王瀟，于穎琪，鄭潔瑩，單振剛，雷潤宏，隋麗，孔福全，陳洪濤，鄧玉林，馬宏

(1.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2.中國原子能科學(xué)研究院 核物理所，北京 102413)

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14 MeV快中子輻照對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)的損傷

王瀟1,2，于穎琪2，鄭潔瑩2，單振剛1，雷潤宏1，隋麗2，孔福全2，陳洪濤2，鄧玉林1，馬宏1

(1.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2.中國原子能科學(xué)研究院 核物理所，北京 102413)

用14 MeV快中子對(duì)Wistar雄性大鼠進(jìn)行5 Gy的全身照射，觀察其免疫系統(tǒng)損傷情況及氧化應(yīng)激的相關(guān)變化. 大鼠分為輻射組和對(duì)照組，分別在輻射后1,7,14 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血液、胸腺和脾臟進(jìn)行研究. 結(jié)果表明，輻照后第1 d，輻照組大鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量降至最低，照后第7、14 d有所恢復(fù)，但仍不足正常組的1/2. 血小板數(shù)在照后第1 d開始減少，至第7 d達(dá)到最低值，第14 d仍與正常組有顯著差異. 而大鼠骨髓有核細(xì)胞總數(shù)輻照后14 d明顯低于正常組. 另外胸腺和脾臟均出現(xiàn)萎縮，臟器指數(shù)明顯減小. 血漿、胸腺和脾臟的總抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量均有不同程度的升高趨勢(shì). 說明快中子輻射影響血漿、胸腺和脾臟的抗氧化應(yīng)激能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，造成胸腺和脾臟的萎縮以及一系列組織形態(tài)的改變，從而嚴(yán)重影響大鼠的正常免疫功能.

快中子；大鼠；輻射損傷；免疫系統(tǒng)

隨著人類科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)絹碓蕉嗟亟佑|到中子輻射，尤其是在空間飛行和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域. 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，快中子治癌的研究始于1938年，迄今已有上萬例癌癥病人接受了快中子治療. 大量臨床試驗(yàn)表明，快中子對(duì)唾液腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、軟組織腫瘤等的療效明顯優(yōu)于光子[1]. 但是，快中子治療也增加了正常組織的放射損傷，特別是晚期反應(yīng)較重，限制了其治療適應(yīng)范圍的擴(kuò)大和療效的提高. 因此，進(jìn)一步加深對(duì)快中子輻射損傷與修復(fù)機(jī)制的研究是輻射醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題.

中子主要來源于反應(yīng)堆、加速器和自發(fā)裂變，以及實(shí)驗(yàn)研究和臨床上治療惡性腫瘤用的中子源[2]. 中子是一種質(zhì)量與質(zhì)子相當(dāng)?shù)牟粠щ娏Ｗ?，具有很?qiáng)的穿透力，能夠釋放出直接電離粒子或引起核反應(yīng). 中子在與組織物質(zhì)作用過程中產(chǎn)生帶電粒子，有一定能量的次級(jí)帶電粒子能夠引起電離和激發(fā)，從而使機(jī)體組織受到損傷[3]. 目前快中子輻射對(duì)動(dòng)物損傷效應(yīng)研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還比較少. 因此，本研究對(duì)14 MeV快中子輻照大鼠后的損傷情況進(jìn)行了全面研究，關(guān)注了造血與免疫系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)的輻射損傷效應(yīng)，為更全面的研究快中子輻射生物效應(yīng)及其機(jī)制提供寶貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料、內(nèi)容及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

雄性Wistar大鼠，8周左右，體重230～260 g，SPF級(jí)動(dòng)物房正常養(yǎng)殖3 d以適應(yīng)環(huán)境，每只大鼠均在尾部標(biāo)記，于實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為正常組和輻照組，每組各5只. 實(shí)驗(yàn)中每天觀察大鼠的毛色、飲食和排泄?fàn)顩r，并記錄其體重變化.

輻射在中國原子能科學(xué)研究院600 kV高壓倍加器上使用直流束進(jìn)行，束流強(qiáng)度為1 mA以上. 所用的反應(yīng)為T(d，n)α，產(chǎn)生能量為14 Mev的單能中子. 實(shí)驗(yàn)中的中子注量是通過監(jiān)測(cè)伴隨α粒子的方法來實(shí)現(xiàn)的. 由中子的比釋動(dòng)能k(Gy/cm2)，中子注量Φ(/cm2)和中子在水中的吸收劑量的轉(zhuǎn)換關(guān)系為D=k×Φ，因中子在水中的比釋動(dòng)能k=6.9×10-11Gy/cm2，經(jīng)計(jì)算可得樣品所受劑量. 輻照時(shí)，大鼠距離靶頭14.1 cm，總劑量5 Gy.

利用14 MeV快中子對(duì)Wistar雄性大鼠進(jìn)行5 Gy的全身照射后，分別在輻射后1，7，14 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行心尖取血，取血后以生理鹽水心臟灌流，摘取胸腺、脾臟進(jìn)行氧化應(yīng)激水平檢測(cè).

1.2 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

骨髓有核細(xì)胞是指骨髓細(xì)胞中含有細(xì)胞核的細(xì)胞，骨髓細(xì)胞中除了成熟的紅細(xì)胞和血小板外，其余細(xì)胞都有細(xì)胞核. 骨髓有核細(xì)胞的總數(shù)增多，則表示骨髓增生，如白血病、溶血性貧血、脾功能亢進(jìn)等；骨髓有核細(xì)胞總數(shù)減少則表示造血組織功能減退，如再生障礙性貧血等[4]. 故本實(shí)驗(yàn)通過骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)來評(píng)估快中子對(duì)造血系統(tǒng)的損傷. 取大鼠兩側(cè)股骨，分別用1 mL的PBS沖出骨髓后，用PBS稀釋20倍，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).

1.3 抗氧化能力及激素水平測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)抗氧化能力使用南京建成的丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)WST-1檢測(cè)試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參見檢測(cè)試劑盒說明書.

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 14 MeV快中子輻射對(duì)大鼠白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的影響

表1顯示了不同時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞比率的變化，并將快中子輻照組與正常組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了顯著性差異比較.

以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，快中子輻照對(duì)外周血中白細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，白細(xì)胞總數(shù)顯著減少(p<0.01)，且難以恢復(fù)至正常水平. 在白細(xì)胞分類中，淋巴細(xì)胞對(duì)快中子輻射具有更高的敏感性，在輻照后淋巴細(xì)胞減少的比率大于白細(xì)胞總數(shù)減少比率，造成淋巴細(xì)胞比率減少. 但淋巴細(xì)胞恢復(fù)較快，照后第7 d即恢復(fù)正常. 而淋巴細(xì)胞總數(shù)受到整體造血功能的限制無法回到正常值.

時(shí)間/d1714組別白細(xì)胞計(jì)數(shù)/109淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)/109淋巴細(xì)胞比率/%正常組487±108393±0748140±918輻照組064±005???038±007???5730±1021???正常組270±060188±0656936±941輻照組143±049??093±028??6675±1462正常組240±086198±0557550±490輻照組117±075?125±007?7907±247

注：*為與正常組比較，p<0.1；**為與正常組組比較，p<0.05；***為與正常組比較，p<0.01，以下同

2.2 14 MeV快中子輻射對(duì)大鼠紅細(xì)胞及血小板的影響

表2顯示了不同時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血中紅細(xì)胞總數(shù)和血小板數(shù)的變化，并將快中子輻照組與正常組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了顯著性差異比較.

結(jié)果顯示，輻照后第14 d快中子輻照組大鼠的紅細(xì)胞總數(shù)約為正常組的6/7(p<0.01). 而照后第1，7 d，與正常組相比基本沒有差異. 說明快中子對(duì)紅細(xì)胞造成的損傷沒有白細(xì)胞顯著. 輻照后第1，7，14 d，輻照組大鼠的血小板總數(shù)均顯著低于正常組. 其中，輻照后第1 d，輻照組大鼠血小板數(shù)開始減少，輻照后第7 d，血小板數(shù)繼續(xù)減少，達(dá)到最低值，第14 d血小板數(shù)仍與正常組有顯著差異(p<0.01)，說明快中子對(duì)血小板造成了嚴(yán)重?fù)p傷且較難修復(fù). 這一結(jié)果與急性放射病造成的結(jié)果一致，說明血小板對(duì)高LET輻射同樣敏感.

時(shí)間/d1714組別紅細(xì)胞計(jì)數(shù)/1012血小板計(jì)數(shù)/109正常組874±062122840±17748輻照組850±10591200±19913??正常組895±045118233±14408輻照組879±03925525±26586???正常組904±050125750±9827輻照組771±028???47450±28300???

2.3 胸腺和脾臟的臟器指數(shù)變化

計(jì)算胸腺臟器指數(shù)和脾臟臟器指數(shù)，結(jié)果如圖1(a)和1(b)所示.

從上述結(jié)果中可以看出，胸腺和脾臟都是對(duì)快中子輻射極為敏感的組織，輻照后臟器指數(shù)變化明顯，胸腺于照后不同的時(shí)間顯示出一定的損傷修復(fù)，但在本實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間內(nèi)始終未達(dá)到正常水平.

2.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

圖1(c)為輻照后第14 d大鼠的骨髓有核細(xì)胞總數(shù). 從圖中可以看到，快中子輻照后，大鼠的骨髓有核細(xì)胞總數(shù)明顯低于正常組(p<0.05). 由此可以得知，快中子輻射對(duì)骨髓造血系統(tǒng)造成了嚴(yán)重影響，且在本實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)無法恢復(fù).

2.5 快中子對(duì)大鼠抗氧化功能的影響

以上結(jié)果顯示，14 MeV快中子對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)造成損傷，下面通過觀察輻照后血漿、胸腺和脾臟的總抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量來評(píng)估快中子對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)損傷的機(jī)制.

2.5.1 14 MeV快中子輻射后大鼠血漿中抗氧化功能變化

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出血漿稀釋15倍可使SOD抑制率在40%～60%之間，故將樣品用生理鹽水稀釋15倍再進(jìn)行測(cè)定. 測(cè)得的吸光度值按說明書中的公式計(jì)算SOD活性、MDA的含量和總抗氧化能力，不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿SOD活性、MDA含量和總抗氧化能力結(jié)果如圖2所示.

結(jié)果顯示，14 MeV快中子輻射后，大鼠血漿中SOD活性持續(xù)降低. 說明快中子輻射對(duì)大鼠超氧化物歧化酶的活性造成了影響，該影響隨時(shí)間而日益嚴(yán)重. 而大鼠血漿中MDA含量持續(xù)升高，說明快中子輻射對(duì)大鼠抗氧化能力產(chǎn)生了較嚴(yán)重的影響，破壞了自由基的平衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增多，該影響隨時(shí)間而日益嚴(yán)重. 該變化與SOD活性的變化成負(fù)相關(guān). 而14 MeV快中子輻射后第1 d，輻照組大鼠血漿的總抗氧化能力略有下降，無明顯變化，至照后第7 d幾乎沒有差別，可能是因?yàn)槠渌敲割惪寡趸瘎┑恼{(diào)節(jié)起了作用.

2.5.2 14 MeV快中子輻射后大鼠胸腺中抗氧化功能變化

同理得不同時(shí)間點(diǎn)大鼠胸腺SOD活性、MDA濃度和T-AOC活性結(jié)果如圖3所示.

結(jié)果顯示，14 MeV快中子輻射后，大鼠胸腺中SOD活性、MDA含量和總抗氧化能力，相比對(duì)照組都升高(p<0.05)，且持續(xù)到輻照后第7 d. 說明快中子輻射對(duì)大鼠超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力的影響將長期存在.

2.5.3 14 MeV快中子輻射后大鼠脾臟中抗氧化功能變化

同樣方法得到不同時(shí)間點(diǎn)大鼠脾臟SOD活性、MDA含量和T-AOC活性結(jié)果如圖4所示.

結(jié)果顯示，14 MeV快中子輻射后，大鼠脾臟中SOD活性、MDA濃度和總抗氧化能力，相比對(duì)照組，在輻射后第1 d沒有顯著變化，到輻照后第7 d卻顯著升高(p<0.01). 說明快中子輻射對(duì)大鼠脾臟超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力的影響在輻射后第7 d比較顯著.

3 討 論

隨著人類對(duì)宇宙空間的深入探索以及中子在醫(yī)療衛(wèi)生、科研應(yīng)用及軍事領(lǐng)域的廣泛使用，使得人們?cè)絹碓蕉嗟亟佑|到中子輻射. 而中子作為一種高LET輻射，具有比低LET輻射更高的相對(duì)生物效應(yīng)，誘發(fā)嚴(yán)重的DNA雙鏈斷裂、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期阻滯等[5]. 造血和免疫系統(tǒng)都是對(duì)電離輻射極為敏感的組織，低LET輻射對(duì)造血及免疫系統(tǒng)的損傷研究已經(jīng)闡明了其損傷規(guī)律和特點(diǎn)，而中子輻射損傷的生物效應(yīng)的研究則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠.

研究發(fā)現(xiàn)，5 Gy的14 MeV快中子輻射嚴(yán)重影響了大鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例，對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制作用最為明顯，并且難以修復(fù). 其中照射后第1 d，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量降至最低，照后第7、14 d有所恢復(fù)，但仍不足正常組的1/2，可見損傷嚴(yán)重. 另外淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞群體對(duì)快中子輻射最為敏感的一類，發(fā)現(xiàn)照后第1 d，淋巴細(xì)胞的比率明顯降低，并且大鼠外周血血小板總數(shù)明顯低于正常組，說明快中子對(duì)血小板造成了嚴(yán)重?fù)p傷且較難修復(fù)，這一結(jié)果，與謝漪[6]等研究發(fā)現(xiàn)小鼠受1 Gy X射線全身照射24 h后，外周血淋巴細(xì)胞比例顯著減少的現(xiàn)象相符. 另外還發(fā)現(xiàn)，大鼠的骨髓有核細(xì)胞總數(shù)明顯低于正常組，與正常組相差近一個(gè)數(shù)量級(jí). 由以上結(jié)果，可以得出快中子輻射對(duì)骨髓造血系統(tǒng)和大鼠免疫系統(tǒng)造成了嚴(yán)重影響，且在本實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)無法恢復(fù).

本實(shí)驗(yàn)中，注意到與輻射后7、14 d相比，輻射后1 d，正常對(duì)照組大鼠白細(xì)胞數(shù)顯著升高(表1)，分析原因可能是由于免疫系統(tǒng)是對(duì)外界環(huán)境刺激非常敏感的系統(tǒng)，而麻醉、捆綁、長途運(yùn)輸?shù)雀鞣N操作都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的炎性白細(xì)胞增高，而隨著時(shí)間的延長，應(yīng)激性刺激的效應(yīng)減弱直至恢復(fù)正常.

此外，通過觀察胸腺、脾臟的臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，快中子輻照后，胸腺和脾臟均出現(xiàn)萎縮，臟器指數(shù)明顯減小. 其中胸腺臟器指數(shù)呈現(xiàn)先下降，而后回升，再下降的特點(diǎn)，這一結(jié)果與王寶勤等[7]研究發(fā)現(xiàn)小鼠受2.3 Gy裂變中子或相似致死劑量4.5 Gy γ射線照射后，其胸腺細(xì)胞數(shù)均出現(xiàn)急劇下降，而后回升，再出現(xiàn)第2次下降和第2次恢復(fù)的現(xiàn)象相符. 由胸腺和脾臟臟器指數(shù)的明顯降低，可以得出快中子輻射對(duì)胸腺及脾臟造成了嚴(yán)重?fù)p傷，由此影響了大鼠免疫系統(tǒng)的正常工作.

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，其中超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧自由基清除劑，而丙二醛MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[8]. 本研究通過觀察輻照后血漿、胸腺和脾臟中總抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量發(fā)現(xiàn)，14 MeV快中子對(duì)大鼠的抗氧化功能造成損傷，且持續(xù)到輻照后第7 d. 這一結(jié)果與彭潔等[9]研究發(fā)現(xiàn)小鼠受到5 Gyγ全身照射后，肝臟組織中的SOD活性降低、MDA含量增加，氧化應(yīng)激損傷的現(xiàn)象相符.

4 結(jié)束語

快中子輻射可以通過損傷造血干細(xì)胞、影響造血微環(huán)境來對(duì)大鼠造血系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的減少，從而，進(jìn)一步影響機(jī)體的免疫及其他生理功能. 同時(shí)，快中子輻射還可以直接損傷胸腺和脾臟這兩個(gè)重要的免疫器官，影響血漿、胸腺和脾臟的抗氧化應(yīng)激能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，造成胸腺和脾臟的萎縮，從而嚴(yán)重影響大鼠的正常免疫功能.

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(責(zé)任編輯：孫竹鳳)

Radiation Damage to Rat Immune System Induced By 14 Mev Fast Neutrons

WANG Xiao1,2，YU Ying-qi2，ZHENG Jie-ying2，SHAN Zhen-gang1，LEI Run-hong1，SUI Li2，KONG Fu-quan2，CHEN Hong-tao2，DENG Yu-lin1，MA Hong1

(1.School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China;2.Department of Nuclear Physics，China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China)

In order to study the damage of immune system and antioxidant ability of rats induced by fast neutron, Wistar male rats were irradiated with 14 MeV fast neutrons on whole-body at the dose of 5 Gy. Wistar rats were randomly divided into control group and irradiation group. The blood, thymus, spleen and the oxidative damage (the level of SOD, MDA and T-SOD) were examined at 1, 7 and 14 d after radiation. Compared with the control group, the number of white cells and lymphocytes of rats reached to a minimum at the first day after irradiation, and after 7 and 14 d, was still less than the normal group. Platelet count began to decrease at first day, after exposure to seventh day, reaching a minimum value, and still had significant difference with that of the normal group at the fourteenth day. While the nucleated cell number in rat bone marrow after irradiation for 14 days was significantly lower than normal group. In addition, the thymus and spleen were shrinking, viscera index decreased significantly. The level of SOD, MDA and T-SOD of plasma, thymus and spleen increased in different degree. Results show that, fast neutron irradiation has effect on thymus, spleen and plasma, rising oxidative stress and apoptosis, resulting in spleen and thymus atrophy and a series of morphological changes, which seriously affect the immune function in rats.

neutrons; rats; radiation damage; immune system

2014-03-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200636，11079054)

王瀟(1966—)，女，研究員，E-mail：junmei33@ailiyun.com.

馬宏(1974—)，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：04656@bit.edu.cn.

Q 691.5

A

1001-0645(2016)07-0765-06

10.15918/j.tbit1001-0645.2016.07.020