戴江玉，高 光，吳時強，吳修鋒，周 杰，薛萬云，楊倩倩，陳 丹

（1：南京水利科學研究院水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，南京210029）（2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京210008）（3：環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所南京國環(huán)科技股份有限公司，南京210042）

水體細菌堿性磷酸酶及其編碼基因研究進展?

戴江玉1，高 光2，吳時強1，吳修鋒1，周 杰1，薛萬云1，楊倩倩1，陳 丹3??

（1：南京水利科學研究院水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，南京210029）（2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京210008）（3：環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所南京國環(huán)科技股份有限公司，南京210042）

水體溶解性反應磷是浮游植物可直接利用的主要磷營養(yǎng)形式，細菌堿性磷酸酶催化的有機磷礦化過程則是維持溶解性反應磷供給的重要途徑.通過總結細菌堿性磷酸酶的種類與分布特征，發(fā)現主要包括PhoA、PhoX和PhoD 3種類型細菌堿性磷酸酶，其中超過50%的PhoX分布于細菌細胞的外部環(huán)境，對溶解性反應磷的循環(huán)再生尤為重要.綜述水體產堿性磷酸酶細菌群落組成的研究進展，以及影響編碼基因表達的環(huán)境因素，對比分析產堿性磷酸酶細菌群落鑒定方法的特點及發(fā)展趨勢.細菌堿性磷酸酶編碼基因的研究多關注寡營養(yǎng)海洋生態(tài)系統(tǒng)，對于同樣存在磷限制問題的富營養(yǎng)化湖泊生態(tài)系統(tǒng)鮮有涉及，而構建針對典型富營養(yǎng)化湖泊生態(tài)系統(tǒng)的細菌宏基因組數據庫，則可為建立淡水生態(tài)系統(tǒng)細菌堿性磷酸酶及其編碼基因的研究方法奠定基礎，有助于認識湖泊水華頻發(fā)的微生物學驅動機制.

磷；細菌；堿性磷酸酶；編碼基因；湖泊

anisms driving frequent cyanobacterial blooms in lakes.

?國家水體污染控制與治理科技重大專項（2012ZX07506-003-04）、國家自然科學基金項目（51309156，51479120，51479121）、江蘇省自然科學基金項目（BK20141075）、水利部公益性行業(yè)科研專項（201501015-01）和南京水利科學研究院院基金項目（Y116006）聯合資助.2016-04-05收稿；2016-07-18收修改稿.戴江玉（1985～），男，博士，高級工程師；E-mail：jydai＠nhri.cn.

??通信作者；E-mail：chendan_nies＠163.com.

磷是生命體必需的營養(yǎng)元素，也是水生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生源要素之一.在水生態(tài)系統(tǒng)中，一般能為生物直接利用的只有溶解性反應磷（soluble reactive phosphorus，SRP），因此磷也是水生態(tài)系統(tǒng)維持初級生產力的重要因子［1-2］.水生態(tài)系統(tǒng)中溶解性反應磷的濃度通常較低，在一些寡營養(yǎng)的海洋水體中，溶解性反應磷的濃度甚至僅處于納摩爾級別［3-4］.為了維持自身的生長與繁殖，水生微生物也進化出了不同的生存策略.對于“嚴格寡營養(yǎng)性微生物（Strict oligotrophs）”來說，其可通過降低自身對于磷營養(yǎng)的需求來適應低磷環(huán)境，如寡營養(yǎng)海洋中的原綠球藻（Prochlorococcus）和遠洋桿菌（Pelagibacter）［5-6］.而“機會營養(yǎng)性微生物（Opportuni-trophs）”則有多種策略應對低磷環(huán)境［7］，最典型的就是“磷饑餓”響應策略.水生生物在“磷饑餓”條件下，可通過分泌堿性磷酸酶，酶解水體或自身細胞中的磷酸脂類有機磷，進而獲得可直接利用的溶解性反應磷［8-9］.堿性磷酸酶能夠促進水體有機磷的礦化，對于維持水生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產力等具有重要的生態(tài)學作用［10］.

細菌是水生態(tài)系統(tǒng)中微食物網的重要組成部分［11］，也是有機磷的重要礦化者［12］.現有的研究已獲得了海洋生態(tài)系統(tǒng)中細菌堿性磷酸酶的種類、亞細胞分布、活性和功能基因的表達及相關因素等方面的知識［13-22］，但對淡水生態(tài)系統(tǒng)，尤其是湖泊中細菌堿性磷酸酶的研究還多處在關注其活性及其與環(huán)境因素關系的層面［23-34］，缺乏對細菌堿性磷酸酶更為深入的認識.

我國是一個多湖泊國家，全國1 km2面積以上的湖泊有2759個，其中有651個位于長江中下游地區(qū)，且大多數為淺水富營養(yǎng)化湖泊［35］.由于氣候和人為因素的影響，淺水富營養(yǎng)化湖泊常爆發(fā)嚴重的藍藻水華，加上淺水湖泊本身具有的小幅高頻的水動力擾動和差異顯著的生態(tài)系統(tǒng)結構等生態(tài)特征，使得淺水富營養(yǎng)化湖泊的物質循環(huán)和能量流通過程顯著區(qū)別于海洋和深水湖泊.而且，淺水富營養(yǎng)化湖泊生物的生長與繁殖也常常受到磷營養(yǎng)的限制.因此，研究細菌堿性磷酸酶編碼基因對于揭示水體中有機磷礦化的微生物驅動機制具有重要意義.

本文通過綜述國內外有關細菌堿性磷酸酶及其編碼基因的研究進展，闡述了細菌堿性磷酸酶在湖泊有機磷礦化過程中的地位，總結了細菌堿性磷酸酶編碼基因的特性、功能以及研究方法，分析了湖泊細菌堿性磷酸酶的微生物學機制與研究前景，為我國湖泊富營養(yǎng)化機理的研究工作提供參考.

1 水體堿性磷酸酶的來源

天然水生態(tài)系統(tǒng)中的堿性磷酸酶來源復雜，水體中的細菌、浮游植物、浮游動物、底棲生物和大型水生植物都可以分泌堿性磷酸酶.目前學者認同的觀點是水生態(tài)系統(tǒng)中堿性磷酸酶主要來源于浮游藻類和細菌［36］，而且在不同的天然水生態(tài)系統(tǒng)中，這2種來源的堿性磷酸酶對水體總堿性磷酸酶活性的貢獻也有差異，通常浮游藻類產生的堿性磷酸酶活性要高于細菌產生的堿性磷酸酶活性，這與部分細菌附著于浮游藻類顆粒上增加了浮游藻類堿性磷酸酶活性有一定的關系［37］.同時，在物種親緣關系上，浮游植物中的大部分藻類還是屬于原核生物，與異養(yǎng)細菌在基因水平上有很好的遺傳發(fā)育關系，例如微囊藻（Microcystis）和超微藻（picoplankton）.更為廣泛的定義認為細菌應包括異養(yǎng)細菌和原核藻類［38］.

水體中的堿性磷酸酶主要分布于細菌或藻類細胞的胞內和胞外［39］.胞內堿性磷酸酶主要分布于細胞內膜、周質和細胞質.胞外堿性磷酸酶包括附著于細胞外膜的堿性磷酸酶和水體溶解態(tài)堿性磷酸酶.很多種細菌和浮游藻類分泌的胞外堿性磷酸酶既能附著在細胞表面，又能以溶解態(tài)存在于水體中［40］.細菌是水生態(tài)系統(tǒng)中胞外堿性磷酸酶的主要產生者［41］，其胞外堿性磷酸酶活性通常對湖泊水體的堿性磷酸酶活性有相當比例的貢獻［42］，在水生態(tài)系統(tǒng)的有機磷礦化過程中起著重要作用.

2 細菌堿性磷酸酶及其編碼基因

2.1 細菌堿性磷酸酶的種類

細菌堿性磷酸酶的種類多樣，根據堿性磷酸酶蛋白序列的相似度和底物的不同，可主要分為3種類型：

PhoA、PhoX和PhoD［13］.

PhoA是研究最早的一種磷酸單脂酶，最初發(fā)現可由大腸桿菌（Escherichia coli）表達合成.PhoA是一種二聚體蛋白，其活性部位有用于磷酸催化的2個Zn2＋和1個Mg2＋組成的輔基團.這種堿性磷酸酶蛋白可通過細菌胞膜上的‘Sec’蛋白通道分泌到胞外或細胞周質中［43］.

堿性磷酸酶PhoX和PhoD是近年來的研究熱點，其編碼基因最早分別發(fā)現于霍亂弧菌（Vibrio cholerae）［44］和枯草桿菌（Bucillus subtilis）的基因組［45］.與堿性磷酸酶PhoA不同的是，這2種堿性磷酸酶均為單體蛋白，且堿性磷酸酶PhoX的活性部位有2個Fe3＋與3個Ca2＋作為輔基［46］，2種磷酸酶的分泌通道均是雙精氨酸（Twin arginine）蛋白通道［47-49］.同時，PhoX和PhoD的底物不僅有磷酸單脂類，還包括磷酸二脂類化合物.因此，這2種酶既是磷酸單脂酶，也是磷酸二脂酶［13］.

研究表明，3種細菌堿性磷酸酶功能區(qū)域的蛋白序列相似性較低（圖1），同種堿性磷酸酶的蛋白序列之間也有一定分異［50］.目前，普遍認為在海洋和土壤生態(tài)系統(tǒng)中，堿性磷酸酶PhoD基因序列的多樣性和豐度要高于其他2種酶的基因序列［13，20，50］.

除以上3種主要的細菌堿性磷酸酶，細菌還可能合成多種其他堿性磷酸酶，如PhoZ［51］、PhoV［52］等，不過目前仍缺乏針對這些潛在基因的表達與蛋白功能鑒定的研究.

圖1 堿性磷酸酶PhoA、PhoX和PhoD的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹［50］Fig.1 The maximum likelihood phylogenetic tree of alkaline phosphatases PhoA，PhoX and PhoD［50］

2.2 細菌堿性磷酸酶的亞細胞分布與功能途徑

細菌堿性磷酸酶的亞細胞分布特征對于認識細菌堿性磷酸酶的功能有重要意義，通過生物信息學手段可有效推算堿性磷酸酶蛋白的亞細胞分布.最初，針對革蘭氏陰性細菌的研究認為，堿性磷酸酶只分布于細胞周質（Periplasmic）［53-55］.隨后的研究發(fā)現，細菌堿性磷酸酶還分布于細胞表面與胞外環(huán)境中［56-57］.Luo等［13］通過對全球海洋調查（Global Ocean Sampling，GOS）基因組數據庫中細菌堿性磷酸酶編碼基因序列的

生物信息學推算發(fā)現（圖2），在3733個細菌堿性磷酸酶基因序列中，有1518個（40.7%）序列來自于細胞質內，641個（17.7%）來自于細胞周質，1100個（29.5%）來自于胞外環(huán)境，439個（11.8%）來自于細胞外膜，還有35個（11.8%）來自于細胞內膜.有超過70%的細菌堿性磷酸酶分布于細胞內部.對于3種主要的堿性磷酸酶，超過40%的PhoD和PhoA均分布于細胞質內，超過50%的PhoX序列則分布于細胞外部環(huán)境.細菌堿性磷酸酶的這些亞細胞分布特征可能暗示PhoA、PhoX和PhoD有著不同的有機磷礦化途徑.

圖2 基于GOS細菌基因組數據庫推算的細菌堿性磷酸酶的亞細胞分布（改自文獻［13］）Fig.2 Subcellular localization distributions of alkaline phosphatases recovered from the GOS metagenomic database（modified from reference［13］）

根據Luo等［13］的研究，White［15］將細菌堿性磷酸酶利用溶解態(tài)有機磷的途徑歸納為3種（圖3）：（1）小分子磷脂類有機磷經細胞周質內的磷脂運輸系統(tǒng)（uptake of glycerol phosphate system，ugp）傳輸至細胞質內，由分布于細胞質內的堿性磷酸酶（主要是PhoA和PhoD）分解；（2）進入細胞周質的小分子有機磷脂類化合物由間質內的堿性磷酸酶分解；（3）細菌產生胞外堿性磷酸酶（主要是PhoX）利用胞外環(huán)境中的有機磷，產生的部分無機態(tài)正磷酸鹽再由細菌吸收利用.其中，第一種途徑對于細菌吸收磷營養(yǎng)可能最為重要.

2.3 堿性磷酸酶的編碼基因及功能細菌研究

生態(tài)學中，常將調控生物地球化學循環(huán)的某些關鍵酶的表達基因作為標記物，采用分子生物學的手段，研究具有這些功能基因的微生物的多樣性、群落結構、豐度以及相應的功能表達.例如，氨單加氧酶編碼基因（amoA）作為分子標記物，被廣泛用于研究環(huán)境中的氨氧化細菌和古菌群落［58-59］.同樣，將堿性磷酸酶編碼基因作為標記物也為更好地認識堿性磷酸酶功能細菌及其功能特性提供了便利［13-14］.

Sakuari等［60］首次采用變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），研究有機和化學肥料影響下土壤中堿性磷酸酶編碼基因的多樣性，并發(fā)現與洛蒂根瘤菌（Mesorbizobium loti）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的堿性磷酸酶編碼基因相似度較高的基因序列.Sebastian等［14］通過聚合酶鏈式反應（ploymerase chain reaction，PCR）與基因克隆方法，結合分析全球海洋調查基因組數據庫發(fā)現，寡營養(yǎng)海洋水體中堿性磷酸酶PhoX編碼基因phoX在細菌基因組中分布的廣泛性要明顯高于堿性磷酸酶PhoA，堿性磷酸酶編碼基因phoX普遍分布于不同門類的細菌中，主要包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和藍細菌門（Cyanobacteria）等（圖4）.但Luo等［13］運用生物信息學手段對全球海洋調查基因組數據庫中phoA、phoX、phoD共3733條堿性磷酸酶基因的研究卻發(fā)現，3種堿性磷酸酶編碼基因均分布于不同門類的細菌中，其中以變形菌門占多數，phoA基因在擬桿菌門和綠菌門（Chloroflexi）中的比例要高于其他2類基因，而phoX基因在藍細菌門中的比例也要高于phoA和phoD基因.

目前，采用phoX基因研究堿性磷酸酶PhoX及其功能細菌的研究較多.Zaheer等［61］通過對GenBank中

的phoX基因對應的蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，phoX基因的蛋白序列可分為2種類型（PhoX-I和PhoXII），其中PhoX-I類型主要包括部分α變形菌門（α-proteobacteria）和γ變形菌門（γ-proteobacteria）.Zaheer等［61］還證實同種細菌的phoX基因在基因組中存在水平遷移現象，例如，洛蒂根瘤菌MAFF303099（Mesorbizobium loti strain MAFF303099）基因組中就有2種不同的phoX基因.還有不少學者也發(fā)現了一些藍細菌攜有新的phoX基因［18-19，22，62-63］，并借此研究phoX基因的表達與影響因素.

圖3 海洋細菌利用溶解性有機磷（DOP）的3種主要途徑（改自文獻［15］）Fig.3 Three predominant pathways of using dissolved organophosphate（DOP）by marine bacteria（modified from reference［15］）

對海洋和土壤生態(tài)系統(tǒng)的細菌基因組數據庫的研究表明，堿性磷酸酶編碼基因phoD的豐度要高于phoA和phoX基因［13，20，50］.近年來，細菌phoD基因也開始成為學者研究的熱點.Kageyama等［64］從嗜鹽隱桿藻（Aphanothece halophytica）的基因組中成功克隆了一種phoD基因，并發(fā)現這種phoD基因的表達受鹽度脅迫的影響要高于磷營養(yǎng)的限制.Luo等［20］對北太平洋亞熱帶環(huán)流的基因組數據庫分析發(fā)現，透光層和深海水體中phoD基因的豐度要明顯高于phoA基因.也有不少學者通過設計phoD基因探針，從土壤中獲取phoD基因的信息，并以此研究施肥等因素對細菌堿性磷酸酶編碼基因及其細菌的影響［50，60，65］.隨著學者對藍藻水華問題的關注，一些研究也發(fā)現了水華優(yōu)勢藍細菌種中phoD基因的存在，最典型的就是魚腥藻（Anabaena sp.）［66］.

研究表明，部分產堿性磷酸酶細菌的基因組中可能有兩種甚至多種堿性磷酸酶編碼基因.例如，海洋細菌物種unidentified Eubacterium SCB49和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的基因組中就同時含有phoA和phoX兩種基因［14］，而Mesorbizobium loti strain MAFF303099的基因組中有2種不同的phoX基因［61］.相反，基因組中僅有1個堿性磷酸酶編碼基因的細菌物種常用作研究基因表達與影響因素的模式生物，如玫瑰桿菌（Silicibacter pomeroyi）和魯杰氏菌（Ruegeria pomeroyi）2種細菌，其基因組中只有1種phoX功能基因［14，21］.

2.4 堿性磷酸酶編碼基因表達的環(huán)境因素

2.4.1 正磷酸鹽濃度 作為細菌可直接吸收利用的磷源和堿性磷酸酶的酶促產物，正磷酸鹽濃度的高低會影響堿性磷酸酶編碼基因的表達.Wanner［43］總結正磷酸鹽濃度對大腸桿菌phoA基因表達影響的機理.當大腸桿菌處于磷限制狀態(tài)時，其會進行甘油磷酸鹽吸收基因和堿性磷酸酶PhoA基因的表達，同時也會開啟一種

高親和性磷酸鹽傳輸蛋白的編碼基因pst的表達，直接吸收環(huán)境中低濃度的正磷酸鹽，或者將環(huán)境中的有機磷吸收至細胞內由PhoA酶解，部分有機磷甚至可直接用于合成細胞膜磷脂分子.在磷酸鹽過剩時，大腸桿菌只需合成一種低親和性磷酸鹽傳輸蛋白Pit，直接吸收環(huán)境中的磷酸鹽.

圖4 海洋細菌phoX基因對應磷酸酶蛋白的最大似然進化樹（改自文獻［14］）Fig.4 The maximum likelihood phylogenetic tree for putative PhoX protein of marine bacterial phoX（modified from reference［14］）

Sebastian等［14，21］通過對3種細菌，玫瑰桿菌、反硝化玫瑰桿菌（Roseobacter denitrificans）和Ruegeria pomeroyi基因組中phoX基因表達的研究發(fā)現，這3種細菌的堿性磷酸酶PhoX基因的表達對磷限制有明顯的響應，過剩的正磷酸鹽會顯著抑制phoX基因的表達.同樣苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的phoX基因表達對正磷酸鹽濃度的響應也是如此［61］.此外，還有不少學者關注藍細菌的堿性磷酸酶編碼基因對正磷酸鹽濃度的響應，其結論都表明正磷酸鹽的濃度是細菌堿性磷酸酶編碼基因表達的調控因素［18，62-63，66-70］.

2.4.2 有機磷類型 作為堿性磷酸酶的底物，不同種細菌的堿性磷酸酶編碼基因的表達對不同類型有機磷的響應有所不同.Wu等［48］在巴氏桿菌Pasteurella multocida strain X-73的基因組中克隆出了一種phoX基因，其表達的堿性磷酸酶可分解不同類型的有機磷底物，其中親和性最好的有機磷底物是焦磷酸鈉和三磷酸腺苷.Sebastian等［21］發(fā)現不同類型的有機磷底物對Ruegeria pomeroyi DSS-3的phoX基因的表達抑制程度不同，親和性越好的有機磷底物越能抑制phoX基因的表達，如葡萄糖六磷酸和腺苷酸，這與親和性好的有機磷在堿性磷酸酶催化下分解效率高有關.而Harke等［63］的研究則表明，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）phoX基因的表達會受到高濃度有機磷的抑制，但不同類型有機磷對其表達的抑制效果沒有顯著差異，而且這種現象普遍存在于銅綠微囊藻不同的菌株中.

2.4.3 金屬離子 金屬離子對堿性磷酸酶基因表達的影響與金屬離子的種類、濃度和堿性磷酸酶基因的類型都有關.由于Zn2＋與Mg2＋是堿性磷酸酶PhoA的輔基，一定濃度的Zn2＋與Mg2＋的存在會促進細菌phoA基因的表達.Luo等［68］通過對魚腥藻Anabaena sp.PCC7120 phoA基因表達的研究發(fā)現，1 mmol／L的Mg2＋和Co2＋可使PhoA的活性分別增強1.6和1.4倍，但同樣濃度的Zn2＋對PhoA的活性卻有一定程度的抑制，這可能與phoA基因的表達對Zn2＋濃度的需求較低有關.考慮到在添加乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）螯合所有游離態(tài)金屬離子后，堿性磷酸酶PhoA的活性已無法檢測，可以認為金屬離子是堿性磷酸酶編碼基因表達的重要條件，其種類和濃度是影響堿性磷酸酶編碼基因phoA表達的重要因素.

對于堿性磷酸酶PhoX而言，其基因的表達受金屬離子的影響又有所不同.Wu等［48］的研究發(fā)現，在向處于磷饑餓狀態(tài)的巴氏桿菌Pasteurella multocida strain X-73培養(yǎng)基中加入EDTA螯合金屬離子后，細菌堿性磷酸酶PhoX的活性被明顯抑制.但分別加入一定濃度的不同二價金屬離子后，Ca2＋和Co2＋能重新促進phoX基因的表達，而同樣濃度的Zn2＋和Mg2＋對PhoX活性恢復的影響有限［48］.Zaheer等［61］對根瘤菌Sinorhizobium meliloti中phoX基因表達的研究也證實Ca2＋較其他二價金屬離子能更好地促進PhoX的活性.

與堿性磷酸酶PhoX相似，Ca2＋也是堿性磷酸酶PhoD的輔基，而Ca2＋同樣能很好地激發(fā)PhoD的活性［64］.此外，還有一些學者也發(fā)現Fe2＋和Na＋等金屬離子均能對細菌堿性磷酸酶編碼基因的表達產生影響［14，69］.

2.4.4 pH 酸堿度是細菌堿性磷酸酶活性的重要影響因子.Luo等［68］發(fā)現魚腥藻Anabaena sp.PCC7120的phoA基因表達的最適pH值在10.5～11.5，pH值超過12.0后，已檢測不出PhoA活性.Zaheer等［61］研究也證實根瘤菌Sinorhizobium meliloti的PhoX蛋白的最適pH值范圍也在10～11之間.還有一些研究也將此pH值范圍作為研究堿性磷酸酶編碼基因表達的背景條件［18，62，66，68，71］.

2.4.5 鹽度 細菌堿性磷酸酶編碼基因的表達不僅受磷、金屬離子、酸堿度等的影響，鹽度可能也是重要的影響因子之一.Ishibashi等［71］在喜鹽菌Halomonas sp.593的基因組中克隆了一種堿性磷酸酶編碼基因（haalp），其表達的堿性磷酸酶在低于0.3 mol／L Na＋濃度的鹽度環(huán)境中沒有活性.同樣，Kageyama等［64］發(fā)現耐鹽藍細菌Aphanothece halophytica的phoD基因的表達不僅受磷限制，也受鹽度的脅迫.

2.4.6 其他環(huán)境因素 此外，溫度，碳、氮源等因素對純種細菌堿性磷酸酶編碼基因的表達也均有不同程度的影響［14，63，68］.

3 產堿性磷酸酶細菌種群的研究方法

解磷細菌是指能夠利用環(huán)境中非生物可直接利用磷的功能細菌，包括無機磷分解細菌和有機磷分解細菌.從解磷功能上看，產堿性磷酸酶細菌屬于有機磷分解細菌的范疇.迄今為止，已有大量關于海洋［72-73］、土壤［74-78］和淡水生態(tài)系統(tǒng)［79-83］中有機磷分解細菌的研究，其中就包括產堿性磷酸酶細菌，這些研究采用的方法主要分為傳統(tǒng)的功能鑒定法和功能基因分子標記法.

3.1 傳統(tǒng)的功能鑒定法

傳統(tǒng)的功能鑒定法主要是篩選環(huán)境中具有某種功能的微生物，包括樣品的采集、選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和篩選，平板培養(yǎng)、活菌計數，最大可能計數法，純培養(yǎng)細菌的特定功能與生理生化特征鑒定，16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析等.這些方法以功能選擇性培養(yǎng)基為基礎，輔以系統(tǒng)發(fā)育分析和培養(yǎng)基計數手段，研究環(huán)境中具有某種功能的微生物的數量、多樣性、功能活性以及生理生化特征，是經典的微生物生態(tài)學研究手段.

目前，國內外有不少學者通過傳統(tǒng)的功能鑒定法來研究生態(tài)系統(tǒng)中的產堿性磷酸酶細菌.Barik等［84］利用酚酞磷酸鹽瓊脂（PPA）培養(yǎng)基對淡水養(yǎng)魚塘中的產堿性磷酸酶細菌進行分離培養(yǎng)，并通過產堿性磷酸酶細菌菌落的形態(tài)、顏色、革蘭氏染色反應、過氧化氫酶反應等對其進行種屬鑒定，發(fā)現芽孢桿菌是主要的產堿性磷酸酶細菌.Ba?eras等［85］采用無磷礦物培養(yǎng)基（MM-P），從西班牙的2個富硫湖泊中分離了四株產堿性磷酸酶的光合硫細菌，并研究了不同濃度的溶解性反應磷對其堿性磷酸酶活性的影響.Zhou等［82］利用有機磷培養(yǎng)基分離了6株有機磷分解細菌，通過16S rDNA基因測序，對6株細菌的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了分析，并結合平板計數法和堿性磷酸酶活性，研究了這6株堿性產堿性磷酸酶細菌在太湖沉積物中的豐度及其與堿性磷酸酶活性的關系.周純等［83］還利用傳統(tǒng)方法分離的產堿性磷酸酶細菌，研究了其堿性磷酸酶活性對藍藻碎屑的響應.

以上利用傳統(tǒng)的功能鑒定法將細菌選擇性分離培養(yǎng)與堿性磷酸磷酸酶活性結合，有助于人們認識環(huán)境中堿性磷酸酶功能細菌的種類與功能特性.然而，這種傳統(tǒng)的方法在很大程度上受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間和菌株分離方法等的影響.加之自然環(huán)境中僅有0.001%～3%的微生物可以被分離培養(yǎng)［86］，而且多數微生物也缺乏可用于鑒定的形態(tài)特征.因此，這種傳統(tǒng)的功能鑒定法無法準確、全面地獲取自然環(huán)境中堿性磷酸酶功能細菌的多樣性和生態(tài)功能等信息，更無法了解環(huán)境因子是如何影響生境中產堿性磷酸酶細菌的群落結構和功能活性.

3.2 功能基因分子標記法

隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，利用功能酶的表達基因作為分子標記物研究功能微生物的多樣性、群落結構和功能活性已經在生態(tài)學中得到了廣泛的應用.最初，功能基因分子標記法是建立在細菌純培養(yǎng)的基礎上，通過分子克隆手段將具有某種功能的細菌基因組中的某種功能基因克隆，再利用基因重組和表達，進而驗證功能基因的表達與所表達的功能酶的活性特性［43-44，48，64，71］.這種途徑也是研究純種產堿性磷酸酶細菌及其編碼基因的最常用手段.從1980s起，就有不少研究關注細菌堿性磷酸酶編碼基因phoA的功能表達機制［43，93-94］，大腸桿菌是最典型的研究對象.隨后，又有研究發(fā)現了其他純種細菌基因組中的堿性磷酸酶編碼基因，最重要的如枯草桿菌（Bucillus subtilis）的phoD基因［45］以及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的phoX基因［44］，這些研究的發(fā)現為不斷認識細菌堿性堿性磷酸酶及其編碼基因提供了新的思路.同時，由于自然環(huán)境中細菌堿性磷酸酶的種類多，目前的研究可能還沒有全面認識到細菌堿性磷酸酶及其編碼基因，以純培養(yǎng)細菌為基礎的功能基因分子標記法還可能為我們發(fā)現更多新穎的堿性磷酸酶基因，完善細菌利用有機磷的機理研究，因此這種方法方興未艾.

Sakurai等［60］首次針對部分堿性磷酸酶編碼基因設計了寡核苷酸探針，利用PCR-DGGE指紋圖譜的手段研究了施肥土壤中堿性磷酸酶編碼基因的多樣性與系統(tǒng)發(fā)育關系，證明了堿性磷酸酶編碼基因可以作為分子標記物研究環(huán)境中多樣的產堿性磷酸酶細菌.Sebastian等［14］也根據細菌堿性磷酸酶編碼基因phoX的序列，設計了兼并性核苷酸引物，同樣從寡營養(yǎng)的海洋中直接擴增出了phoX基因，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現這些基因與不同門類的純種細菌phoX基因具有相似性.而后，Chhabra等［65］也利用Sakurai等［60］設計的引物研究了大麥根系堿性磷酸酶功能細菌的群落結構.鑒于堿性磷酸酶編碼基因phoD基因在土壤生態(tài)系統(tǒng)中可能占有較大的比例，Tan等［50］設計了針對土壤phoD基因的寡核苷酸探針，利用DGGE和高通量測序的手段，研究了施肥對于土壤堿性磷酸酶功能細菌的群落結構和多樣性的影響.在湖泊細菌堿性磷酸酶基因型多樣性方面，Dai等［95-96］借助上述phoX基因序列引物研究了太湖水體細菌堿性磷酸酶編碼基因phoX的基因型及其相關的環(huán)境因素，首次發(fā)現了太湖水生態(tài)系統(tǒng)中豐富而新穎的細菌堿性磷酸酶基因，從生物學角度證明了細菌堿性磷酸酶在太湖有機磷礦化過程中的重要作用.同樣，Valdespino-Castillo等［97］也通過細菌堿性磷酸酶編碼基因引物研究了墨西哥Alchichica湖的產堿性磷酸酶細菌種群.這些研究通過設計堿性磷酸酶編碼基因的寡核苷酸探針，為全面研究環(huán)境中堿性磷酸酶功能細菌提供了新的途徑.

堿性磷酸酶的編碼基因多樣，環(huán)境細菌的堿性磷酸酶編碼基因序列間的保守性通常又較差，因此很難設計通用的針對所有細菌堿性磷酸酶編碼基因的寡核苷酸探針，也就無法準確、全面地認識環(huán)境中的產堿性磷酸酶細菌及其功能.與DNA指紋圖譜技術相比，分析已有的細菌宏基因組和宏轉錄組數據庫能夠更為全面的認識環(huán)境中的堿性磷酸酶及其編碼基因.

近年來，隨著環(huán)境宏基因組學研究的深入，人們已經積累了一些生態(tài)系統(tǒng)中的宏基因組和宏轉錄組數據庫，例如全球海洋調查基因組數據庫（Global Ocean Sampling，GOS）［13-14，98］、美國國家生物信息中心數據庫中non-redundant蛋白數據庫以及寡營養(yǎng)海洋（North Pacific Subtropical Gyre，NPSG）宏基因組和宏轉錄組數據庫［99］.學者們借助這些數據庫，通過生物信息學分析手段，研究了海洋和土壤生態(tài)系統(tǒng)中堿性磷酸酶的種類，堿性磷酸酶編碼基因的多樣性、相對比例、系統(tǒng)發(fā)育關系、功能表達以及與環(huán)境因素之間的關聯.Sebastian與Ammerman［14］通過對NPSG宏基因組數據庫和GOS宏基因組數據庫的研究發(fā)現，海洋細菌堿性磷酸編碼基因phoX的豐度要顯著高于phoA基因，而且phoX在細菌不同門類中的分布要比phoA更為廣泛.同時，通過對海岸帶宏轉錄組數據庫［98］研究推測，在富營養(yǎng)化的水體中堿性磷酸酶PhoA較PhoX分布更廣.隨后，Luo等［13，20］通過對全球海洋調查的基因組數據研究更為清晰地認識了海洋中3種堿性磷酸酶的相對比例、亞細胞分布和系統(tǒng)發(fā)育關系.這些研究都為全面認識不同環(huán)境中產堿性磷酸酶細菌提供了新的途徑.

4 研究展望

在寡營養(yǎng)的海洋生態(tài)系統(tǒng)中，處于“磷饑餓”狀態(tài)的細菌通過堿性磷酸酶利用水體中的有機磷，維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的生產力和物質循環(huán).因此，堿性磷酸酶及其功能細菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中得到了廣泛的關注.現有的研究通過海洋宏基因組數據庫，對海洋生態(tài)系統(tǒng)中細菌堿性磷酸酶及其編碼基因開展深入研究，從微生物學角度闡釋了海洋生態(tài)系統(tǒng)有機磷礦化與循環(huán)的機制.實際上，湖泊生態(tài)系統(tǒng)中也普遍存在磷限制，細菌堿性磷酸酶在湖泊有機磷礦化中的作用已經得到了證實［26，42，80］.然而，目前對于湖泊生態(tài)系統(tǒng)中堿性磷酸酶功能細菌的研究方法還主要依靠傳統(tǒng)的功能鑒定法，加之缺乏針對淡水生態(tài)系統(tǒng)細菌的宏基因組數據庫，使得人們對于湖泊生態(tài)系統(tǒng)中產堿性磷酸酶細菌及其編碼基因的認識遠滯后于海洋生態(tài)系統(tǒng).因此，急需構建針對典型湖泊生態(tài)系統(tǒng)的細菌宏基因組數據庫，運用生物信息學技術，分析湖泊生態(tài)系統(tǒng)中細菌堿性磷酸酶的種類及其對應的功能細菌特征，不僅可對比富營養(yǎng)化淡水與寡營養(yǎng)海洋生態(tài)系統(tǒng)細菌堿性磷酸酶的差異，還可為深入研究淡水生態(tài)系統(tǒng)細菌堿性磷酸酶及編碼基因奠定基礎.

目前，也有零星的關于湖泊生態(tài)系統(tǒng)中細菌堿性磷酸酶編碼基因的研究報道［63，95-97］，但還是缺乏全面認識湖泊生態(tài)系統(tǒng)中產堿性磷酸酶細菌的多樣性、豐度及與主要環(huán)境因子間關系的研究.對于一些關鍵的科學問題，如湖泊生態(tài)系統(tǒng)中有哪些主要的產堿性磷酸酶細菌與編碼基因？其與海洋和土壤生態(tài)系統(tǒng)中堿性磷酸酶編碼基因的理論有何異同？影響湖泊中產堿性磷酸酶細菌及其編碼基因分布的主導環(huán)境因素又有哪些？同時，在我國長江中下游地區(qū)，絕大多數的湖泊為淺水湖泊，而這些淺水湖泊大多面臨富營養(yǎng)化問題［100］.藍藻水華頻發(fā)是富營養(yǎng)化淺水湖泊所面臨的最嚴重的生態(tài)問題.產堿性磷酸酶細菌與藍藻水華的頻繁爆發(fā)之間是否有聯系？有著何種聯系？對上述問題的解答是揭示富營養(yǎng)化淺水湖泊中產堿性磷酸酶細菌及其編碼基因的分布、生態(tài)功能以及與湖泊環(huán)境因素之間關系的關鍵所在，目前，在富營養(yǎng)化湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，此類問題的研究還相對缺乏.

［1］ Mills MM，Ridame C，Davey M et al.Iron and phosphorus co-limit nitrogen fixation in the eastern tropical North Atlantic. Nature，2004，429（6989）：292-294.

［2］ Thingstad T，Krom M，Mantoura R et al.Nature of phosphorus limitation in the ultraoligotrophic eastern Mediterranean. Science，2005，309（5737）：1068-1071.

［3］ Krom M，Thingstad T，Brenner S et al.Summary and overview of the CYCLOPS P addition Lagrangian experiment in the Eastern Mediterranean.Deep Sea Research Part II：Topical Studies in Oceanography，2005，52（22）：3090-3108.

［4］ Pulido-Villena E，Rérolle V，Guieu C.Transient fertilizing effect of dust in P-deficient LNLC surface ocean.Geophysical Research Letters，2010，37（1）：L01603.

［5］ Giovannoni SJ，Tripp HJ，Givan S et al.Genome streamlining in a cosmopolitan oceanic bacterium.Science，2005，309（5738）：1242-1245.

［6］ Van Mooy BA，Rocap G，Fredricks HF et al.Sulfolipids dramatically decrease phosphorus demand by picocyanobacteria in oligotrophic marine environments.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103（23）：8607-8612.

［7］ Polz MF，Hunt DE，Preheim SP et al.Patterns and mechanisms of genetic and phenotypic differentiation in marine microbes.Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences，2006，361（1475）：2009-2021.

［8］ Ammerman JW.Role of ecto-phosphohydrolases in phosphorus regeneration in estuarine and coastal ecosystems.In：Chróst RJ，ed.Microbial Enzymes in Aquatic Environments.New York：Springer，1991：165-186.

［9］ Siuda W，Chrost R.Utilization of selected dissolved organic phosphorus compounds by bacteria in lake water under nonlimiting orthophosphate conditions.Polish Journal of Environmental Studies，2001，10（6）：475-484.

［10］ Shan Y，Mckelvie ID，Hart BT.Determination of alkaline phosphatase-hydrolyzable phosphorus in natural water systems by enzymatic flow injection.Limnology and Oceanography，1994，39（8）：1993-2000.

［11］ Michaels AF，Silver MW.Primary production，sinking fluxes and the microbial food web.Deep Sea Research Part A.Oceanographic Research Papers，1988，35（4）：473-490.

［12］ Chróst RJ，Overbeck J.Kinetics of alkaline phosphatase activity and phosphorus availability for phytoplankton and bacterioplankton in lake plu?see（North German Eutrophic Lake）.Microbial Ecology，1987，13（3）：229-248.

［13］ Luo H，Benner R，Long R et al.Subcellular localization of marine bacterial alkaline phosphatases.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（50）：212-219.

［14］ Sebastian M，Ammerman J.The alkaline phosphatase PhoX is more widely distributed in marine bacteria than the classical PhoA.The ISME Journal，2009，3（5）：563-572.

［15］ White A.New insights into bacterial acquisition of phosphorus in the surface ocean.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（50）：210-213.

［16］ Duhamel S，Dyhrman ST，Karla DM.Alkaline phosphatase activity and regulation in the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography，2010，55（3）：1414-1425.

［17］ Ivancic I，Fuks D，Radic T et al.Phytoplankton and bacterial alkaline phosphatase activity in the northern Adriatic Sea. Marine Environmental Research，2010，69（2）：85-94.

［18］ Kathuria S，Martiny AC.Prevalence of a calcium-based alkaline phosphatase associated with the marine cyanobacterium Prochlorococcus and other ocean bacteria.Environmental Microbiology，2011，13（1）：74-83.

［19］ Luo C，Konstantinidis KT.Phosphorus-related gene content is similar in Prochlorococcus populations from the North Pacific and North Atlantic Oceans.Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108（16）：64-66.

［20］ Luo H，Zhang H，Long RA et al.Depth distributions of alkaline phosphatase and phosphonate utilization genes in the North Pacific Subtropical Gyre.Aquatic Microbial Ecology，2011，62（1）：61-69.

［21］ Sebastian M，Ammerman J.Role of the phosphatase PhoX in the phosphorus metabolism of the marine bacterium Ruegeria pomeroyi DSS-3.Environmental Microbiology Reports，2011，3（5）：535-542.

［22］ Kutovaya OA.Using molecular probes to detect cyanobacterial communities and phosphorus utilization in the Great Lakes. Ohio：Bowling Green State University，2012.

［23］ Zhou Yiyong，Li Jianjiu，Zhang Min et al.Distribution of kinetic parameters of alkaline phosphatase in sediments of shallow lakes.J Lake Sci，2001，13（3）：261-266（in Chinese with English abstract）.DOI：10.18307／20010310.［周易勇，李建秋，張敏等.淺水湖泊中沉積物堿性磷酸酶動力學參數的分布.湖泊科學，2001，13（3）：261-266.］

［24］ Gao Guang，Qin Boqiang，Zhu Guangwei et al.Seasonal variation of alkaline phosphatase activity in Meiliang Bay，Lake Taihu.J Lake Sci，2004，16（3）：245-251（in Chinese with English abstract）.DOI：10.18307／2004.0309.［高光，秦伯強，朱廣偉等.太湖梅梁灣中堿性磷酸酶的活性及其與藻類生長的關系.湖泊科學，2004，16（3）：245-251.］

［25］ Gao G，Zhu G，Qin B et al.Alkaline phosphatase activity and the phosphorus mineralization rate of Lake Taihu.Science in China Series D：Earth Sciences，2006，49（I）：176-185.

［26］ Song C，Cao X，Li J et al.Contributions of phosphatase and microbial activity to internal phosphorus loading and their relation to lake eutrophication.Science in China Series D：Earth Sciences，2006，49（I）：102-113.

［27］ Xia Zhuoying，Chen Fang，Song Chunlei et al.A study on distribution and roles of alkaline phosphatase in sediments of some lakes in the middle and lower reaches of the Yantze River.Acta Hydrobiologia Sinica，2007，31（1）：9-17（in Chinese with English abstract）.［夏卓英，陳芳，宋春雷等.長江中下游部分湖泊沉積物堿性磷酸酶分布及其作用研究.水生生物學報，2007，31（1）：9-17.］

［28］ Zhou Y，Song C，Cao X et al.Phosphorus fractions and alkaline phosphatase activity in sediments of a large eutrophic Chinese lake（Lake Taihu）.Hydrobiologia，2008，599（1）：119-125.

［29］ Deng JJ，Huang XF，Hu JW et al.Distribution of several microorganisms and activity of alkaline phosphatase in sediments from Baihua Lake.Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering，2009，4（5）：711-716.

［30］ Lu Na，Hu Weiping，Deng Jiancaiet al.Spatial distribution characteristics and ecological significance of alkaline phosphatase in water column of Taihu Lake.Environmental Science，2009，30（10）：2897-2903（in Chinese with English abstract）.［路娜，胡維平，鄧建才等.太湖水體中堿性磷酸酶的空間分布及生態(tài)意義.環(huán)境科學，2009，30（10）：2897-2903.］

［31］ Manna S，Som A，Samanta S.Water alkaline phosphatase activity andphosphorus availability during summer ininland water bodies.Indian Journal of Fisheries，2011，53（2）：167-173.

［32］ Mamatha S，Gobika A，Janani P.Phosphate solubilizing bacteria and alkaline phosphatase activity in coastal waters off Trivandrum.Journal of Costal Environment，2012，3（1）：89-100.

［33］ Xia ZY，Zhou YY，Chen F et al.Stratification of alkaline phosphatase in sediments of two urban lakes and its effect on phosphorus cycle.Acta Ecologica Sinica，2012，32（3）：138-143.

［34］ Zhao G，Du J，Jia Y et al.The importance of bacteria in promoting algal growth in eutrophic lakes with limited available phosphorus.Ecological Engineering，2012，42：107-111.

［35］ Wang Sumin，Dou Hongshen.Chinese Lakes.Beijing：Science Press，1998（in Chinese）.［王蘇民，竇鴻身.中國湖泊志.北京：科學出版社，1998.］

［36］ Zhou Yiyong，Fu Yongqing.Phosphatases in natural water：origin，characteristics and ecological significance.J Lake Sci，1999，11（3）：274-282（in Chinese with English abstract）.DOI：10.18307／1999.0313.［周易勇，付永清.水體磷酸酶：來源，特征及其生態(tài)學意義.湖泊科學，1999，11（3）：274-282.］

［37］ Song Chunlei.The role of dissolved phosphatase and microbial activity in the process of lake eutrophication.Wuhan：Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，2005（in Chinese）.［宋春雷.溶解態(tài)磷酸酶與微生物活性在湖泊富營養(yǎng)化過程中的作用.武漢：中國科學院水生生物研究所，2005.］

［38］ Xu J.Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics：concepts，tools，and recent advances.Molecular Ecology，2006，15（7）：1713-1731.

［39］ Li H，Veldhuis MJ，Post AF.Alkaline phosphatase activities among planktonic communities in the northern Red Sea.Marine Ecology Progress Series，1998，173：107-115.

［40］ Chróst RJ.Environmental control of the synthesis and activity of aquatic microbial ectoenzymes.In：Chróst RJ ed.Microbial Enzymes in Aquatic Environments.New York：Springer，1991：29-59.

［41］ Zaccone R，Caruso G，Cali C.Heterotrophic bacteria in the northern Adriatic Sea：seasonal changes and ectoenzyme profile.Marine Environmental Research，2002，54（1）：1-19.

［42］ Labry C，Delmas D，Herbland A.Phytoplankton and bacterial alkaline phosphatase activities in relation to phosphate and DOP availability within the Gironde plume waters（Bay of Biscay）.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2005，318（2）：213-225.

［43］ Wanner B.Gene regulation by phosphate in enteric bacteria.Journal of Cellular Biochemistry，2004，51（1）：47-54.

［44］ Majumdar A，Ghatak A，Ghosh RK.Identification of the gene for the monomeric alkaline phosphatase of Vibrio cholerae serogroup O1 strain.Gene，2005，344：251-258.

［45］ Eder S，Shi L，Jensen K et al.A Bacillus subtilis secreted phosphodiesterase／alkaline phosphatase is the product of a Pho regulon gene，phoD.Microbiology，1996，142（8）：2041-2047.

［46］ Yong SC，Roversi P，Lillington Jet al.A complex iron-calcium cofactor catalyzing phosphotransfer chemistry.Science，2014，345（6201）：1170-1173.

［47］ Monds RD，Newell PD，Gross RH et al.Phosphate-dependent modulation of c-di-GMP levels regulates Pseudomonas fluorescens Pf0-1 biofilm formation by controlling secretion of the adhesin LapA.Molecular Microbiology，2007，63（3）：656-679.

［48］ Wu JR，Shien JH，Shien HK et al.Cloning of the gene and characterization of the enzymatic properties of the monomeric alkaline phosphatase（PhoX）from Pasteurella multocida strain X-73.FEMS Microbiology Letters，2007，267（1）：113-120.

［49］ Van Mourik A，Bleumink-Pluym NM，Van Dijk L et al.Functional analysis of a Campylobacter jejuni alkaline phosphatase secreted via the Tat export machinery.Microbiology，2008，154（2）：584-592.

［50］ Tan H，Barret M，Mooij MJ et al.Long-term phosphorus fertilisation increased the diversity of the total bacterial community and the phoD phosphorus mineraliser group in pasture soils.Biology and Fertility of Soils，2012，49（6）：661-672.

［51］ Chaffin DO，Rubens CE.Blue／white screening of recombinant plasmids in Gram-positive bacteria by interruption of alkaline phosphatase gene（phoZ）expression.Gene，1998，219（1／2）：91-99.

［52］ Wagner KU，Masepohl B，Pistorius EK.The cyanobacterium Synechococcus sp.strain PCC 7942 contains a second alkaline phosphatase encoded by phoV.Microbiology，1995，141（12）：3049-3058.

［53］ Thompson LM，Macleod RA.Biochemical localization of alkaline phosphatase in the cell wall of a marine pseudomonad. Journal of Bacteriology，1974，117（2）：819-825.

［54］ Doonan B，Jensen T.Ultrastructural localization of alkaline phosphatase in the blue-green bacterium Plectonema boryanum. Journal of Bacteriology，1977，132（3）：967-973.

［55］ Hassan H，Pratt D.Biochemical and physiological properties of alkaline phosphatases in five isolates of marine bacteria. Journal of Bacteriology，1977，129（3）：1607-1612.

［56］ Poole K，Hancock RE.Secretion of alkaline phosphatase and phsopholipase C in Pseudomonas aeruginosa is specific and does not involve an increase in outer membrane permeability.FEMS Microbiology Letters，1983，16（1）：25-29.

［57］ Von Tigerstrom R.Production of two phosphatases by Lysobacter enzymogenes and purification and characterization of the extracellular enzyme.Applied and Environmental Microbiology，1984，47（4）：693-698.

［58］ Hermann M，Saunders AM，Schramm A.Effect of lake trophic status and rooted macrophytes on community composition and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in freshwater sediments.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（10）：3127-3136.

［59］ Wu Y，Xiang Y，Wang J et al.Heterogeneity of archaeal and bacterial ammonia-oxidizing communities in Lake Taihu，China.Environmental Microbiology Reports，2010，2（4）：569-576.

［60］ Sakurai M，Wasaki J，Tomizawa Y et al.Analysis of bacterial communities on alkaline phosphatase genes in soil supplied with organic matter.Soil science and Plant Nutrition，2008，54（1）：62-71.

［61］ Zaheer R，Morton R，Proudfoot M et al.Genetic and biochemical properties of an alkaline phosphatase PhoX family protein found in many bacteria.Environmental Microbiology，2009，11（6）：1572-1587.

［62］ Orchard ED，Webb EA，Dyhrman ST.Molecular analysis of the phosphorus starvation response in Trichodesmium spp.Environmental Microbiology，2009，11（9）：2400-2411.

［63］ Harke MJ，Berry DL，Ammerman JW et al.Molecular response of the bloom-forming cyanobacterium，Microcystis aeruginosa，to phosphorus limitation.Microbial Ecology，2012，63（1）：188-198.

［64］ Kageyama H，Tripathi K，Rai AK et al.An alkaline phosphatase／phosphodiesterase，PhoD，induced by salt stress and secreted out of the cells of Aphanothece halophytica，a halotolerant cyanobacterium.Applied and Environmental Microbiology，2011，77（15）：5178-5183.

［65］ Chhabra S，Brazil D，Morrissey J et al.Fertilization management affects the alkaline phosphatase bacterial community in barley rhizosphere soil.Biology and Fertility of Soils，2012，49（1）：31-39.

［66］ Liu Z，Wu C.Response of alkaline phosphatases in the cyanobacterium Anabaena sp.FACHB 709 to inorganic phosphate starvation.Current Microbiology，2012，64（6）：524-529.

［67］ Adams M，Gomez-Garcia M，Grossman A et al.Phosphorus deprivation responses and phosphonate utilization in a thermophilic Synechococcus sp.from microbial mats.Journal of Bacteriology，2008，190（24）：8171-8184.

［68］ Luo M，Guo YC，Deng JY et al.Characterization of a monomeric heat-labile classical alkaline phosphatase from Anabaena sp.PCC7120.Biochemistry，2010，75（5）：655-664.

［69］ Mu?oz-Martín Má，Mateo P，Leganés F et al.Novel cyanobacterial bioreporters of phosphorus bioavailability based on alkaline phosphatase and phosphate transporter genes of Anabaena sp.PCC 7120.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，400（10）：3573-3584.

［70］ Asencio AD，Morte A，García-Carmona F et al.Partial purification and characterization of a calcium-dependent alkaline phosphatase from the cyanobacterium Arthrospira platensis.Journal of Phycology，2012，48（2）：347-354.

［71］ Ishibashi M，Odak K，Arakawa T et al.Cloning，expression，purification and activation by Na ion of halophilic alkaline phosphatase from moderate halophile Halomonas sp.593.Protein Expression and Purification，2011，76（1）：97-102.

［72］ Venkateswaran K，Natarajan R.Seasonal distribution of inorganic phosphate solubilising bacteria and phosphatase produ-

cing bacteria in Porto Novo waters［India］ .Indian Journal of Marine Sciences，1983，12：213-217.

［73］ Seshadri S，Ignacimuthu S，Lakshminarsimhan C.Variations in hetetrophic and phosphate solubilizing bacteria from Chennai，southeast coast of India.Indian Journal of Marine Sciences，2002，31（1）：69-72.

［74］ Rodríguez H，Fraga R.Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion.Biotechnology Advances，1999，17（4）：319-339.

［75］ Dubey S.Associative effect of nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria in rainfed soybean（Glycine max）grown in Vertisols.Indian Journal of Agricultural Science，2001，71（7）：476-479.

［76］ Zhao Xiaorong，Lin Qimei，Sun Yanxin et al.Phosphobacteria distribution in rhizophere and nonrhizophere soil of corn. Chinese Journal of Ecology，2001，20（6）：62-64（in Chinese with English abstract）.［趙小蓉，林啟美，孫焱鑫等.玉米根際與非根際解磷細菌的分布特點.生態(tài)學雜志，2001，20（6）：62-64.］

［77］ Hao Jing，Hong Jianping，Liu Binget al.Isolation，screening and combination of highly-effective phosphorus solubilizing bacterial strains in calcareous soil.Chinese Journal of Applied＆Environmental Biology，2006，12（3）：404-408（in Chinese with English abstract）.［郝晶，洪堅平，劉冰等.石灰性土壤中高效解磷細菌菌株的分離，篩選及組合.應用與環(huán)境生物學報，2006，12（3）：404-408.］

［78］ Yu X，Liu X，Zhu TH et al.Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from walnut and their effect on growth and phosphorus mobilization.Biology and Fertility of Soils，2011，47（4）：437-446.

［79］ Wu GF，Zhou XP.Characterization of phosphorus-releasing bacteria in a small eutrophic shallow lake，Eastern China.Water Research，2005，39（19）：4623-4632.

［80］ Song Wei，Yuan Lina，Xiao Linet al.ALPase activity and the distribution of phosphate solubilizing bacteria and the relationship between them in sediments of Lake Taihu.Chinese Journal of Environmental Science，2007，28（10）：2355-2360（in Chinese with English abstract）.［宋煒，袁麗娜，肖琳等.太湖沉積物中解磷細菌分布及其與堿性磷酸酶活性的關系.環(huán)境科學，2007，28（10）：2355-2360.］

［81］ Feng Sheng，Qin Boqiang，Gao Guang.The relationships between phosphorus-transmuting bacteria and phosphorus forms inLake Taihu.J Lake Sci，2008，20（4）：428-436（in Chinese with English abstract）.DOI：10.18307／2008.0404.［馮勝，秦伯強，高光.太湖磷轉化細菌與水體磷形態(tài)關系.湖泊科學，2008，20（4）：428-436.］

［82］ Zhou C，Song C，Huang D et al.Isolation and characterization of organic phosphorus-mineralizing bacteria in sediment of a chinese large shallow eutrophic lake（Lake Taihu）.Geomicrobiology Journal，2011，28（8）：660-666.

［83］ Zhou Chun，Song Chunlei，Cao Xiuyunet al.Responses of extracellular alkaline phosphatase activity in different organic phosphorus mineralizing bacteria strains isolated from Lake Taihu to the cyanobacterium detritus.Acta Hydrobiologia Sinica，2012，36（1）：119-125（in Chinese with English abstract）.［周純，宋春雷，曹秀云等.太湖不同解有機磷菌株胞外堿性磷酸酶活性對藍藻碎屑的響應.水生生物學報，2012，36（1）：119-125.］

［84］ Barik S，Purushothaman C，Mohanty A.Phosphatase activity with reference to bacteria and phosphorus in tropical freshwater aquaculture pond systems.Aquaculture Research，2001，32（10）：819-832.

［85］ Ba?eras L，Ros-Ponsatí M，Cristina XP et al.Phosphorus deficiency and kinetics of alkaline phosphatase in isolates and natural populations of phototrophic sulphur bacteria.FEMS Microbiology Ecology，2010，73（2）：243-253.

［86］ Amann RI，Ludwig W，Schleifer KH.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

［87］ Morris JJ，Kirkegaard R，Szul MJ et al.Facilitation of robust growth of Prochlorococcus colonies and dilute liquid cultures by“helper”heterotrophic bacteria.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（14）：4530-4534.

［88］ Nichols D，Lewis K，Orjala J et al.Short peptide induces an“uncultivable”microorganism to grow in vitro.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（15）：4889-4897.

［89］ Franklin RB，Garland JL，Bolster CH et al.Impact of dilution on microbial community structure and functional potential：comparison of numerical simulations and batch culture experiments.Applied and Environmental Microbiology，2001，67（2）：702-712.

［90］ Kaeberlein T，Lewis K，Epstein SS.Isolating“uncultivable”microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.Science，2002，296（5570）：1127-1129.

［91］ Stevenson BS，Eichorst SA，Wertz JT et al.New strategies for cultivation and detection of previously uncultured microbes. Applied and Environmental Microbiology，2004，70（8）：4748-4755.

［92］ Mehta S，Nautiyal CS.An efficient method for qualitative screening of phosphate-solubilizing bacteria.Current Microbiology，2001，43（1）：51-56.

［93］ Kim EE，Wyckoff HW.Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on crystal structures：Two-metal ion catalysis. Journal of Molecular Biology，1991，218（2）：449-464.

［94］ Coleman JE.Structure and mechanism of alkaline phosphatase.Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，1992，21（1）：441-483.

［95］ Dai JY，Chen D，Gao G et al.Recovery of novel alkaline phosphatase-encoding genes（phoX）from eutrophic Lake Taihu. Canadian Journal of Microbiology，2014，60：167-171.

［96］ Dai JY，Chen D，Wu SQ et al.Comparative analysis of alkaline phosphatase-encoding genes（phoX）in two contrasting zones of Lake Taihu.Canadian Journal of Microbiology，2015，61：227-236.

［97］ Valdespino-Castillo PM，Alcántara-Hernández RJ，Alcocer Jet al.Alkaline phosphatases in microbialites and bacterioplankton from Alchichica soda lake，Mexico.FEMS Microbiology Ecology，2014，90：504-519.

［98］ Gilbert JA，Field D，Huang Y et al.Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.PLoS One，2008，3（8）：e3042.

［99］ Frias-Lopez J，Shi Y，Tyson GW et al.Microbial community gene expression in ocean surface waters.Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（10）：3805-3810.

［100］Qin Boqiang.Approaches to mechanisms and control of eutrophication of shallow lakes in the middle and lower reaches of the Yangze River.J Lake Sci，2002，14（3）：193-202（in Chinese with English abstract）.DOI：10.18307／2002.0301.［秦伯強.長江中下游淺水湖泊富營養(yǎng)化發(fā)生機制與控制途徑初探.湖泊科學，2002，14（3）：193-202.］

Bacterial alkaline phosphatases and affiliated encoding genes in natural waters：A review

DAI Jiangyu1，GAO Guang2，WU Shiqiang1，WU Xiufeng1，ZHOU Jie1，XUE Wanyun1，YANG Qianqian1& CHEN Dan3??
（1：State Key Laboratory of Hydrology?Water Resources and Hydraulic Engineering，Nanjing Hydraulic Research Institute，Nanjing 210029，P.R.China）（2：State Key Laboratory of Lake Science and Environment，Nanjing Institute of Geography and Limnology，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，P.R.China）（3：Nanjing Guohuan Science and Technology Co.，Ltd of Nanjing Institute of Environmental Sciences，MEP，Nanjing 210042，P.R.China）

Soluble reactive phosphorus is the main form of phosphorus directly available for phytoplankton in natural waters，and the organophosphate mineralization catalyzed by bacterial alkaline phosphatases maintains the supply of soluble reactive phosphorus. We summarized the species and subcellular location of bacterial alkaline phosphatases and found that PhoA，PhoX and PhoD were the main phosphatase species.Over 50%of PhoX were distributed outside of bacterial cells，which is particularly important for the regeneration of soluble reactive phosphorus in natural waters.The research progress in communities of alkaline phosphatase encoding bacteria and the environmental factors influencing the expression of alkaline phosphatase encoding genes were also reviewed. We compared and analyzed the characteristics and developing trend of identification methods towards bacterial communities generating alkaline phosphatases.Most of studies about bacterial alkaline phosphatase-encoding genes were focused on oligotrophic marine ecosystems，and little was on the lake ecosystems which are also facing the phosphorus-limiting problem.Further researches should construct the bacterial metagenomic databases for certain eutrophic lakes to provide basis for build the methodology for bacterial alkaline phosphatases and affiliated encoding genes in freshwater ecosystems，which are beneficial to understand the microbial mech-

Phosphorus；bacteria；alkaline phosphatase；encoding gene；lake

J.Lake Sci.（湖泊科學），2016，28（6）：1153-1166

DOI 10.18307／2016.0601

?2016 by Journal of Lake Sciences