殷玥 李晨 余璐 駱文靜 張文斌* 馬恒* (第四軍醫(yī)大學(xué): 預(yù)防醫(yī)學(xué)系勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室; 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室; 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室, 陜西 西安 700)

有氧間歇訓(xùn)練抑制高脂喂養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元損傷

殷玥1,2李晨2余璐3駱文靜1張文斌1*馬恒2*
(第四軍醫(yī)大學(xué):1預(yù)防醫(yī)學(xué)系勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室;2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室;3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室, 陜西 西安 710032)

目的肥胖是認(rèn)知缺陷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但相關(guān)機(jī)制仍待闡明。本研究旨在探討有氧間歇訓(xùn)練(AIT)對(duì)高脂(HF)飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響和可能的機(jī)制。方法40只2個(gè)月齡C57小鼠隨機(jī)分為：正常飲食對(duì)照組(Con)；正常飲食間歇訓(xùn)練組(Con+AIT)；高脂飲食組(HF)；高脂飲食間歇訓(xùn)練組(HF+AIT)。部分實(shí)驗(yàn)中采用20只2月齡去乙?；?(SIRT3)敲除小鼠(KO)隨機(jī)分為：高脂敲除組(HF KO)；高脂敲除間歇訓(xùn)練組(HF KO+AIT)。12 w后測(cè)定各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激程度及凋亡。結(jié)果與正常飲食對(duì)照組相比，12 w HF喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠肥胖，體重顯著增加。Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，高脂飲食(HF)小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)；平臺(tái)搜索實(shí)驗(yàn)中，HF小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。HF組海馬神經(jīng)元丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平顯著升高，而海馬神經(jīng)元線粒體抗氧化酶：錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase)的活性卻顯著降低(均P<0.05)。并且，HF組海馬神經(jīng)元中SIRT3表達(dá)水平顯著減少。與HF組相比，AIT可顯著增強(qiáng)HF小鼠海馬神經(jīng)元SIRT 3表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)其下游MnSOD和Catalase活性，減少HF組海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激，并改善學(xué)習(xí)記憶能力。但是，在SIRT 3敲除小鼠中，AIT對(duì)HF小鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用在被顯著抑制(均P<0.05)。結(jié)論AIT可有效上調(diào)海馬神經(jīng)元SIRT 3表達(dá)，增加線粒體抗氧化酶活性，進(jìn)而改善HF小鼠認(rèn)知能力。SIRT 3可能是AIT抑制HF海馬神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因子。

高脂飲食; 有氧間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練; 海馬; 學(xué)習(xí)記憶能力; 去乙?；?

全球肥胖癥患者已逾有12億。我國(guó)的相關(guān)人群已接近總?cè)丝诘?/4。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖是認(rèn)知缺陷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，肥胖個(gè)體認(rèn)知功能下降同時(shí)伴有相應(yīng)的海馬區(qū)神經(jīng)元損傷[1]。探索肥胖個(gè)體認(rèn)知障礙的發(fā)生機(jī)制和防治措施具有重要意義。臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生積極影響[2]。有氧間歇訓(xùn)練(aerobic interval training, AIT)是新興的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。AIT不僅可有效提高個(gè)體運(yùn)動(dòng)能力及機(jī)體健康狀況，還可對(duì)心血管疾病以及緩解肥胖產(chǎn)生明顯的治療效果[3]。但是，AIT對(duì)高脂飲食小鼠海馬組織的影響及作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)建立肥胖小鼠模型，旨在觀察AIT能否通過(guò)保護(hù)海馬神經(jīng)元改善肥胖個(gè)體認(rèn)知障礙。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

雄性C57BL/6小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Sirt3 基因敲除小鼠購(gòu)自于美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室?？谷ヒ阴；?(sirtuin3, SIRT3)、抗甘油醛3 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。過(guò)氧化氫酶(catalase)和錳超氧化物歧化酶(mn superoxide dismutase, MnSOD)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman Inc公司。丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)熒光探針購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所。TUNEL試劑盒為美國(guó)Roche公司產(chǎn)品。

二、實(shí)驗(yàn)分組

40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組：正常飲食對(duì)照組(Con+STA)；正常飲食間歇訓(xùn)練組(Con+AIT)；高脂飲食組(HF+STA)；高脂飲食間歇訓(xùn)練組(HF+AIT)。部分實(shí)驗(yàn)中采用20只2月齡SIRT3敲除小鼠(KO)隨機(jī)分為2個(gè)組：高脂敲除組(HF KO)；高脂敲除間歇訓(xùn)練組(HF KO+AIT)。

三、高脂喂養(yǎng)及AIT訓(xùn)練方案

正常飲食組參照國(guó)家嚙標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，高脂飼料參照文獻(xiàn)報(bào)道配置[4]。連續(xù)喂養(yǎng)12 w，有氧間歇訓(xùn)練(AIT)方案 參照文獻(xiàn)設(shè)定訓(xùn)練方案為[6]實(shí)驗(yàn)過(guò)程共進(jìn)行11 w。

四、Morris水迷宮檢測(cè)

水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)參照文獻(xiàn)報(bào)道方案進(jìn)行[5]。記錄每天4個(gè)象限的平均上臺(tái)潛伏期，以評(píng)判小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。

五、海馬神經(jīng)元內(nèi)ROS含量的檢測(cè)

用ROS敏感的熒光探針(CM-H2DCFDA)標(biāo)記海馬神經(jīng)元，在熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2DCFDA熒光強(qiáng)度的變化，以熒光強(qiáng)度( fluorescence intensity, FI)反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。熒光光譜儀檢測(cè)設(shè)定為488 nm(激發(fā)光)和525 nm(發(fā)射光)，ROS陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染呈紅色。拍照后用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計(jì)算平均吸光度(A)值。

六、SIRT3表達(dá)的Western blot檢測(cè)

BCA法蛋白定量，常規(guī)WB法，凝膠成像分析

七、Catalase及MnSOD酶活性的測(cè)定

Catalase和MnSOD酶活性的測(cè)定采用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)多個(gè)樣本均數(shù)間差異性檢驗(yàn)，若總體差異顯著, 再以post hoct檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間顯著性差別，以P<0.05 為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、AIT改善高脂飲食小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力

定位航行實(shí)驗(yàn)中，HF小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(圖1A)；平臺(tái)搜索實(shí)驗(yàn)中，HF小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05, 圖1B)。與HF組相比，HF KO+AIT組小鼠的逃避潛伏期縮短(圖1A)、在目標(biāo)象限的停留時(shí)間延長(zhǎng)(圖1B)(P<0.05)。該結(jié)果提示，AIT則可顯著改善HF小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

二、AIT顯著減輕高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激損傷

與正常飲食組相比，HF小鼠海馬神經(jīng)元ROS水平和MDA含量顯著增加(P<0.05, 圖2)。與HF小鼠相比，HF+AIT小鼠海馬神經(jīng)元ROS水平和MDA含量顯著降低(P<0.05, 圖2)。上述結(jié)果提示AIT可有效減輕高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元中的脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激損傷。

三、AIT顯著增加高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性

線粒體抗氧化酶在防御氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與Con組相比，HF小鼠海馬神經(jīng)元Catalase和MnSOD酶的活性顯著降低(P<0.05, 圖3)。經(jīng)過(guò)AIT后，HF小鼠海馬神經(jīng)元Catalase和MnSOD酶的活性均顯著提高(P<0.05, 圖3)。

四、AIT上調(diào)高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元SIRT3水平

SIRT3是線粒體抗氧化酶Catalase和MnSOD酶的重要上游調(diào)節(jié)因子。Con組相比，HF小鼠海馬神經(jīng)元中SIRT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05, 圖4)，而AIT可有效提高HF小鼠海馬神經(jīng)元SIRT3水平(P<0.05, 圖4)。

五、AIT通過(guò)SIRT3調(diào)節(jié)高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性

采用SIRT3基因敲除(KO)小鼠，觀察各組海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性的影響(圖5)。與野生型小鼠相比SIRT3 KO鼠在高脂喂養(yǎng)后，海馬神經(jīng)元的Catalase和MnSOD酶活性降低，ROS水平升高，即氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步惡化(P<0.05, 圖5B～ D)；并且，經(jīng)AIT后，并不能改善SIRT3敲除鼠在高脂喂養(yǎng)后的抗氧化酶活性和氧化應(yīng)激損傷(P>0.05, 圖5)，提示SIRT3是AIT上調(diào)海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性的重要信號(hào)機(jī)制。

六、AIT通過(guò)SIRT3保護(hù)高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元

在野生型小鼠中，AIT可有效減少HF小鼠海馬神經(jīng)元凋亡(P<0.05, 圖6)；與野生型小鼠相比，SIRT3 KO鼠在HF喂養(yǎng)后的海馬神經(jīng)元凋亡顯著增加(P>0.05, 圖6)，并且， AIT抑制HF小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用在SIRT3 KO小鼠中消失。

圖1 AIT對(duì)高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Fig 1 Effect of AIT on learning and memory ability of mice fed with high fat diet

A: Escape latency of place navigation test; B: Staying time in the quadrant in space probe test.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group.

圖2 AIT對(duì)高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激損傷的影響

Fig 2 Effect of AIT on lipid peroxidation and oxidative stress in the hippocampus of mice fed with high fat diet

A: The content of MDA in hippocampal neuron; B: The ROS level in hippocampal neuron.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group

圖3 AIT對(duì)高脂肥胖小鼠海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性的影響

Fig 3 Effect of AIT on the activity of antioxidant enzymes in the hippocampus of mice fed with high fat diet

A: The activity of catalase in hippocampal neuron; B: The activity of MnSOD in hippocampal neuron.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group

圖4 AIT對(duì)高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠海馬神經(jīng)元SIRT3表達(dá)的影響

Fig 4 Effect of AIT on SIRT3 expression in the hippocampus of mice fed with high fat diet

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group.

圖5 AIT對(duì)SIRT3敲除的肥胖小鼠海馬神經(jīng)元抗氧化酶活性的影響

Fig 5 Effect of AIT on the activity of antioxidant enzymes in the hippocampal neurons of SIRT3 knockout mice with high fat diet

A: Expression of SIRT3 in hippocampal neuron; B: Effect of AIT on the activity of MnSOD in hippocampal neuron; C: Effect of AIT on the activity of catalase in hippocampal neuron; D: Effect of AIT on the level of ROS in hippocampal neuron.

aP<0.05,vsWT HF group;bP<0.05,vsKO HF group.

圖6 AIT對(duì)SIRT3敲除的肥胖小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Fig 6 Effect of AIT on the apoptosis of hippocampal neurons in SIRT3 knockout mice with high fat diet

aP<0.05,vsWT HF group;bP<0.05,vsKO HF group.

討 論

由于高脂飲食和缺乏運(yùn)動(dòng)鍛煉，肥胖已成為一種危害人群健康的慢性代謝性疾病。肥胖與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，長(zhǎng)期高脂飲食的人群存在認(rèn)知功能障礙、失憶、阿爾茲海默癥等問(wèn)題。海馬區(qū)是學(xué)習(xí)和記憶的代表區(qū)，與認(rèn)知功能密切相關(guān)，肥胖引起海馬區(qū)損傷進(jìn)一步導(dǎo)致個(gè)體認(rèn)知功能下降。神經(jīng)元對(duì)氧自由基損害尤為敏感。肥胖引起海馬損傷主要是由于脂肪酸代謝增強(qiáng)，氧自由基產(chǎn)生增多，引起神經(jīng)元細(xì)胞膜過(guò)氧化，Park等則發(fā)現(xiàn)高脂膳食可明顯減少海馬神經(jīng)細(xì)胞的新生，并且引起血清和海馬區(qū)腦組織內(nèi)的MDA含量升高，提示高脂膳食加劇腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[6]。臨床研究也表明認(rèn)知功能減退[7]。我們的研究再次證實(shí)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷和凋亡增加，破壞小鼠的認(rèn)知能力。SIRT3是線粒體內(nèi)的重要去乙?；?，可以通過(guò)使MnSOD酶和Catalase去乙?；?，從而增強(qiáng)其抗氧化功能。在糖尿病和肥胖人群中SIRT3的活性水平和MnSOD酶的表達(dá)水平均下降[8]。但SIRT3在肥胖引起的認(rèn)知功能障礙中的作用尚不明確。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)：高脂膳食誘導(dǎo)肥胖引起海馬神經(jīng)元損傷氧化應(yīng)激水平增加，主要是由于去乙?；窼IRT3的表達(dá)水平下降和抗氧化酶系的功能受損所致。

AIT是一種新的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式，可提高心肺和肌肉功能，對(duì)于糖尿病，肥胖癥和阿爾茲海默癥等認(rèn)知障礙也具有治療作用。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高海馬的可塑性，減少神經(jīng)元的凋亡，并改善學(xué)習(xí)記憶的能力[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：自主輪跑運(yùn)動(dòng)可使小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，空間記憶能力增強(qiáng)[9]。AIT還增強(qiáng)動(dòng)物腦內(nèi)SOD的活性，降低MDA的含量，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和清除自由基能力[10]。本研究證實(shí)，AIT可有效增高肥胖小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)SIRT3的表達(dá)水平，從而提高線粒體內(nèi)SOD和Catalase等抗氧化酶活性，減少ROS和MDA的含量，進(jìn)而改善肥胖小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。通過(guò)敲除小鼠，我們更明確地發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)SIRT3的表達(dá)降低是抗氧化酶系統(tǒng)削弱的主要原因，表明SIRT3是保護(hù)肥胖小鼠海馬神經(jīng)元的重要調(diào)控因子。本研究提出SIRT3是肥胖人群認(rèn)知障礙的重要干預(yù)靶點(diǎn)，有氧間歇訓(xùn)練作為一種普遍的可接受的運(yùn)動(dòng)方式，可以成為肥胖治療與改善認(rèn)知功能的綜合治療手段。

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Aerobicintervaltraininginhibitshippocampalneuroninjuryinmicewithhighfatdiet

YINYue1,2,LIChen2,YULu3,LUOWenjing1,ZHANGWenbin1,MAHeng2

1DepartmentofLaborHygienics;2DepartmentofPathophysiology;3DepartmentofPathology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveObesity is an independent risk in cognitive deficits, but its mechanism remains to be discovered. The protection and mechanism of aerobic interval training (AIT) in hippocampal neuron injury of high fat diet mice are discussed.MethodsForty 2-month-old C57BL/6 mices were randomly divided into control group (Con); Con+AIT group; high fat group (HF) and HF+AIT group. Another twenty 2-month-old Sirtuin3 knock out (SIRT3 KO) mice were randomized into HF KO group and HF KO+AIT group.ResultsCompared with those in control diets, high fat diet for 12 w significantly increased the weight and induced the obesity. The Morris Water-maze training suggested the spatial memory dysfunction in high fat diet group. The level of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) was increased in the HF group, while the activity of Mn superoxide dismutase (MnSOD) and catalase and the expression of SIRT3 were decreased (P<0.05). AIT may enhance the SIRT3 expression of hippocampal neuron in HF group, which improved the activity of MnSOD and catalase and alleviated the oxidative stress and injury of cognition ability. However, the protection was suppressed in SIRT3 knock-out mice (P<0.05).ConclusionAIT improves the expression of SIRT3 and the activity of mitochondria anti-oxidative enzyme, which ameliorates the cognition of high fat diet mice. SIRT3 may be the key factor that AIT suppresses hippocampal neuron injury induced by the high fat diet.

High-fat diet; Aerobic interval training; Aerobic interval training; Studying and memory ability; SIRT3

1671-2897(2016)15-209-04

·神經(jīng)損傷研究·

R 151.1; R 338

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201037，81170108，81322004，81330045，81102119)

殷玥，碩士研究生，E-mail: music1021@126.com

*通訊作者： 馬恒，副教授，E-mai: hengma@fmmu.educ.cn；張文斌，副教授，E-mail: zwb@fmmu.edu.cn

2015-07-31；

2015-09-15)