唐亞萍，王柏柯，楊生保，李 寧，楊 濤，帕提古麗，王 強，余慶輝

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

?

加工番茄下胚軸再生體系的建立

唐亞萍，王柏柯，楊生保，李 寧，楊 濤，帕提古麗，王 強，余慶輝

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】建立加工番茄模式品種M82的再生體系，為加工番茄M82的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā垦芯坎煌瑴缇鷦庸し驯砥缇Ч斑\用正交組合設(shè)計不同濃度的激素配比，研究不同濃度的激素對加工番茄愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)的影響?！窘Y(jié)果】加工番茄種皮滅菌，以15%次氯酸鈉(NaClO)+吐溫-20 30 min對加工番茄M82種皮的滅菌效果最佳；愈傷組織誘導(dǎo)，以MS B5+3 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA誘導(dǎo)出的愈傷組織平均直徑最大；不定芽誘導(dǎo)，以MS B5+0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA中誘導(dǎo)的愈傷組織平均出芽數(shù)最多?！窘Y(jié)論】獲得了加工番茄M82的再生體系，并得出細胞分裂素ZT對于加工番茄不定芽的誘導(dǎo)具有較好的效果。

加工番茄；下胚軸；再生體系

0 引 言

【研究意義】番茄(SolanumLycopersicon)是全球廣泛栽培的重要蔬菜作物，并已完成基因組測序[1]，加工番茄作為番茄的一個栽培種是新疆主要的經(jīng)濟作物之一。加工番茄主要的特點是自封頂，植株矮化，多分枝，花期集中，果實多為橢圓，與鮮食番茄相比果皮較厚，更耐儲運[2]。栽培番茄M82具有加工番茄的多項特點，并作為加工番茄的模式品種被廣泛應(yīng)用于研究中。加工番茄的組織培養(yǎng)是進行加工番茄雜種優(yōu)勢固定、優(yōu)良品種快繁、突變體保存利用及轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】通常組織培養(yǎng)的外植體包括：原生質(zhì)體、子葉、下胚軸和真葉，其中研究最多的是子葉[3]。不同品種和不同外植體的再生頻率各不相同。在番茄的組織再生培養(yǎng)中用的最多的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)分別是玉米素(ZT)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和3-吲哚乙酸(IAA)。El-Bakry[4]利用不同濃度的6-BA和IAA研究了10個不同品種的番茄，其中5個品種的誘導(dǎo)率高達100%。馬杰等[5]認為2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA對浙雜‘905’、‘圣亞’和‘富丹’再生效果最佳。李景富等[6]在研究中指出2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA是宇番一號和0949-46下胚軸最佳的出芽培養(yǎng)基，并且這兩個品種子葉的芽分化率均高于下胚軸。李倩等[7]研究結(jié)果表明，對于番茄品種‘09-22’來說1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA是最佳的芽分化培養(yǎng)基，并且子葉的分化率略高于下胚軸。劉煒煒等[8]以加工番茄‘亞心98-1’和里格爾子葉為外植體認為ZT和IAA的組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好?！颈狙芯壳腥朦c】由于番茄的離體再生具有明顯的基因型依賴性[9]，加之加工番茄M82的再生體系研究是進行加工番茄功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，而目前關(guān)于加工番茄下胚軸組織培養(yǎng)再生體系的研究鮮有報道。因此，以具有較高分生組織特性的下胚軸為外植體，研究加工番茄的高效再生體系對加工番茄基因功能鑒定具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以加工番茄M82為研究材料，以下胚軸為外植體進行不同濃度激素的配比篩選出最優(yōu)的加工番茄M82的再生體系，為加工番茄基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 品種

供試的加工番茄品種為M82(引自Tomato Genetics Resource Center)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子發(fā)芽的培養(yǎng)基：1/2 MS(文中MS培養(yǎng)基為30 g/L蔗糖，70 g/L瓊脂，pH=5.8)。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在MS+B5的基本培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA (2.0、3.0和4.0 mg/L)及NAA(0.25和0.5 mg/L)的組合。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在MS+B5的基本培養(yǎng)基中，添加不同濃度的ZT (0.5和1.0 mg/L)及IAA(0.1和0.2 mg/L)的組合。

根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L IBA[2,10]。

1.2 方 法

1.2.1 無菌苗

挑選籽粒飽滿的種子50粒，分別用不同的方法進行種皮表面滅菌，加工番茄種皮表面滅菌的方法分別采用：15%次氯酸鈉(NaClO)+吐溫-20 30 min、70%乙醇1 min+15% NaClO 20 min、和0.1%升汞(HgCl2)3 min +15% NaClO 20 min。在操凈工作臺內(nèi)用無菌水沖洗3～5次，將加工番茄種子接入1/2 MS培養(yǎng)基內(nèi)，放置于(25±1 ℃)光照培養(yǎng)箱內(nèi)，待種子發(fā)芽7 d后使用。

1.2.2 外植體

將發(fā)芽后的無菌苗取下胚軸0.5 cm接種于含有不同濃度6-BA和NAA的MS+B5培養(yǎng)基內(nèi)進行愈傷組織出愈情況觀察，并移植到含有不同濃度的ZT和IAA中進行不定芽誘導(dǎo)的觀察。

在張錄霞等[2]的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計不同激素濃度配比，利用正交分析法將不同濃度的激素進行配比，列出加工番茄下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定根采用MS+0.5 mg/L IBA進行誘導(dǎo)。表1，表2

1.2.3 測定項目

待下胚軸接種于不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)25 d后，觀察愈傷組織的生長情況，并統(tǒng)計愈傷組織平均直徑、誘導(dǎo)率和出芽率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行變量分析(Avova)，0.05水平為顯著性差異(Duncan)。

表1 M82愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA和NAA組合
Table 1 The medium of callus differentiation with different concentrations of 6-BA and NAA in M82

編號NoB1B2B3B4B5B66-BA(mg/L)202030304040NAA(mg/L)025050250502505

表2 M82不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度ZT和IAA組合
Table 2 The medium of buds differentiation with different concentrations of ZT and IAA in M82

編號NoZ1Z2Z3Z4ZT(mg/L)05051010IAA(mg/L)01020102

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑對種子消毒效果的影響

研究表明，不同滅菌劑對加工番茄M82種子的滅菌效果和萌發(fā)均有影響。15%次氯酸鈉、吐溫-20和70%乙醇對種子的萌發(fā)影響不大，均有90%以上的萌發(fā)率。但在滅菌效果上，先用70%乙醇進行種皮表面滅菌效果較好。用升汞進行種皮表面滅菌的效果最好，沒有污染的種子，但是升汞卻極大的影響了種子的萌發(fā)，用升汞處理后的種子萌發(fā)率僅為8%。因此，采用70%乙醇1 min+15%次氯酸鈉 20 min進行加工番茄種皮表面滅菌處理。在該種皮滅菌條件下，經(jīng)過12 d后無菌苗子葉全出，成長勢良好。表3，圖1

表3 不同滅菌劑加工番茄M82種子污染率和發(fā)芽率
Table 3 Effects of different sterilizing agents on the rate of contamination and germination of M82 seeds

滅菌劑種類Typesofsterilizingagent污染率Pollutionrate(%)發(fā)芽率Germinationrate(%)15%NaClO+吐溫(Tween)-2030min49501%HgCl23min+15%NaClO20min0870%乙醇(Ethanol)1min+15%NaClO20min192

圖1 不同滅菌劑種類M82發(fā)芽變化
Fig.1 Effects of different sterilizing agents on the germination of M82 seeds

2.2 不同濃度的6-BA和NAA對加工番茄愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

根據(jù)張錄霞等[2]的研究結(jié)果，同時由于ZT較6-BA的成本較高，因此在加工番茄愈傷組織誘導(dǎo)階段采用細胞分裂素6-BA進行愈傷組織的誘導(dǎo)(圖2A)。不同濃度的6-BA和NAA的組合對加工番茄愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不明顯，各激素配比的培養(yǎng)基內(nèi)愈傷組織的誘導(dǎo)率均在98%以上。從加工番茄愈傷組織的平均直徑可以看出，愈傷組織平均直徑最大的培養(yǎng)基中激素濃度是3 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA。隨著6-BA的濃度增加，愈傷組織的平均直徑也增加。但是當(dāng)6-BA濃度升高到4 mg/L時，影響愈傷組織的生長，愈傷組織的平均直徑明顯減小。NAA的濃度對加工番茄愈傷組織的誘導(dǎo)和平均直徑的大小沒有明顯的影響。然而6-BA對加工番茄不定芽的誘導(dǎo)率卻很低，最高的不定芽誘導(dǎo)率僅有31.58%，同時可以看出較高濃度的NAA會影響不定芽的誘導(dǎo)。表4，圖2

表4 不同濃度的6-BA和NAA下加工番茄愈傷組織誘導(dǎo)變化
Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on callus induction of processing tomato

編號NoB1B2B3B4B5B6愈傷組織誘導(dǎo)率Inductionrateofcallus(%)989698269873992198669888愈傷組織的平均直徑Averagediameterofcallus(cm)07171b07583bc08211c07611bc06141a06659ab愈傷組織的出芽率Germinationrateofcallus(%)28571052315812903043889

注:A：愈傷組織誘導(dǎo)；B：不定芽的再生；C：根誘導(dǎo)

Note:A: callus induction; B: regeneration of buds; C: roots induction

圖2 加工番茄的再生體系
Fig. 2 The regeneration system of processing tomato

2.3 不同濃度ZT和IAA對加工番茄出芽率的影響

由于6-BA對加工番茄的不定芽的誘導(dǎo)率極低，所以采用ZT進行加工番茄不定芽的誘導(dǎo)(圖2B)。研究表明，平均每塊愈傷組織的平均出芽數(shù)與愈傷組織的平均直徑?jīng)]有明顯的關(guān)系。在含有細胞分裂素ZT的培養(yǎng)基中，M82的不定芽誘導(dǎo)率與6-BA相比高3～4倍，均在97%以上。在0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基中愈傷組織的出芽數(shù)最多平均為6個，其次是0.5 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA，說明在較低濃度(0.5 mg/L)的ZT培養(yǎng)基內(nèi)愈傷組織的平均出芽數(shù)較高。但愈傷組織的平均直徑在1.0 mg/L ZT培養(yǎng)基內(nèi)的較大，可見愈傷組織的平均直徑與愈傷組織的平均出芽數(shù)不相關(guān)。表5，圖2

表5 不同濃度ZT和IAA下加工番茄不定芽的誘導(dǎo)變化
Table 5 Effects of different concentrations of ZT and IAA on buds induction of processing tomato

編號NoZ1Z2Z3Z4每塊愈傷組織的平均出芽數(shù)Theaveragenumberofeachcallussprouting(a)552b611b419a466a愈傷組織的平均直徑Averagediameterofcallus(cm)06469a08633ab10667b093a不定芽誘導(dǎo)率Germinationrate(%)979989976982

2.4 加工番茄生根的誘導(dǎo)

總結(jié)張錄霞等[2]、劉煒煒等[8]對于不同品種加工番茄生根的誘導(dǎo)，采用MS+0.5 mg/L IBA對M82進行生根誘導(dǎo)(圖2C)。在生根培養(yǎng)基中，加工番茄根誘導(dǎo)情況良好，須根數(shù)量多，根系較發(fā)達。圖2

3 討 論

種皮消毒滅菌是建立無菌苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，無菌苗體系的建立是番茄再生體系建立的重要基礎(chǔ)。種皮滅菌研究結(jié)果同張錄霞等[2]的研究結(jié)果相似，升汞嚴(yán)重影響加工番茄種子的發(fā)芽率，加工番茄種皮滅菌主要采用次氯酸鈉，只是在不同的文獻中[11]采用的次氯酸鈉的濃度和消毒時間與研究存在差異。

番茄作為模式植物之一，其組織培養(yǎng)和再生體系的研究已趨于成熟，但是加工番茄再生體系的研究還較為薄弱。加工番茄組織培養(yǎng)具有很強的基因特異性，因此選擇合適的培養(yǎng)基和激素配比是進行組培的重要環(huán)節(jié)[12,13]。在加工番茄再生體系建立的實驗中，多以子葉為外植體進行再生體系的研究，而研究以下胚軸為外植體通過不同激素配比研究分別獲得了最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和不定芽再生培養(yǎng)基。寇曉虹等[14]以加工番茄子葉為研究對象，表明芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS+2 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA不定芽誘導(dǎo)效果最好；研究結(jié)果同劉煒煒等[8]建立的加工番茄“亞心98-1”和里格兒子葉再生體系中不定芽的誘導(dǎo)研究結(jié)果相似，均采用ZT和IAA的激素配比作為不定芽的誘導(dǎo)，并且最佳的不定芽誘導(dǎo)的激素濃度也相同。陳麗萍等[12]以加工番茄‘B04’下胚軸為外植體的研究中，認為2.0 mg/L ZT對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，而在研究中0.5 mg/L ZT對加工番茄M82不定芽的誘導(dǎo)效果最好，并不是越高濃度的細胞分裂素對不定芽的誘導(dǎo)效果越好。然而產(chǎn)生這些差異的原因可能在于不同基因型在不同濃度的激素配比中的差異。

4 結(jié) 論

以加工番茄M82為研究對象，以下胚軸為外植體進行了加工番茄M82再生體系的研究，通過對不同濃度的激素配比研究得出了加工番茄M82的最佳愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在愈傷組織誘導(dǎo)階段采用6-BA和NAA的組合，能夠以較高的愈傷組織誘導(dǎo)率誘導(dǎo)出顏色嫩綠，緊密結(jié)構(gòu)的愈傷組織。但由于6-BA和NAA的激素組合對M82不定芽的誘導(dǎo)率極低。因此，在不定芽誘導(dǎo)中采用ZT和IAA，且以較低濃度的ZT篩選出最多的平均愈傷組織誘導(dǎo)芽數(shù)。

References)

[1]楊濤, 楊生保, 李寧, 等. 番茄ILs果實耐壓力測定及與其他果實性狀相關(guān)性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 52(8): 1 373-1 381.

YANG Tao, YANG Sheng-bao, LI Ning, et al. (2015). Fruit's compression resistance testing of ILs in tomato and correlation analysis with other fruit trait [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(8):1，373-1，381.(in Chinese)

[2]張錄霞, 郝青南, 馬超, 等. 加工番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 17(3) :236-241.

ZHANG Lu-xia, HAO Qing-nan, MA Chao, et al. (2008). Processing tomato plant regeneration in genetic transformation [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica, 17(3): 236-241. (in Chinese)

[3]曹慧穎, 張立軍, 夏潤璽, 等. 番茄組織培養(yǎng)研究進展[J]. 中國蔬菜, 2012, (16) : 10-14.

CAO Hui-ying, ZHANG Li-jun, XIA Run-xi, et al. (2012). Research progress on tomato tissue culture [J].ChinaVegetables, (16) : 10-14. (in Chinese)

[4] El-Bakry, A. A. (2002). Effect of genotype, growth regulators, carbon source, and pH on shoot induction and plant regeneration in tomoto.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant, 38(5)：501-507.

[5] 馬杰, 邱棟梁. 番茄組培再生體系優(yōu)化研究 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2011,27(8):185-189.

MA Jie, QIU Dong-liang. (2011). Study on tissue culture and regenerative system of tomato [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 27(8):185-189. (in Chinese)

[6] 王傲雪, 趙越, 陳秀玲, 等. 不同激素組合對番茄芽分化率的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 44(7): 85-90.

WANG Ao-xue, ZHAO Yue, CHEN Xiu-ling, et al. (2013). Effect of different plant hormone combinations on bud differentiation of tomato [J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity, 44(7): 85-90. (in Chinese)

[7] 李倩, 王濱, 李培環(huán), 等. 番茄子葉和下胚軸離體再生體系的建立[J].北方園藝, 2015, (1): 106-110.

LI Qian, WANG Bin, LI Pei-huan, et al. (2015). Establishment of regeneration system of cotyledon and hypocotyl in vitro of tomato [J].NorthernHorticulture, (1): 106-110.(in Chinese)

[8] 劉煒煒, 秦榮, 張偉, 等. 加工番茄離體再生體系的建立[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2012, 28(16): 155-160.

LIU Wei-wei, QIN Rong, ZHANG Wei, et al. (2012). Establishment of in vitro regeneration system for processing tomato [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 28(16): 155-160. (in Chinese)

[9] Ellul, P., Garcia-Sogo, B., Pineda, B., Rios, G., Roig, L., & Moreno, V. (2003). The ploidy level of transgenic plants in Agrobacterium-mediated transformation of tomato cotyledons (LycopersiconesculentumL. Mill.) is genotype and procedure dependent.TheoreticalandAppliedGenetics, 106(2)：231-238.

[10] Sivankalyani, V., Takumi, S., Thangasamy, S., Ashakiran, K., & Girija, S. (2014). Punctured-hypocotyl method for high-efficient transformation and adventitious shoot regeneration of tomato.ScientiaHorticulturae, 165(3)：357-364.

[11] 吳志剛, 宋明, 王志敏, 等. 番茄組織培養(yǎng)中無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2006, 22(4): 335-337.

WU Zhi-gang, SONG Ming, WANG Zhi-min, et al. (2006). Condition optimization for culturing sterile tomato plants in tissue culture [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 22(4): 335-337. (in Chinese)

[12] 陳麗萍, 張麗華, 程智慧. 加工番茄離體再生體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2007, 16(1): 162-167.

CHEN Li-ping, ZHANG Li-hua, CHEN Zhi-hui. (2007). Establishment of in vitro regeneration system for processing tomato [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica, 16(1): 162-167. (in Chinese)

[13] 王理. 番茄高效離體再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化初探[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2012.

WANG Li. (2012)Establishmentofhighefficientplantregenerationsystemandresearchongenetictransformationoftomato[D]. Master Dissertation. Sichuan Agricultural University, Chengdou. (in Chinese)

[14] 寇曉虹, 羅云波, 田慧琴, 等.多聚半乳糖醛酸酶(PG)反義基因轉(zhuǎn)化加工番茄[J].食品科學(xué), 2007, 28(3):187-191.

KOU Xiao-hong, LUO Yun-bo, TIAN Hui-qin, et al. (2007). Genetic transformation processing of tomato with anti-PG gene [J].FoodScience, 28(3):187-191. (in Chinese)

Fund project:Research projects of the Ministry of Agriculture in public welfare sector (201303115), "twelfth five-year plan" special major projects of Xinjiang (201230116-3) and youth science and technology innovation talents cultivation project of Xinjiang (2014721023)

Establishment of Hypocotyls Regeneration System for Processing Tomatoes

TANG Ya-ping, WANG Bai-ke, YANG Sheng-bao, LI Ning, YANG Tao， Patiguli,WANG Qiang, YU Qing-hui

(Research Institute of Horticultural Crops, Xinjiang Academy of Agriculture Science, Urumqi 830091, China)

【Objective】 In order to establish the regeneration and genetic transformati- on system of processing tomato, the hypocotyls of processing tomato model cultivar M82 which was introduced from Tomato Genetics Resource Center were used as explants.【Method】The sterilization effects of using different sterilizing agent and orthogonal design with different concentrations of hormones which for inducting of callus and adventitious buds were studied on processing tomato.【Result】 The sterilization with 15% sodium hypochlorite (NaClO) sterilization and Twain-20 for 30 min has the best result of surface sterilize on processing tomato. The medium with 3 mg/L 6-BA and 0.25 mg/L NAA has the biggest average diameters of process- sing tomato callus induction. The optimum medium for buds differentiation was MSB5+ 0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA.【Conclusion】The regeneration system of processsing tomato cultivar M82 was established through the above research and this study has drew a conclusion that the ZT of cytokinin has the best effect for inducting the buds in processing tomato.

processing tomato; hypocotyl; regeneration system

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.05.001

2015-12-29

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(201303115)；自治區(qū)"十二五"重大專項 (201230116-3)；自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(2014721023)

唐亞萍(1986-), 女, 四川人, 助理研究員, 研究方向為加工番茄育種, (E-mail)tangyaping624@sina.com

余慶輝(1970-), 男, 廣東人, 研究員, 研究方向為加工番茄新品種選育和栽培, (E-mail)tomato-yu@xaas.ac.cn

S641.2

A

1001-4330(2016)05-0785-06