峰［5］。

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。各組基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗，以判斷各組對象是否具有人群代表性。采用χ2檢驗和非條件logistic回歸分析法計算不同等位基因及基因型的比值比（OR）及95%可信區(qū)間（95% CI）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1基因型檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示ITGβ1基因rs2298141位點存在GG、AG、AA 3種基因型，119例樣本中GG基因型19例、AG基因型49例、AA基因型51例。見圖1。

圖1　ITGβ1基因（rs2298141）SNP位點基因型分型圖

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

在正常對照家系組及肝癌高發(fā)家系各組中進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,以明確ITGβ1基因rs2298141位點基因型的頻率是否遵循遺傳平衡定律。結(jié)果表明，AA、AG、GG基因型頻率在各組中觀察值與期望值之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，提示各組均具有人群代表性。見表1。

2.3ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與HCC的關(guān)系

ITGβ1基因rs2298141位點等位基因A和G在正常對照家系組中的分布頻率分別為63.75%和36.25%；在肝癌高發(fā)家系肝癌患者組中的分布頻率分別為70%和30%；在肝癌高發(fā)家系直系親屬組中的分布頻率分別為61.02%和38.98%。經(jīng)分析，與A等位基因型個體相比，ITGβ1基因rs2298141位點正常對照人群中攜帶G等位基因型的個體發(fā)生HCC的風險增加0.75倍（95%CI：0.33～1.7），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.50）。肝癌高發(fā)家系直系親屬組人群中攜帶G等位基因型的個體發(fā)生HCC的風險增加0.67倍（95%CI：0.31～1.45），差異亦無統(tǒng)計學意義（P=0.31）。見表2。

ITGβ1基因rs2298141位點AA基因型在正常家系組、肝癌高發(fā)家系直系親屬組和肝癌高發(fā)家系肝癌患者組中的分布頻率分別為40%、42.73%和50%；AG基因型分布頻率分別為47.50%、37.29%和40%；GG基因型分布頻率分別為12.50%、20.34%和10%。經(jīng)分析，與AA基因型個體相比，正常家系組和肝癌高發(fā)家系直系親屬組成員AG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加0.67倍（95%CI：0.22～2.1，P=0.50）和0.9倍（95%CI：0.31～2.71，P=0.86）；正常家系組和肝癌高發(fā)家系直系親屬成員GG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加1.05倍（95%CI：0.17～6.6，P=0.96）和2.2倍（95%CI：0.40～11.96，P=0.37），但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1　ITGβ1基因rs2298141位點基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（n）

表2　ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與HCC易感性的關(guān)系［n（%）］

3　討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤,流行病學表明，HBV/HCV感染、黃曲霉毒素B1暴露、飲用水污染是肝癌發(fā)生的高危因素。但研究發(fā)現(xiàn)在同樣的致癌因素作用下，只有少部分個體罹患肝癌，這現(xiàn)象說明基于個體差異的遺傳易感性的存在對于肝癌的發(fā)生具有重要作用。肝癌的家族聚集現(xiàn)象也表明了遺傳因素對肝癌發(fā)生的作用［2］。研究表明SNP在人群中發(fā)生頻率＞1%，與疾病易感性的改變密切相關(guān)［6，7］。ITGβ1作為一種重要的細胞黏附分子，被認為在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ITGβ1在甲狀腺乳頭狀瘤［8］、胃癌［9］、乳腺癌［10］、卵巢癌［11］、肺癌［12］、膀胱癌［13］中高表達，并與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。在肝癌中也有類似發(fā)現(xiàn)，整合素β1蛋白在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織和正常組織［14］，抑制整合素β1表達能抑制肝癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移［15，16］。

ITGβ基因多態(tài)性與各種疾病的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。Zhou等［17］研究ITGβ1基因rs2230395、rs1187075和rs1187076位點與結(jié)直腸癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs2230395和rs1187075與其總生存期有關(guān)，提示ITGβ1的SNP可作為預后判斷標志物。Ye等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ITGβ1基因rs17468位點T基因型出現(xiàn)的頻率更高（P＜0.05）；rs17468的CT和TT基因型與結(jié)直腸癌發(fā)生危險顯著增加有關(guān)（OR=1.67，95%CI：1.090～2.559，CTvs TT/CC）。研究發(fā)現(xiàn)，ITGβ2的啟動子區(qū)SNP（rs2070946）與乳頭狀甲狀腺癌發(fā)展顯著相關(guān)［8］；ITGβ1-1949/ITGβ1+31804多態(tài)性與胃癌關(guān)系密切［9］；ITGβ1 rs1557150位點多態(tài)性與1型糖尿病密切相關(guān)［19］。但回顧以往文獻，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于ITGβ1基因rs2298141與肝癌遺傳易感性的研究，尤其是在肝癌家族聚集性方面。

本研究探討了廣西扶綏縣壯族人群肝癌高發(fā)家系ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與HCC遺傳易感性的關(guān)系，研究結(jié)果顯示，ITGβ1基因rs2298141位點中，與A等位基因相比，正常對照家系和肝癌高發(fā)家系直系親屬組中攜帶G等位基因型的個體發(fā)生HCC的風險分別增加0.75倍和0.67倍，但差異無統(tǒng)計學意義。與AA基因型相比，正常對照家系組和肝癌高發(fā)家系直系親屬組GG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加1.05倍和2.2倍，AG基因型個體發(fā)生HCC的風險分別增加0.67倍和0.9倍，差異亦無統(tǒng)計學意義。提示ITGβ1基因rs2298141位點與HCC發(fā)生無顯著相關(guān)性。

綜上所述，本研究初步探討了廣西扶綏縣壯族人群中肝癌高發(fā)家系ITGβ1基因rs2298141位點多態(tài)性與HCC遺傳易感性的關(guān)系，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)ITGβ1基因rs2298141位點與HCC遺傳易感性的相關(guān)性。但因本研究收集病例數(shù)有限，且研究人群局限于廣西扶綏縣的壯族人群等，存在一定局限性，故有關(guān)結(jié)論仍需擴大樣本量及研究范圍進一步深入研究。

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［2016-06-27收稿］［2016-07-24修回］［編輯羅惠予］

ITGβ1 polymorphism and genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma in families from the Zhuang community in Fusui County,Guangxi

Wei Feifei1，Liao Yan1，Zhao Ruiqiang2，Wang Hongxue1，Xie Yu'an1（1Department of Experimental Research，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）
Corresponding author:Xie Yu′an.E-mail:gxxya@aliyun.com

Objective To investigate the correlation between polymorphism at rs2298141 in the integrin β1（ITGβ1）gene and susceptibility of families in Guangxi to hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods In this study，20 HCC family groups comprising 79 members served as cases，and 10 normal family groups comprising 40 members served as controls.Time-of-flight mass spectrometry was used to determine genotype frequencies at rs2298141，and possible correlations between genotype and HCC risk were explored using non-conditional logistic regression.Results AA，AG and GG genotypes were detected at rs2298141，and their frequencies followed Hardy-Weinberg equilibrium.Frequencies of alleles A and G at rs2298141 were similar among controls，core individuals in HCC families and HCC patients（allele A：63.75%，61.02%，70%；allele G：36.25%，38.98%，30%；P＞0.05）.Relative to risk of HCC in individuals with allele A，risk of HCC in controls with allele G was 0.75（95%CI 0.33-1.7，P=0.50）.Relative to risk of HCC in families with allele A，risk of HCC in HCC families with allele G was 0.67（95%CI 0.31-1.45，P=0.31）.AA，AG，and GG genotypes occurred at respective frequencies of 40%，42.73%，and 50% among controls；47.5%，37.29%，and 40%among core individuals in HCC families；and 12.5%，20.34%，and 10%among HCC patients（P＞0.05）.The corresponding frequencies of genotypes AA，AG and GG in the three groups was 40.00%，47.50%and 12.50%；50.00%，42.73%，37.29%and 20.34%；and 50%，40%and 10%.Allele distributions did not differ significantly between cases and controls.Relative to risk of HCC in individuals with the AA genotype,risk of HCC in control families with genotypes AG or GG was，respectively，0.67（95%CI 0.22-2.1，P=0.50）and 1.05（95%CI 0.17-6.6，P=0.96）,while the risk of HCC in HCC families with genotypes AG or GG was,respectively,0.9（95%CI 0.31-2.71，P=0.86）and 2.2（95%CI 0.40-11.96，P=0.37）. Conclusion The ITGβ1 rs2298141 polymorphism does not appear to correlate with susceptibility to HCC based on family clustering in Fusui County，Guangxi.

Liver neoplasms；ITGβ1 gene；Single nucleotide polymorphism；Family clustering；Genetic susceptibility

R735.7

A

1674-5671（2016）05-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.05.02

國家自然科學基金資助項目（81260320）

謝裕安。E-mail：gxxya@aliyun.com