彭千元，易健，湯艷，吳琨鵬，黃昕，劉柏炎*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南益陽413000）

六味地黃湯對發(fā)育遲緩胎鼠腦NGF、EGF表達的影響

彭千元1，易健1，湯艷1，吳琨鵬1，黃昕2，劉柏炎1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南益陽413000）

目的觀察補腎益髓經(jīng)典方六味地黃湯對發(fā)育遲緩胎鼠腦神經(jīng)生長因子（NGF）、表皮細胞生長因子（EGF）表達影響，并為宮細胞內(nèi)腦發(fā)育遲緩的治療提供支持。方法10只孕鼠依照受孕先后順序隨機分成5組，正常組、模型組、六味地黃湯高劑量組、六味地黃湯中劑量組、六味地黃湯低劑量組，采用孕鼠被動吸煙復(fù)制胎鼠發(fā)育遲緩模型，正常組、模型組均灌胃蒸餾水，六味地黃湯高、中、低劑量組分別灌胃2.164、1.082、0.541 g/mL的六味地黃湯濃縮液。于孕19 d將5組孕鼠處死，稱算每組活胎腦體質(zhì)量比；采用免疫組化法檢測胎鼠腦內(nèi)NGF、EGF的表達。結(jié)果被動吸煙可使胎鼠腦體質(zhì)量比降低，六味地黃湯高劑量能增加腦體質(zhì)量比；模型組NGF、EGF表達低于正常組（P＜0.01），治療組NGF、EGF表達均高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論孕期被動吸煙可以導(dǎo)致胎鼠腦發(fā)育遲緩，六味地黃湯能通過調(diào)控腦內(nèi)NGF、EGF改善胎鼠腦的發(fā)育。

胎鼠；腦；發(fā)育遲緩；六味地黃湯；神經(jīng)生長因子；表皮細胞生長因子

中醫(yī)認為腎主蜇守位，父母的生殖之精是子代先天之精的唯一來源，是稟賦子代的生命遺傳物質(zhì)，與生俱來，閉藏于腎中。先天發(fā)育不足是指母體因腎精虛損，而致子代稟賦不足，出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩、智力障礙等[1]，其中關(guān)于腦的論述較多，如《靈樞·經(jīng)脈別論》中說：“人始生，先成精，精成而腦髓生。”提示腦髓由先天之精所化生。腦發(fā)育過程中存在大量神經(jīng)元的增殖、分化、存活及凋亡，許多因子參與了此過程，其中神經(jīng)生長因子（NGF）、表皮細胞生長因子（EGF）在營養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)損傷神經(jīng)修復(fù)功能、神經(jīng)再生中有重要作用[2-3]。本文利用補腎經(jīng)典方六味地黃湯為干預(yù)因素，從腦體質(zhì)量比、神經(jīng)生長因子等方

面探討其對發(fā)育遲緩胎鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物C57/BL/6小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購買自湖南斯萊克景達實驗動物公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2011-0003，自行繁殖。

1.1.2 實驗藥物方藥由熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g組成。以上藥材均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林大藥房，經(jīng)鑒定，符合藥典標準。按照處方量5倍（共375 g）稱取，加10倍量冷水浸泡40 min后用武火煎煮，煮沸后改用文火煎煮30 min，濾出藥液備用，第2煎加8倍量冷水武火煎煮，煮沸后改用文火煎煮20 min，濾出藥液，將兩次藥液混合，置水溶鍋中蒸發(fā)，按4∶2∶1濃縮至高、中、低三個劑量，分裝冷藏備用。

1.1.3 試劑紅山茶卷煙（烤煙型，每支煙含焦油量11 mg，CO12 mg，煙堿量1.1 mg），紅云紅河煙草有限責任公司；NGF及EGF單克隆抗體、SP-9000，武漢博士德生物有限公司。

1.1.4 儀器自制煙箱；BX-51光學(xué)顯微鏡及IPP圖像分析儀系統(tǒng)（日本Olympus公司）；TP-1000電子天平（中國湘儀天平儀器廠）；RM2235切片機（德國Leica公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥孕鼠按懷孕先后順序隨機分為5組，每組2只：正常組、模型組、六味地黃湯低劑量組、六味地黃湯中劑量組、六味地黃湯高劑量組。藥物治療組均灌胃六味地黃湯，正常組與模型組灌胃蒸餾水。根據(jù)60 kg體質(zhì)量人體表面積臨床等效劑量為小鼠中劑量給藥量，以20 g小鼠為例計算給藥量約為0.22 g，1 kg小鼠給藥量為10.82 g。所有動物按10 mL/kg灌胃，則中劑量組給藥濃度為1.082 g/mL，高劑量濃縮2倍為2.164 g/mL，低劑量組稀釋2倍為0.541 g/mL。受孕第8天開始灌胃直至受孕第19天處死，每天1次，總共灌胃12 d。

1.2.2 動物造模于下午6：30按雄雌1∶2交配合籠，次日8：00取出雌鼠，查見有陰道栓時為受孕日（即0天），記為E0天[4]。按文獻造模方法采用被動吸煙法[5]，從E4天起將孕鼠置于長×寬×高為35 cm× 20 cm×20 cm，上下各有直徑5 cm圓形通風口的自制煙箱中（正常組除外），E4-E10每天9 am、12 am、2 pm、5 pm各1次，每只小鼠每次燃盡香煙1支，E11-E19每只小鼠每次燃盡香煙2支，每天自由進食飲水活動。

1.2.3 取材和標本處理每組孕鼠E19天于末次熏煙、灌胃后，頸椎脫臼處死，剪開腹腔，在子宮暴露子下，剝離胚膜，用0.01 MPBS沖洗干凈，稱取活胎體質(zhì)量與腦質(zhì)量。再將胚胎鼠腦固定于4%多聚甲醛中，依次用50%、70%、80%、95%、100%乙醇梯度脫水，每級4 h；二甲苯透明3 h；石蠟包埋。

1.2.4 發(fā)育情況于E19處死孕鼠，按文獻[6]進行稱質(zhì)量，比較各組腦體質(zhì)量比。

1.2.5 免疫組化檢測腦內(nèi)NGF、EGF每組選取10只胎鼠腦組織，石蠟切片，烤片（65℃）2 h后，常規(guī)脫蠟至水；高溫檸檬酸鹽液煮沸修復(fù)2 min，切片放入3%過氧化氫溶液中浸泡10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；0.01 M PBS泡洗3 min×3次；滴加正常山羊血清封閉15 min，并用PBS作空白對照；分別加入兩種抗體（NGF和EGF，濃度均為1∶100），各100 μL 37℃（2h）；0.01 M PBS泡洗3 min×3次；加入通用型生物素化二抗100 μL，37℃（15 min），0.01 M PBS泡洗3 min×3次；加入過氧化物酶標記鏈霉卵白素100 μL，37℃（20 min），0.01 M PBS泡洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.2.6 觀測方法應(yīng)用Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡，200倍鏡下隨機選取10個不重復(fù)的視野，由圖像分析系統(tǒng)計數(shù)平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃湯對胎鼠腦體質(zhì)量比的影響

孕鼠被動吸煙后，各組胚胎數(shù)有一定差別，因此，對各組活胎腦體質(zhì)量比進行比較。與正常組比較，六味地黃湯各組、模型組腦體質(zhì)量比明顯降低（P＜0.01），與模型組比較，六味地黃湯高劑量組腦體質(zhì)量比增高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與六味地黃湯高劑量組比較，六味地黃湯低劑量組腦體比明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 六味地黃湯對胎鼠腦體質(zhì)量比的影響±s）

表1 六味地黃湯對胎鼠腦體質(zhì)量比的影響±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與六味地黃湯高劑量組比較，▲▲P＜0.01。

組別正常組模型組六味地黃湯高劑量組六味地黃湯中劑量組六味地黃湯低劑量組n 16 14 13 17 14腦質(zhì)量（g）0.238±0.019 0.292±0.025 0.318±0.019 0.295±0.013 0.299±0.025體質(zhì)量（g）0.858±0.084 1.147±0.060 1.261±0.063 1.149±0.067 1.131±0.058 F P腦/體質(zhì)量0.278±0.011 0.255±0.010** 0.252±0.009**#0.257±0.012** 0.264±0.011**▲▲14.367 0.000

2.2 六味地黃湯對NGF、EGF表達的影響

與正常組比較，六味地黃湯各組、模型組NGF、EGF表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，六味地黃湯各組NGF、EGF表達明顯增強，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與六味地黃湯高劑量組比較，六味地黃湯低、中劑量組NGF明顯降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），差異EGF無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 胎鼠腦組織NGF、EGF平均光密度表達（±s，n=10）

表2 胎鼠腦組織NGF、EGF平均光密度表達（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05，與模型組比較，##P＜0.01；與六味地黃湯高劑量組比較，▲▲P＜0.01。

組別正常組模型組六味地黃湯高劑量組六味地黃湯中劑量組六味地黃湯低劑量組F P NGF 179.76±3.98 144.24±3.45** 168.05±1.62**##161.18±2.43**##▲▲156.76±4.46**##▲▲154.862 0.000 EGF 191.56±2.15 167.51±9.73** 185.86±3.89*##183.93±2.50**##183.55±1.74**##32.508 0.000

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)窘迫窒息，圍產(chǎn)兒死亡，遠期體格發(fā)育不良及智力發(fā)育遲緩都與各種原因造成的胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩密切相關(guān)。母體、胎兒及胎盤由于各種原因受損而導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育受限，圍產(chǎn)期死亡率增高，常常會伴有新生兒缺血缺氧性腦病，乃至遺留永久精神、神經(jīng)系統(tǒng)嚴重疾病，因此，積極干預(yù)治療成為研究熱點。

中醫(yī)學(xué)認為先天發(fā)育遲緩主要表現(xiàn)為生長發(fā)育不良，出現(xiàn)智力水平低下、五遲五軟等。其病機與母體虧損，腎氣衰，導(dǎo)致子代稟受父母的生殖之精不足密切相關(guān)。管威等[7]認為腎與腦在臟腑結(jié)構(gòu)功能上是密切關(guān)聯(lián)的，腦髓皆源于腎精，由此腦髓的盈虧及大腦功能的正常發(fā)揮與腎精的充盈虧損密切相關(guān)。被動吸煙致宮內(nèi)發(fā)育遲緩是目前較公認的發(fā)育遲緩模型，因為香煙煙霧中存在大量有毒物質(zhì)，如腫瘤促進因子、誘變劑、前致癌劑等。母體吸收后大量有毒物質(zhì)經(jīng)過胎盤屏障而進入胎兒全身血液循環(huán)系統(tǒng)，誘發(fā)多種病理機制，最終影響胎兒血流量及血氧含量[8]。根據(jù)中醫(yī)理論并結(jié)合我們課題組前期實驗研究結(jié)果，先天稟賦不足模型可利用孕鼠被動吸煙致宮內(nèi)胎鼠發(fā)育遲緩來復(fù)制。

近年來發(fā)現(xiàn)，NGF和EGF能營養(yǎng)神經(jīng)，促進神經(jīng)細胞增殖分化，修復(fù)受損神經(jīng)元，減少神經(jīng)細胞凋亡，是神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點。NGF是具有118個氨基的蛋白質(zhì)分子，具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用。對于胚胎腦組織而言，NGF可以抗損傷性刺激，抑制組織損傷所致的神經(jīng)細胞凋亡，誘導(dǎo)神經(jīng)元、突觸再生及修復(fù)受損神經(jīng)。因此，NGF在腦內(nèi)分泌水平與腦的發(fā)育密切相關(guān)[9]。EGF是具有53個氨基酸殘基的單鏈多肽類物質(zhì)，相對分子量6045道爾頓，具有促進神經(jīng)生長的作用。宮內(nèi)發(fā)育遲緩時刺激其受體，通過催化底物蛋白產(chǎn)生絡(luò)氨酸磷酸化而達到細胞的修復(fù)補充及分裂增殖。此外，EGF在胎盤中表達明顯，能促進胎盤細胞增殖分化，提高胎盤通透性，增加營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，為胎兒提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)以維持腦正常發(fā)育[10]，因此EGF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的營養(yǎng)和保護作用。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，孕鼠被動吸煙導(dǎo)致胎鼠腦體質(zhì)量比減輕，NGF、EGF表達下調(diào)，而六味地黃湯能上調(diào)NGF、EGF表達、恢復(fù)腦體質(zhì)量比，高劑量組最明顯，由此提示六味地黃湯通過補腎、填精、益髓作用，間接調(diào)控腦內(nèi)NGF、EGF表達，營養(yǎng)神經(jīng)，使受損神經(jīng)細胞得到修復(fù)，從而使腦部發(fā)育得到改善。

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（本文編輯匡靜之）

Influence of Liuwei Dihuang Decoction on Exppression of NGF and EGF in Brain Tissue of Intrauterine Growth Retardation Rats

PENG Qianyuan1,YI Jian1,TANG Yan1,WU Kunpeng1,HUANG Xin2,LIU Baiyan1*
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China；2.Yiyang College of Medicine,Yiyang,Hunan 413000,China)

Obejective To observe Liuwei Dihuang Decoction on the expression of nerve growth factor（NGF）and epidermal growth factor（EGF）in brain tissue of intrauterine growth retardation rats and provide support for the treatment.Methods 10 pregnancy animals according to the order of ngravidation were randomly divided into 5 groups：nomal group，modelgroup，highdose of Liuwei Dihuang Decoction（HLWDHD）group，medium dose of Liuwei Dihuang Decoction（MLWDHD）group，low dose of Liuwei Dihuang Decoction（LLWDHD）group.The IUGR model was established by passive smoking.Nomal group and model group were fed by water.The HLWDHD，MLWDHD and LLWDHD groups were given 2.164，1.082，0.541 g/mL concentrated solution of Liuwei Dihuang Decoction by gavage，respectively.On the 19th day of pregnancy，10 pregnant rats were killed.The body and brain weight of lively fetal rats were scaled，then the expression of NGF and EGF were determined by immunohistochemical method.Results Passive smoking can decrease brain weight of fetal rats，while the HLWDHD group increase brain weight.The expression of NGF and EGF in model group was lower than nomal group（P＜0.01），the expression of NGF and EGF in treatment group was higher than that in model group（P＜0.01 or P＜0.05）.Conclusion The passive smoking during pregnance can lead to growth retardation，and Liuwei Dihuang Decoction can improve the growth of fetal rats by regulating NGF and EGF in brain.

fetal rats；brain；growth retardation；Liuwei Dihuang Decoction；nerve growth factor；epidermal growth factor

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.004

2015-07-15

國家自然科學(xué)基金項目（81202694），湖南省自然科學(xué)基金項目（2015JJ2105）。

彭千元，女，在讀碩士研究生，從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病研究。

*劉柏炎，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：liubaiyan@126.com。