徐龍?chǎng)?劉鏡+張麟+何光中

摘要：為研究牛血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）在調(diào)節(jié)脂肪和能量代謝中的作用，采用DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)關(guān)嶺黃牛92頭個(gè)體ANGPTL4基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，分析多態(tài)性位點(diǎn)與關(guān)嶺黃牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，在擴(kuò)增片段為752 bp的產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個(gè)突變位點(diǎn)，3個(gè)突變位點(diǎn)均處于哈代-溫伯格不平衡狀態(tài)（HWE）（P<0.05），3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的多肽信息含量（PIC）均為中度多態(tài)。相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果表明，418 C>T突變位點(diǎn)不同基因型關(guān)嶺黃牛的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍表現(xiàn)出差異極顯著（P<0.01），449A>T突變位點(diǎn)不同基因型關(guān)嶺黃牛的體高表現(xiàn)出差異顯著（P<0.05），胸圍、腹圍表現(xiàn)出差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：關(guān)嶺黃牛；ANGPTL4基因；多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S823.8+12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0051-02

血管生成素相關(guān)蛋白4（angiopoietin-related protein 4，ANGPTL4）是與血管生成、脂類(lèi)代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子[1-3]，并與TGFβ信號(hào)通道直接關(guān)聯(lián)，在腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[4]?，F(xiàn)有研究表明，類(lèi)血管生成素4除了在血管發(fā)生方面同血管生成素（ANGPTL）相似的作用外，它還可以抑制脂蛋白脂肪酶的活性同時(shí)正調(diào)控血漿甘油三脂水平[5-6]，促進(jìn)脂肪動(dòng)員，抑制脂肪貯存[7]。它是調(diào)控脂類(lèi)分化和葡萄糖代謝動(dòng)平衡的核受體，因此，ANGPTL4基因可能在脂類(lèi)代謝和葡萄糖代謝動(dòng)平衡的調(diào)控方面發(fā)揮作用[8-9]。

目前，在人和鼠上對(duì)ANGPTL4基因的研究報(bào)道較多，但是家畜該基因的研究報(bào)道較少。馬云克隆了牛的ANGPTL4基因的CDS序列和部分DNA序列，運(yùn)用測(cè)序和PCR-SSCP相結(jié)合的方法對(duì)該基因的部分基因組DNA片段進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)[10]，同時(shí)運(yùn)用一般線性模式研究ANGPTL4基因與8個(gè)品種牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明，牛ANGPTL4基因的遺傳變異與牛育肥后肌內(nèi)脂肪含量存在密切關(guān)系。研究ANGPTL4基因的結(jié)構(gòu)和功能，剖析其影響牛肌間脂肪含量的分子機(jī)制，有助于實(shí)現(xiàn)肌間脂肪含量性狀的遺傳改良。

本研究采用直接測(cè)序方法，以貴州關(guān)嶺黃牛為對(duì)象，研究ANGPTL4基因的多態(tài)性，同時(shí)與關(guān)嶺黃牛生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在尋找牛ANGPTL4基因與代謝調(diào)控的關(guān)系，尋找黃牛與生長(zhǎng)性狀有關(guān)的分子標(biāo)記，為貴州黃牛標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)資料，為提高貴州黃牛的生長(zhǎng)性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

92頭關(guān)嶺黃牛全血樣采自貴州省關(guān)嶺縣種群核心保種區(qū)。采取的黃牛全血樣肝素抗凝，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩Ｔ诓蓸拥耐瑫r(shí)，對(duì)各個(gè)體的生長(zhǎng)性狀、體長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2 基因組DNA的提取

采用蛋白酶K和TaKaRa Blood Genome DNA Ex-traction Kit（購(gòu)于北京天根生物公司）提取基因組DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)在GenBank 中登錄的牛ANGPTL4基因序列（GenBank登錄號(hào)為NC 007305.4），使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix10 μL，購(gòu)于北京天根生物公司；上下游引物各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR產(chǎn)物的測(cè)序

將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，送生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用DNAstart軟件包中的SeqMan對(duì)測(cè)序所得的序列進(jìn)行校對(duì)，用Clustalx程序進(jìn)行同源性比對(duì)?；蛐皖l率、等位基因頻率、雜合度等群體遺傳參數(shù)采用Popgene生物技術(shù)軟件處理。運(yùn)用SPSS 13.0分析生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)及關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANGPTL4基因SNP檢測(cè)

由圖1可見(jiàn)，關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為752 bp，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個(gè)突變位點(diǎn)均存在2種基因型。

2.2 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)性分析

由表2可見(jiàn)，3個(gè)變異位點(diǎn)均是雜合子基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。387 C>T變異位點(diǎn)C等位基因頻率小于T等位基因，418 C>T變異位點(diǎn)C等位基因頻率大于T等位基因，449A>T變異位點(diǎn)A等位基因頻率大于T等位基因。HWE檢測(cè)結(jié)果表明，3個(gè)變異位點(diǎn)均處于HWE不平衡狀態(tài)（P<0.05）。3個(gè)變異位點(diǎn)的雜合度 （He） 介于0.441 9～0.492 7之間，有效等位基因（Ne）介于1.784 1～1.960 8之間，多態(tài)信息含量（PIC）均呈現(xiàn)中度多態(tài)。

2.3 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析

如表3所示，將關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)位點(diǎn)與關(guān)嶺黃牛體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、管?chē)⑹植扛?、坐骨端?7個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，418 C>T變異位點(diǎn)CT基因型個(gè)體體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點(diǎn)AA基因型個(gè)體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。

3 結(jié)論與討論

候選基因法是一種尋找畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳標(biāo)記的常用方法，它可以直接研究該基因多態(tài)性與個(gè)體經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系。本研究通過(guò)測(cè)序方法對(duì)關(guān)嶺黃牛的ANGPTL4基因進(jìn)行多態(tài)性分析，并與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)變異位點(diǎn)均具有2種基因型。從進(jìn)化角度看，群體中的遺傳多樣性是歷史的產(chǎn)物[11]，多態(tài)性信息含量和雜合度都是群體內(nèi)遺傳變異的重要度量指標(biāo)，雜合度值越大，群體內(nèi)的遺傳變異就越大。多態(tài)信息含量值衡量基因變異程度高低，Botstein等提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5 時(shí)，該變異位點(diǎn)為高度多態(tài)；當(dāng)0.25

ANGPTL4蛋白是一種具有廣泛生理功能的物質(zhì)，尤其對(duì)脂代謝的調(diào)控具有重要作用，脂代謝影響肉質(zhì)的嫩度、風(fēng)味和多汁性，脂肪性狀是衡量肉質(zhì)的重要指標(biāo)之一。因此，研究ANGPTL4基因的突變對(duì)對(duì)牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，418 C>T變異位點(diǎn)CT基因型個(gè)體體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點(diǎn)AA基因型個(gè)體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。因此，ANGPTL4基因完全可以作為牛生長(zhǎng)性狀的潛在遺傳標(biāo)記，為貴州黃牛肉用性能分子育種提供理論依據(jù)。

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