付忠華 劉 月 辛立衛(wèi) 張春光 陳永剛

（梨樹(shù)縣獸藥監(jiān)察所，吉林梨樹(shù) 136500）

FAT/CD36基因在不同品種肉牛眼肉中差異結(jié)合microRNAs

付忠華 劉 月 辛立衛(wèi) 張春光 陳永剛

（梨樹(shù)縣獸藥監(jiān)察所，吉林梨樹(shù) 136500）

在Gene Bank中查找牛脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36），設(shè)計(jì)并合成巢式PCR引物，以6個(gè)品種牛肌眼肉組織DNA為模板，擴(kuò)增獲得1689bp和945bp目的片段，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在197bp發(fā)生A/T突變，導(dǎo)致不結(jié)合bmo-mir-3232，新結(jié)合mtrmiR5277，odi-let-7b，str-miR-8400-3p。

脂肪酸轉(zhuǎn)位酶 調(diào)控區(qū) 單核苷酸多態(tài)性 微小核糖核酸

眼肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)豐富，一直是世界肉業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家肉類消費(fèi)的首選，而我國(guó)的牛肉消費(fèi)量也在逐年上升，影響牛肉品質(zhì)的因素眾多，肌內(nèi)脂肪沉積是牛肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵，更是大理石花紋評(píng)定牛肉等級(jí)的關(guān)鍵指標(biāo)［1，2］。脂肪的生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有900多個(gè)數(shù)量性狀的候選基因?qū)χ境练e進(jìn)行調(diào)控［3］。國(guó)內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行了廣泛而深入的研究，而脂肪酸轉(zhuǎn)位酶也是控制肌內(nèi)脂肪沉積的一個(gè)重要基因。

脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acidtranslocase，F(xiàn)AT/CD36）是一種在體內(nèi)分布十分廣泛的膜糖蛋白，并且在脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著非常重要的作用，由 472 個(gè)氨基酸組成，其分子量約為 53kD a［4］。FAT/CD36 是一種細(xì)胞膜上的單鏈跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有發(fā)卡樣的結(jié)構(gòu)，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三部分組成。其羧基末端（C端）和氨基末端（N 端）各有一個(gè)連續(xù)的疏水氨基酸區(qū)，兩個(gè)疏水末端固定在胞膜上，使其長(zhǎng)鏈絕大部分延伸在胞外。FAT/CD36廣泛分布于機(jī)體脂肪、心肌、骨骼肌、脾臟及小腸等組織。此外，血小板、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞也檢測(cè)出 FAT/ CD36 的表達(dá)［5］。近年來(lái)的研究表明，除細(xì)胞膜外，F(xiàn)AT/CD36 還可能存在于細(xì)胞內(nèi)的囊泡膜和線粒體膜上。FAT/CD36 屬于 B 類清道夫受體家族蛋白成員之一，其配體包括膠原、凝血原敏感素、紅細(xì)胞、低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化的磷脂和長(zhǎng)鏈脂肪酸等［6-8］。

FAT/CD36在脂代謝中的作用脂肪酸是細(xì)胞重要的能量來(lái)源，在安靜或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下機(jī)體骨骼肌主要由 LCFA氧化供能，而機(jī)體組織攝取脂肪酸的過(guò)程主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散，這個(gè)過(guò)程是由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的，在很大程度上可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)位進(jìn)行調(diào)節(jié)［9］。研究發(fā)現(xiàn)FAT/CD36 在 LCFA 的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［10］。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36 在脂肪酸氧化過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的腓腸肌中 CPT1 與 FAT/CD36 發(fā)生免疫共沉淀，提示 FAT/CD36 與 CPT1 在轉(zhuǎn)運(yùn) LCFA 進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化存在著一種協(xié)同作用。在小鼠體外實(shí)驗(yàn)中，CPT1 的活性可以被 FAT/CD36 的抑制劑 SSO 所抑制［11］。但在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，SSO 對(duì)人股外側(cè)肌線粒體 CPT1 的活性沒(méi)有影響，其氧化棕櫚酰肉堿的能力下降了 92 %［12］。這一現(xiàn)象提示，F(xiàn)AT/CD36 可能作為 CPT1 的下游蛋白來(lái)調(diào)節(jié) LCFA 的氧化。這些說(shuō)明FAT/CD36在線粒體有氧氧化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

MicroRNAs與脂代謝密切相關(guān)，越來(lái)越多的研究表明，microRNAs 可以通過(guò)與脂類代謝相關(guān)基因靶位點(diǎn)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇等多個(gè)層面的脂類代謝。目前，關(guān)于肌肉發(fā)育的機(jī)制還不是很清楚，但是在肌細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中許多調(diào)節(jié)因子都發(fā)揮著重要作用，microRNAs也在其中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。microRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常位于mRNAs的3′-UTR（非翻譯區(qū)域）［13］。RNA沉默中，microRNA的功能是通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNAs結(jié)合后作為其結(jié)合物的向?qū)В?4］。在mRNAs的5’端包括2-7位置的區(qū)域的核苷酸對(duì)于靶標(biāo)結(jié)合是相當(dāng)關(guān)鍵的，并且已經(jīng)被定義是microRNA種子序列。microRNA的下游核苷酸序列（尤其是8核苷酸和13-16位置的核苷酸同樣重要）也同樣與靶mRNA堿基配對(duì)結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 肌肉組織樣品

由梨樹(shù)縣種牛站提供的平均年齡約為5歲的本地黃牛、夏洛萊牛、延邊牛、弗萊維赫牛、利木贊牛和安格斯牛等6頭種公牛牛肋脊部眼肉組織，用提前經(jīng)過(guò)滅菌的鑷子和手術(shù)刀片分別取100g并切成小塊分裝，裝在紗布袋里，拴好并在繩上粘上標(biāo)簽，立即放入液氮罐中冷凍備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找到牛脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acidtranslocase，F(xiàn)AT/CD36），利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，再用軟件Oligo 6進(jìn)行引物評(píng)估，對(duì)3′-UTR設(shè)計(jì)特異引物，由上海生工合成引物。依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行巢式PCR，對(duì)6種牛的FAT/CD36基因所用引物，見(jiàn)表1。

表1 FAT/CD36基因3′UTR擴(kuò)增引物

1.3 基因組DNA的提取及目的片段擴(kuò)增

依照天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒的方法步驟進(jìn)行DNA提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的純度：取2μl基因組DNA樣品，在80V電壓條件下，采用1%瓊脂糖凝膠電泳30～60min左右。在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并檢測(cè)基因組DNA的完整性，保持備用。然后建立25μl的PCR反應(yīng)體系：12.5mmol/ L Master Mixture、1μl上游和下游引物（20mmoL/L）、2μl模版DNA，最后加8.5μL滅菌超純水至25μl。PCR運(yùn)行程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，退火30s（需要經(jīng)過(guò)梯度PCR儀設(shè)置溫度梯度，來(lái)尋找各PCR引物最佳退火溫度），72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為預(yù)期目的條帶，單一明亮，見(jiàn)圖1的a和b。

圖1 FAT/CD36基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1.4 測(cè)序和分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)正確，取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物，送樣到上海生物工程單向測(cè)序。然后在Gene Bank中Blast相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定基因的序列結(jié)構(gòu)。利用DNAStar，DNAMAN 4.0，BLAST等軟件與Gene Bank中序列進(jìn)行比較分析。利用數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan，預(yù)測(cè)3′端非翻譯區(qū)序列靶標(biāo)microRNA及靶標(biāo)microRNA核心種子區(qū)序列結(jié)合程度鑒定。應(yīng)用RNAhybri，分析microRNA結(jié)構(gòu)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAT/CD36基因3′-UTR的SNP位點(diǎn)

測(cè)序獲得FAT/CD36基因3′-UTR的堿基序列，Blast后發(fā)現(xiàn)197bp處發(fā)生A/T突變，見(jiàn)圖2的a和b。

圖2 FAT/CD36基因3′-UTR序列

2.2 FAT/CD36基因的A/T突變位點(diǎn)序列峰圖和基因型

根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析得知，F(xiàn)AT/CD36基因的A/T突變位點(diǎn)在本地黃牛和延邊牛的眼肉組織中的基因型是野生型AA，在夏洛萊牛、利木贊牛和安格斯牛的眼肉組織中的基因型是雜合型AT，在弗萊維赫牛的眼肉組織中的基因型是突變型TT，見(jiàn)圖3的a、b和c。

圖3 FAT/CD36基因中SNP的峰圖

2.3 FAT/CD36基因的靶標(biāo)microRNA結(jié)合分布

利用數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan中篩選牛的miRNA數(shù)據(jù)，提交 FAT/CD36基因及其序列，可篩選到FAT/CD36基因的ENST00000544133.1區(qū)域可特異性的結(jié)合miR-145及其他非特異性的miRNAs，見(jiàn)圖4a。而FAT/CD36基因的ENST00000447544.2區(qū)域沒(méi)有可特異性的miRNAs，但有很多非特異性的miRNAs，見(jiàn)圖4b。

圖4 FAT/CD36的靶標(biāo)miRNAs

2.4 FAT/CD36基因的靶標(biāo)microRNA核心種子區(qū)序列結(jié)合程度及特征

篩選到FAT/CD36基因特異性結(jié)合miR-145的種子序列GUCCAGUUUUCCCAGGAAU，見(jiàn)圖5a，其中核心序列是AACUGGA，見(jiàn)圖5b，主要以2種方式結(jié)合，見(jiàn)圖5c，而miR-145的環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖5d。

圖5 FAT/CD36的靶標(biāo)miRNAs的特征

2.5 FAT/CD36基因的A/T導(dǎo)致miRNAs結(jié)合的變化

依據(jù)miRNA序列的特性，在發(fā)生A/T突變位點(diǎn)的上下游分別延伸20-30bp，檢測(cè)SNP前后，F(xiàn)AT/CD36基因miRNAs的結(jié)合情況，研究發(fā)現(xiàn)，等位基因A位點(diǎn)可結(jié)合cel-miR-43-5p，cin-miR-4152-5p，bmo-miR-3232，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asumiR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，見(jiàn)圖6a，而等位基因T位點(diǎn)可結(jié)合str-miR-8400-3p，odi-let-7b，lgi-miR-190，cel-miR-43-5p，mtr-miR5277，cin-miR-4152-5p，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，見(jiàn)圖6b，所以A/T發(fā)生后，不結(jié)合bmo-mir-3232，新結(jié)合mtr-miR5277，odi-let-7b，strmiR-8400-3p。

圖5 A/T發(fā)生引起FAT/CD36基因與miRNAs結(jié)合變化

3 討論和結(jié)論

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，F(xiàn)AT/CD36基因可特異性的結(jié)合miR-145，而在本試驗(yàn)中沒(méi)有篩選到miR-145，這可能是由于所擴(kuò)增的目的片段不一致，并且本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)也不在與miR-145結(jié)合所在的種子序列區(qū)域內(nèi)，所以本實(shí)驗(yàn)中的SNP對(duì)miR-145的影響不能確定。

根據(jù)197bp處的A/T突變和測(cè)序結(jié)果得知，在本地黃牛和延邊牛的眼肉組織中的FAT/CD36基因型是野生型AA，可結(jié)合celmiR-43-5p，cin-miR-4152-5p，bmo-miR-3232，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p。在弗萊維赫牛的眼肉組織中的FAT/CD36基因型是突變型TT，可結(jié)合cel-miR-43-5p，cin-miR-4152-5p，lgi-miR-190，cel-miR-8212-5p，asu-miR-5365b-3p，sma-miR-8450-3p，不結(jié)合bmomir-3232，新結(jié)合mtr-miR5277，odi-let-7b，str-miR-8400-3p。在夏洛萊牛、利木贊牛和安格斯牛的眼肉組織中的FAT/CD36基因型是雜合型AT，就有可能結(jié)合所有篩選到的miRNAs。

總之，F(xiàn)AT/CD36基因3′-UTR區(qū)域197bp處的A/T突變，可引起FAT/CD36與bmo-mir-3232，mtr-miR5277，odi-let-7b和strmiR-8400-3p 的結(jié)合變化，但是，它們對(duì)FAT/CD36基因表達(dá)是上調(diào)還是下降作用，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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