吳琨鵬，易健，彭千元，湯艷，黃昕，劉柏炎*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南益陽(yáng)413000）

六味地黃湯對(duì)快速衰老小鼠認(rèn)知功能及Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響

吳琨鵬1，易健1，彭千元1，湯艷1，黃昕2，劉柏炎2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南益陽(yáng)413000）

目的研究六味地黃湯對(duì)D-半乳糖（D-gal）致快速衰老小鼠認(rèn)知功能及Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響。方法以500 mg/（kg·d）的D-半乳糖頸部皮下注射復(fù)制快速衰老小鼠模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組，模型組，六味地黃（簡(jiǎn)稱六味）高、中、低劑量組，VitE組，給予相應(yīng)干預(yù)，歷時(shí)8周。觀察小鼠的體質(zhì)量變化，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的認(rèn)知功能，免疫組化法、RT-qPCR法檢測(cè)Wnt3a、GSK-3β的表達(dá)。結(jié)果六味地黃湯對(duì)快速衰老小鼠體質(zhì)量及水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響：模型組與正常組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各用藥組與模型組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；六味高劑量組與其他用藥組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；六味地黃湯對(duì)快速衰老小鼠認(rèn)知功能及Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響：模型組與正常組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各用藥組與模型組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），六味高劑量組與其他用藥組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論六味地黃湯可以有效改善D-半乳糖致快速衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙；增加衰老小鼠Wnt3a的表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路，下調(diào)GSK-3β的表達(dá)可能是六味地黃湯延緩衰老健腦益智的作用機(jī)制。

六味地黃湯；認(rèn)知功能；Wnt3a；GSK-3β；抗衰老；熟地黃；山藥；山茱萸

衰老是伴隨年齡逐漸出現(xiàn)的機(jī)體退行性變化，其中腦衰老是一種不可避免的老化現(xiàn)象，核心癥狀就是認(rèn)知功能障礙。隨著社會(huì)老齡化加重，流行病學(xué)研究表明認(rèn)知功能障礙發(fā)病率越來(lái)越高，已經(jīng)成第四大致死因素。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦為髓之海，腎藏精生髓通于腦，腎精充足，則髓海得養(yǎng)，神機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)如常，反之，腎精虧損，髓?？仗摚瑒t腦的功能失常。六味地黃丸是中醫(yī)藥補(bǔ)益腎精的經(jīng)典方劑，出自于宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，藥理學(xué)及臨床研究表明六味地黃湯可明顯改善年齡相關(guān)性認(rèn)知功能障礙[1-2]。本研究則通過(guò)建立快速衰老模型，觀察六味地黃湯對(duì)衰老小鼠認(rèn)知功能及Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響，探討六味地黃湯抗衰老的可能機(jī)制，為臨床用藥提供理論支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

昆明種成年小白鼠40只，雄性，健康清潔級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，動(dòng)物購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，購(gòu)進(jìn)后常規(guī)喂養(yǎng)，合格證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 藥物

六味地黃湯：熟地黃24 g，干山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g。購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林藥房。按傳統(tǒng)方法煎煮，濃縮至每毫升4 g生藥，4℃冷藏備用。

1.3 試劑

D-半乳糖、SP-9 000（武漢博士德生物公司）；Wnt3a、GSK-3β免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司）；維生素E注射液（江西博萊大藥廠1 mL∶5 mg）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），qPCR試劑盒（TaKaRa），trizol（ambion）。

TP-1000電子天平（中國(guó)湘儀天平儀器廠）；水迷宮動(dòng)物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)（法國(guó)Viewpoint）；BX-51光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影數(shù)字彩超圖像分析儀系統(tǒng)（日本Olympus公司），realplex2熒光定量PCR儀（德國(guó)艾本德公司），232HK離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司），BG-AUHWIDI核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），BD106核酸蛋白濃度測(cè)定儀（英國(guó)BioDrop公司），T100梯度PCR擴(kuò)增儀、XRS+imager化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，小鼠死亡4只。余36只隨機(jī)分為正常組，模型組，六味地黃（簡(jiǎn)稱六味）高劑量組、中劑量組、低劑量組，VitE組，每組6只。除正常組以外的小鼠予每日頸部皮膚75%酒精消毒后，D-半乳糖0.5 g/（kg·d）頸部皮下注射，正常組小鼠予生理鹽水相同體積皮下注射，周期為8周，復(fù)制快速衰老小鼠模型。中劑量組相當(dāng)于60 kg體質(zhì)量人體表面積臨床等效劑量，高、中、低劑量組灌胃量分別為2、1、0.5 g/（kg·d），空白組、模型組每天給予等容積蒸餾水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予VitE注射液灌胃[100 mg/（kg·d）]，各組灌胃體積均為10 mL/（kg·d），灌胃8周，治療前及治療后均用Morris水迷宮系統(tǒng)測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的變化。第8周行水迷宮試驗(yàn)后所有小鼠行斷頸法處死，取腦組織采用免疫組化、RT-qPCR方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β的表達(dá)。

2.2 觀察體質(zhì)量變化

所有動(dòng)物自由進(jìn)食，飲水，活動(dòng)，每周稱質(zhì)量并記錄體質(zhì)量變化。

2.3 行為學(xué)測(cè)試

這個(gè)這個(gè)，當(dāng)然能種。村長(zhǎng)極力爭(zhēng)辯。一條尺把寬的溝，充其量占你八斗丘的二十分之一，說(shuō)不定更少，對(duì)你有什么影響呢。

2.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)5 d，每天固定時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。第1次訓(xùn)練時(shí)，將小鼠遠(yuǎn)離目標(biāo)象限面向池壁放入池中，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），后3次即將小鼠分別從其余3個(gè)不同象限放入水中，歷時(shí)2 min。2 min內(nèi)找不到平臺(tái)者潛伏期記錄為120 s，每次訓(xùn)練間隔20 s。4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為小鼠當(dāng)日的學(xué)

習(xí)成績(jī)[3]。

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)第6天撤除平臺(tái)，將小鼠從任意一區(qū)入水，記錄小鼠在2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)[4]。

2.4 檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β的含量

2.4.1 免疫組化方法檢測(cè)將保存在4%多聚甲醛中的腦組織取出，梯度脫水，石蠟切片，烤片（65℃）2 h后，常規(guī)脫蠟至水；高溫檸檬酸鹽液煮沸修復(fù)2 min，切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中浸泡10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；滴加正常山羊血清封閉15 min，并用PBS作空白對(duì)照；分別加入兩種抗體（Wnt3a和GSK-3β，濃度均為1∶100），各100 μL 37℃（2 h）；0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；加入通用型生物素化二抗100 μL，37℃15 min，0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素100 μL，37℃20 min，0.01 mol/L PBS泡洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。再于光學(xué)顯微鏡200倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野，由圖像分析系統(tǒng)測(cè)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量。

2.4.2 RT-qPCR檢測(cè)mRNA的相對(duì)量用trizol提取總RNA；于核酸蛋白溶度測(cè)定儀上測(cè)定RNA的溶度和質(zhì)量；行RNA瓊脂糖凝膠電泳，見(jiàn)兩條明顯的28 S、18 S的區(qū)帶；采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA；20 μL體系擴(kuò)增qPCR。采用2-ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)定量，反映目的基因表達(dá)水平，其數(shù)值越大，表達(dá)越強(qiáng)。詳見(jiàn)表1。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)物引物序列及反應(yīng)溫度、擴(kuò)增長(zhǎng)度

根據(jù)qPCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果，qPCR結(jié)果以Ct值表示，相對(duì)定量采用比較Ct法：以β-actin基因?yàn)楣芗一颍t為目的基因和管家基因的Ct值差。ΔΔCt表示對(duì)照組與處理組間的ΔCt差異。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 六味地黃湯對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響

隨著D-半乳糖頸部皮下注射時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠毛色明顯暗淡無(wú)光澤，神倦嗜睡，體質(zhì)量增加緩慢，呈現(xiàn)出明顯衰老體征。各組小鼠初始體質(zhì)量分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而終末體質(zhì)量模型組與正常組、用藥組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各組終末體質(zhì)量及增質(zhì)量均與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），六味高劑量組與VitE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 六味地黃湯對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=6，g）

表2 六味地黃湯對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=6，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與六味高劑量組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值初始體質(zhì)量19.9±0.1 20.0±0.4 19.9±0.2 19.9±0.2 19.7±0.7 20.1±0.6 0.508 0.768終末體質(zhì)量增質(zhì)量50.5±3.530.5±3.5 39.4±3.3**19.4±3.3** 46.2±2.6*▲▲29.2±2.5*▲▲45.2±2.1*▲▲#26.2±2.2*▲▲#44.2±2.2*▲▲#24.4±2.7*▲▲#45.0±4.1*▲▲#23.3±0.5*▲▲#16.66315.847 0.006

3.2 六味地黃湯對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

定位航向?qū)嶒?yàn)：造模前各組小鼠組間無(wú)差異（P＞0.05），造模后小鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)，平均逃避潛伏期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組小鼠的平均逃避潛伏期較其他5組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。六味高劑量組與中劑量組、低劑量

組、VitE組三組平均潛伏期比較具有顯著性差異（P＜0.01）。

空間探索實(shí)驗(yàn)：造模前各組小鼠跨臺(tái)次數(shù)無(wú)差異（P＞0.05）造模后次數(shù)減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組大鼠的跨臺(tái)次數(shù)明顯少于其他5組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；六味中劑量組與低劑量組及VitE比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 六味地黃湯對(duì)小鼠潛伏期及跨臺(tái)次數(shù)的影響（±s，n=6）

表3 六味地黃湯對(duì)小鼠潛伏期及跨臺(tái)次數(shù)的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與六味高劑量組比較，##P＜0.01；與六味中劑量組比較，●P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值逃避潛伏期（s）前后18.6±5.919.8±9.0 18.6±6.7101.5±13.2** 18.6±6.430.5±9.1▲▲19.3±6.349.5±8.9▲▲##18.8±5.862.3±5.8▲▲##19.5±6.964.1±11.1▲▲##0.72852.235 0.6080.000跨臺(tái)次數(shù)（次/120 s）前后14.5±1.114.0±2.0 13.7±2.23.8±1.3** 14.0±2.013.5±2.2▲▲13.8±1.510.0±1.0▲▲##14.0±2.17.8±1.4▲▲##●14.2±1.77.8±1.1▲▲##●0.14523.901 0.9800.000

3.3 六味地黃湯對(duì)小鼠腦內(nèi)Wnt3a、Gsk3β表達(dá)的影響

3.3.1 免疫組化方法與正常組比較模型組，Wnt3a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，Gsk-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），用藥各組與模型組比較，Wnt3a表達(dá)多，Gsk-3β表達(dá)少，差異具有顯著意義（P＜0.01），組間內(nèi)，六味高劑量組與其他用藥組比較，Wnt3a表達(dá)多，而GSK-3β表達(dá)較少，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），六味中劑量組與VitE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。

3.3.2 RT-qPCRWnt3a、GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，模型組Wnt3a mRNA相對(duì)量少，GSK-3βmRNA相對(duì)量多，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），組間內(nèi)，六味高劑量組與其他用藥組比較，Wnt3a mRNA相對(duì)量多，而GSK-3β表達(dá)較少，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），六味中劑量組與VitE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。

4 討論

人口老齡化趨勢(shì)增加了老年認(rèn)知功能障礙的患病率，早期干預(yù)治療是延緩衰老的最有效的措施。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎和腦的關(guān)系最密切，“腎生髓，通于腦”說(shuō)明腎精是腦生成的物質(zhì)基礎(chǔ)，腦為髓海，補(bǔ)腎益精中藥能生髓壯骨，亦可護(hù)腦益智健腦，這些是毋庸置疑的[5-7]。因此治療衰老性認(rèn)知功能障礙多從補(bǔ)腎填精論治。六味地黃湯是滋補(bǔ)肝腎的經(jīng)典名方，能健腦益智，長(zhǎng)期給予六味地黃湯可改善空間記憶能力及部分改善條件性逃避反應(yīng)能力，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)[8]，但對(duì)其作用機(jī)制尚不明確。

表4 六味地黃湯對(duì)快速衰老小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響（±s，n=6）

表4 六味地黃湯對(duì)快速衰老小鼠腦內(nèi)Wnt3a、GSK-3β表達(dá)的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與高組比較，##P＜0.01；與中組比較，●P＜0.05。

組別正常組模型組六味高劑量組六味中劑量組六味低劑量組VitE組F值P值Wnt3a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)mRNA相對(duì)量91.6±7.45.7±0.3 74.6±10.4**1.0±0.2** 112.6±18.2▲▲5.8±0.6*▲▲91.1±7.7▲▲##4.6±0.3▲▲##90.0±14.0▲▲##4.5±0.7▲▲##88.8±5.9▲▲##●3.1±0.7▲▲##●6.7677.125 GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)mRNA相對(duì)量58.3±6.20.3±0.1 98.0±8.2**1.0±0.1** 56.7±6.4▲▲0.3±0.1* 70.2±10.3▲▲##●0.4±0.2▲▲##72.5±10.9▲▲##0.5±0.1▲▲##73.4±9.3▲▲##●0.6±0.2▲▲##●102.910.5 0.000

在Wnt信號(hào)通路中Wnt3a是最常見(jiàn)的Wnt家族配體，它與細(xì)胞膜上的受體Frizzed結(jié)合，抑制下游GSK-3β的活性，使細(xì)胞內(nèi)β-catenin數(shù)量增多，后者達(dá)到一定水平后進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)相應(yīng)的靶基因的表達(dá)，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞間粘附及分化方面發(fā)揮著重要作用，是神經(jīng)發(fā)育的一條重要通道[10]。在體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，加入有活性的Wnt3a蛋白可減少神經(jīng)球的形成，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化[11]。腦缺血損傷下再灌注組的Wnt3a的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，其是損傷細(xì)胞增殖的重要激活劑[12-13]，GSK-3β是經(jīng)典的通路上一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控因子，其活性升高可抑制Wnt通路，使得GSK-3β對(duì)p-eatenin的磷酸化修增強(qiáng)并促進(jìn)其降解，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[14]，GSK-3β引起神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵，在老化的神經(jīng)細(xì)胞中GSK-3β的含量明顯增多[15]。

VitE是體內(nèi)不可獲缺的抗氧化的維生素，腦損傷后局部活性氧大量升高，而VitE干預(yù)后，SOD含量增加，MDA含量下降，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善[16]，VitE亦調(diào)節(jié)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，抑制抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致

的mDNA的損傷從而改善D-半乳糖誘致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[17]，故實(shí)驗(yàn)以VitE作為陽(yáng)性對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)表明D-半乳糖頸部皮下注射后小鼠認(rèn)知功能下降模型建立，各用藥組與模型組在體質(zhì)量、增重，逃避潛伏期、跨臺(tái)次數(shù)及Wnt3a、GSK-3β表達(dá)方面的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，六味地黃湯高劑量組增重多，逃避潛伏期短、垮臺(tái)次數(shù)多，Wnt3a表達(dá)顯著，而GSK-3β含量少，與其他各組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了六味地黃湯抗衰老的積極作用，結(jié)合當(dāng)前的研究，我們推斷提高Wnt3a的表達(dá)，抑制GSK-3β的含量，激活Wnt經(jīng)典信號(hào)通路是六味地黃湯改善認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。

[1]陳麗，周忠志，何澤云.六味地黃丸對(duì)慢性腎臟病研究的新進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（8）：104-107.

[2]李君玲，周恒，林麗娜.六味地黃丸輔佐治療延緩老年癡呆癥40例觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（1）：117-118.

[3]朱丹彤，肖波，謝光潔.化學(xué)點(diǎn)燃癲癇大鼠在水迷宮中學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定[J].卒中與神經(jīng)疾病，2003，10（1）：36-39.

[4]王俊亞，張冬梅.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的測(cè)試方法介紹及注意事項(xiàng)[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（21）：3 289-3 290.

[5]易亞喬，葛金文，鄧奕暉.從腎論治血管性癡呆臨床療效的Meta分析[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（11）：93-97.

[6]賀文彬，張俊龍，陳乃宏.“腎-髓-腦”生物軸理論初探[J].中醫(yī)雜志，2015，56（14）：1 182-1 184.

[7]劉宏，賈彥，仲麗麗.左歸丸對(duì)驚恐傷腎MCAO大鼠BDNF及其受體的影響[J].中醫(yī)藥信息，2015，32（4）：10-14.

[8]易健，劉柏炎，蔡光先.超微六味地黃湯對(duì)老年癡呆大鼠認(rèn)知功能和腦組織堿性成纖維生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（21）：139-142.

[9]Zhu ZZ，Yin JH，Guan JJ，et al.Lithium stimulates human bonemarrowderivedmesenchymalstemcellproliferation through GSK-3β dependent β-catenin/Wnt pathway activation. FEBS Journal，2014，23（281）：5 371-5 389.

[10]Wang L，Liu Y，Li S.Wnt signaling pathway participates in valproic acid-induced neuronal differentiation of neural stem Cells.Int J Clin Exp Pathol 2015，8（1）：578-585.

[11]MuroyamaY，KondohH，TakadaS.Wntproteinspromoteneuronaldifferentiationinneuralstemcellculture. Biochem Biophys Res Commun，2004，313（4）：915-921.

[12]張利美，周小青，劉旺華.丹龍醒腦方促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖與β-catenin、Wnt-3a表達(dá)及其機(jī)制的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（1）：7-10.

[13]羅時(shí)鵬，余資江，肖朝倫.小鼠缺血再灌注損傷后海馬齒狀回Wnt1、Wnt3a的表達(dá)變化[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（11）：2 578-2 581.

[14]Choi YK，Kim YS，Choi IY，et al.25-hydroxycholesterol induces Mitochondfia-dependent apoptosis via activation of glyc ogen synthasekinase-3beta in PCI2 cells[J].Free Radio Res，2008，42（6）：544-553.

[15]王淑敏，陳林林，王偉.LiCl通過(guò)抑制GSK-3β的活性防治AD的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版），2014，6（7）：17-19.

[16]潘天榮，張艷青，鐘明奎.甲狀腺素和維生素E干預(yù)對(duì)甲減大鼠認(rèn)知能力的影響及機(jī)制探討[J].中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，2010，18（5）：496-499.

[17]曲嫻，方文娟，李冰.維生素E對(duì)D-半乳糖誘致衰老小鼠腦抗氧化能力、鈣穩(wěn)態(tài)和線粒體DNA（mtDNA）損傷的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24（3）：523-526.

（本文編輯楊瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on Recognition and the Expression of Wnt3a and GSK-3β in Senescence Accelerated Mice

WU Kunpeng1,YI Jian1,PENG Qianyuan1,TANG Yan2,LIU Baiyan2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China；2.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China）

Objective To study the effect of Liuwei Dihuang Decoction（LWDHD）on recognition，Wnt3a and GSK-3β in D-galactose induced senescence accelerated mice.Methods The senescence accelerated mice were injected 500 mg/（kg·d）of D-galactose subcutaneously copy rapid，the animals were randomly divided into normal group，model group，high dose，medium dose and low dose of LWDHD groups and VitE group，which were given different processing.After gavage 10 mL/（Kg·d）for eight weeks，the mice body quality change was changed，cognitive function in mice was evaluated by line Morris water maze experiment，the expression of Wnt3a and GSK-3β were detected by immunohistochemical and RT-qPCR methods.Results Compared with normal group and other groups，the weight gain of body mass in model group was lesser（P＜0.05），the incubation period was longer and cross platform times was more（P＜0.05）；Compared with normal group，the diffrences of the body quality increases，the incubation period and cross platform number in high dose of LWDHD group were not statistically significant（P＞0.05）；Compared with VitE group，the body quality and the ability of learning and memory in low dose of LWDHD group have no statistical significance（P＞0.05）；The high dose of LWDHD group and other groups were statistically significant（P＜0.05）.The result showed high consistency by immunohistochemical method and RT-qPCR detection.Compared with the model group，the low expression of Wnt3a，high activity of GSK-3β in high dose of LWDHD group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；Compared with the medium and low dose of LWDHD groups and VitE group，the high

Liuwei Dihuang Decoction；cognitive function；Wnt3a；GSK-3β；anti-aging；Radix Rehmanniae Preparata；Rhizoma Dioscoreae；Fructus Corni

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.003

2015-09-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202694），湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015JJ2105）。

吳琨鵬，女，在讀碩士研究生，從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病研究。

*劉柏炎，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：liubaiyan@126.com。

expression of Wnt3a and low activity of GSK-3β in the high dose of LWDHD group were statistically significant（P＜0.01）. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can improve the learning and memory dioders in D-galactose induced senescence accelerated mice.The mechanism of Liuwei Dihuang Decoction in anti-aging and promoting intelligence could be increasing the Wnt3a expression in aging mice，activation of Wnt signaling pathways，and down-regulating GSK-3β expression.