何駿馳 劉旻諦 劉振 羅良生

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 神經(jīng)外科，江蘇 南京 210006)

·論著·

骨橋蛋白緩解大鼠SAH后腦血管痙攣的抗炎機(jī)制研究

何駿馳 劉旻諦 劉振 羅良生*

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 神經(jīng)外科，江蘇 南京 210006)

目的探究重組骨橋蛋白(r-OPN)的抗炎機(jī)制對(duì)緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)的作用。方法將48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+安慰劑組(n=12)、SAH+安慰劑組(n=12)、SAH+ r-OPN 0.03(0.03 μg)組(n=12)和SAH+ r-OPN 0.1(0.1 μg)組(n=12)。采用枕大池二次注血法建立SAH模型。首次注血后72 h取腦脊液，處死大鼠，蘇木精-伊紅(HE)染色后測(cè)量基底動(dòng)脈橫截面積和管壁厚度，判斷腦血管痙攣情況，Western blot測(cè)定基底動(dòng)脈磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)腦脊液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)水平。結(jié)果與SAH+安慰劑組相比，SAH+ r-OPN 0.1組大鼠基底動(dòng)脈橫截面積明顯增加，管壁厚度明顯減輕，基底動(dòng)脈p-JNK表達(dá)明顯降低，腦脊液TNF-α、IL-1β水平明顯降低。結(jié)論r-OPN能有效緩解SAH后CVS，其機(jī)制可能與降低p-JNK的表達(dá)，從而抑制TNF-α及IL-1β的產(chǎn)生，抑制SAH后的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

重組骨橋蛋白; 蛛網(wǎng)膜下腔出血; 腦血管痙攣; 炎癥

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是嚴(yán)重的腦血管病，多由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起，具有極高的致死率和致殘率。SAH后腦血管痙攣(cerebral vasospasm, CVS)是SAH致死和致殘的主要原因，但仍無有效的防治方法[1]。近期有研究初步表明，重組骨橋蛋白(recombinant osteopontin, r-OPN)可緩解CVS[2]。骨橋蛋白可參與炎癥反應(yīng)過程，而炎癥反應(yīng)是CVS的機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)旨在研究r-OPN的抗炎機(jī)制對(duì)緩解SAH后CVS的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD大鼠48只，體重300～375 g，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按隨機(jī)數(shù)字法分為4組：假手術(shù)+安慰劑組、SAH+安慰劑組、SAH+ r-OPN 0.03組和SAH+ r-OPN 0.1組，每組12只。

二、模型制作

采用改良的枕大池二次注血法制作模型[3]。大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射，取枕部正中切口，以和頂間骨水平面成60°的角度，在頂間骨和枕骨交界處的中點(diǎn)鉆一直徑約1 mm骨孔。改仰臥位，右股動(dòng)脈區(qū)切口，暴露股動(dòng)脈，l ml注射器抽取股動(dòng)脈血0.2 ml。俯臥位立體定向儀固定，1 ml注射器針頭通過骨孔，以與頂間骨水平面成60°的角度，沿枕骨內(nèi)面進(jìn)針約6 mm。抽取0.1 ml腦脊液，再以0.15 ml/min速度注入自體動(dòng)脈血。拔出針頭，骨蠟封閉骨孔，依次縫合肌肉、皮膚，保持俯臥位頭低30°持續(xù)30 min。48 h后同法再次注血0.1 ml。假手術(shù)+安慰劑組不注血。第一次注血后30 min，SAH+ r-OPN 0.03組和SAH+r-OPN0.1組大鼠行側(cè)腦室穿刺，在前囟點(diǎn)后1.5 mm、顱骨中線旁1.0 mm處鉆一直徑約1 mm骨孔，10 μl微量注射器(美國(guó)漢密爾頓公司)通過骨孔到達(dá)顱骨下3.2 mm，通過其以0.5 μl/min的速度分別注入0.03 μg(0.03 μg/1 μl 磷酸緩沖鹽溶液[phosphate buffered solution, PBS])r-OPN和0.1 μg(0.1 μg/1 μl PBS)r-OPN，骨孔用骨蠟封閉，縫合頭皮。假手術(shù)+安慰劑組和SAH+安慰劑組用相同方法向側(cè)腦室分別注入1 μl PBS。

三、組織學(xué)觀察

首次注血后72 h，心臟灌注后開顱取腦干，以10%甲醛固定后行石蠟切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察，運(yùn)用Image J軟件盲法測(cè)量基底動(dòng)脈管壁厚度和管腔橫截面積。沿血管內(nèi)膜表面測(cè)量血管內(nèi)周長(zhǎng)，每條動(dòng)脈按近端、中部、末端各測(cè)量1次，取平均值為其測(cè)量值。半徑=周長(zhǎng)/2π，則管腔面積=π×半徑2=周長(zhǎng)2/4π。每條動(dòng)脈從四個(gè)不同點(diǎn)測(cè)量血管內(nèi)膜到中膜外緣的距離，取平均值為血管壁厚度。

四、磷酸化c-Jun氨基末端激酶表達(dá)測(cè)定

首次注血后72 h，取基底動(dòng)脈，用Western blot測(cè)定蛋白含量。提取蛋白后定量，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，孵一抗，孵二抗，膠片顯影。用Image J軟件分析各條帶。其中一抗為兔抗磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase, p-JNK)(北京博奧森公司)，二抗為羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Jackson公司)，內(nèi)參為β-actin(美國(guó)Immunoway公司)。

五、腦脊液腫瘤壞死因子-α和白介素-1β濃度測(cè)定

大鼠處死前取腦脊液0.1 ml，標(biāo)本7 200 r/min離心4 min取上清，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)試劑盒(美國(guó)Ramp;D公司)測(cè)定各樣本腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的吸光度，用Curve Expert軟件繪制擬合曲線及方程，求出各樣本TNF-α和IL-1β的濃度。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以±SD表示，應(yīng)用SPSS 17.0中的單因素方差分析(one- way ANOVA)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)方差齊性，若方差齊時(shí)，兩兩比較用t檢驗(yàn)，若方差不齊用Dunnett's T3方法。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GroupnCross?sectionalareas(μm2)Thicknessofvesselwall(μm) Sham+vehicle654027．580±10545．28617．182±4．737 SAH+vehicle623781．800±9252．144a29．312±2．702a SAH+r?OPN0．03628686．208±6582．83619．755±2．624b SAH+r?OPN0．1649407．807±6895．554b22．209±5．598b

aPlt;0.01,vssham+ vehicle group;bPlt;0.01,vsSAH+ vehicle group.

結(jié) 果

一、基底動(dòng)脈橫截面積及管壁厚度

與假手術(shù)+安慰劑組相比，SAH+安慰劑組的基底動(dòng)脈橫截面積比明顯減小(Plt;0.01)，血管壁厚度明顯增加(Plt;0.01)。與SAH+安慰劑組相比，SAH+ r-OPN 0.1組管腔橫截面積明顯增加(Plt;0.01)，管壁厚度明顯減小(Plt;0.01)，SAH+ r-OPN 0.03組管壁厚度明顯減小(Plt;0.01)，橫截面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1，表1)。

圖1 各組基底動(dòng)脈HE染色
Fig 1 HE staining of basilar arteries in all groups
A: The sham+ vehicle group showed no vasospasm of basilar artery with smooth internal elastic lamina (×200); B: The SAH+vehicle group showed luminal narrowing, increased wall thickness, and corrugation of the internal elastic lamina (×200); C: The SAH+r-OPN0.03 group showed slight luminal narrowing, slightly increased wall thickness, and sight corrugation of the internal elastic lamina (×200); D: The SAH+r-OPN0.1 group showed attenuated luminal narrowing, attenuated wall thickness, and attenuated corrugation of the internal elastic lamina (×200).
A: The sham+ vehicle group (×200); B: The SAH+ vehicle group (×200); C: The SAH+r-OPN0.03 group (×200); D: The SAH+r-OPN0.1 group (×200).

二、基底動(dòng)脈p-JNK表達(dá)

與假手術(shù)+安慰劑組相比，SAH+安慰劑組的p-JNK表達(dá)明顯增加(Plt;0.01)。與SAH+安慰劑組相比，SAH+r-OPN 0.1組p-JNK表達(dá)明顯降低(Plt;0.01)(圖2)。

圖2 基底動(dòng)脈p-JNK表達(dá)
Fig 2 Expression of p-JNK in BA
A: Representative Western blot expression of p-JNK in basilar arteries; B: Effects of r-OPN on p-JNK (n=6).

aPlt;0.01,vssham+ vehicle group;bPlt;0.01,vsSAH+ vehicle group.

三、腦脊液TNF-α和IL-1β水平

與假手術(shù)+安慰劑組相比，SAH+安慰劑組腦脊液TNF-α水平明顯升高(Plt;0.05)，IL-1β水平明顯升高(Plt;0.05)。與SAH+安慰劑組相比，SAH+r-OPN 0.1組和SAH+r-OPN 0.03組腦脊液TNF-α水平均明顯降低(Plt;0.05)，IL-1β水平也明顯降低(Plt;0.05)(表2)。

GroupnTNF?α(pg/ml)IL?1β(pg/ml) Sham+vehicle6114．504±45．91723．958±4．156 SAH+vehicle6740．324±282．155a1477．254±635．637a SAH+r?OPN0．036299．530±86．345b148．767±66．780b SAH+r?OPN0．16133．212±78．190b45．710±18．677b

aPlt;0.05,vssham+ vehicle group;bPlt;0.05,vsSAH+ vehicle group.

討 論

CVS發(fā)生在SAH后第3 d到14 d，可引起遲發(fā)性腦缺血，是SAH致死和致殘的主要原因。有多種針對(duì)CVS的治療方法，如3H療法、鈣通道阻滯劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑等，但仍不能成功防治CVS的發(fā)生，新的治療方法還需進(jìn)一步探索[4]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可能通過抗炎作用緩解兔子SAH后基底動(dòng)脈血管痙攣，并減少血管周圍中性粒細(xì)胞的遷移[5]。說明炎癥可能是引起SAH后腦血管痙攣的因素之一。

骨橋蛋白是一種分泌型多效性細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，參與許多組織的多種病理生理過程，包括組織重塑、纖維化、細(xì)胞遷移、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等[6]。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是引起CVS的重要原因，近來有研究表明，巨噬細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白的過度表達(dá)可以強(qiáng)烈抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[7]。

近來研究者發(fā)現(xiàn)，在有促炎細(xì)胞因子IL-1β的環(huán)境下，r-OPN通過抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性，減少基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的產(chǎn)生，可減輕SAH后早期腦損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAH+安慰劑組相比，SAH+高劑量r-OPN組大鼠基底動(dòng)脈橫截面積明顯增加，管壁厚度明顯減輕，提示r-OPN有抑制基底動(dòng)脈痙攣的作用。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)可能是CVS過程中的一種共同的最終信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族成員之一，存在于血管平滑肌細(xì)胞中，通過磷酸化過程被激活，產(chǎn)生一系列下游效應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)[2]。促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β在炎癥刺激物的作用下產(chǎn)生，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。有人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)皮細(xì)胞可能通過激活JNK/ NF-κB通路，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子如TNF-α，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。通過脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞可能通過JNK信號(hào)通路上調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)[10]。

在小鼠SAH中，IL-1β激活后可能部分通過JNK通路引起血腦屏障破壞[11]。炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平與SAH的嚴(yán)重程度有關(guān)，SAH后腦室內(nèi)和腦脊液內(nèi)TNF-α和IL-1β濃度均升高[12]。有研究表明，在兔子SAH后腦血管模型中，腦脊液中IL-1β水平升高，而抑制炎癥反應(yīng)后，腦血管痙攣緩解，可能是通過降低IL-1β的水平[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAH+r-OPN 0.1組基底動(dòng)脈p-JNK表達(dá)與SAH+安慰劑組相比明顯減少，SAH+r-OPN 0.1組和SAH+r-OPN 0.03組大鼠腦脊液TNF-α和IL-1β水平與SAH+安慰劑組明顯降低，表明r-OPN可能通過抑制p-JNK的表達(dá)，抑制下游的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗CVS的作用。

綜上所述，側(cè)腦室注入0.1 μg r-OPN能緩解大鼠SAH后CVS，其機(jī)制可能是抑制p-JNK的表達(dá)，從而減少促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。骨橋蛋白可能成為治療SAH后CVS的新方法，但其除了參與炎癥反應(yīng)外，還參與多種病理生理過程如纖維化、凋亡等，其減輕SAH后腦血管痙攣的作用是否還有其他機(jī)制參與，有待進(jìn)一步研究。

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Anti-inflammatorymechanismofosteopontinalleviatingcerebralvasospasmaftersubarachnoidhemorrhageinrats

HEJunchi,LIUMindi,LIUZhen,LUOLiangsheng

DepartmentofNeurosurgery,NanjingFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210006, China

ObjectiveThe anti-inflammatory mechanism of recombinant osteopontin (r-OPN) alleviating cerebral vasospasm (CVS) after subarachnoid hemorrhage (SAH) is investigated.MethodsForty-eight rats were randomly assigned to sham+ vehicle group (n=12), SAH+ vehicle group (n=12), SAH+r-OPN0.03 (0.03 μg) group (n=12), and SAH+r-OPN0.1 (0.1μg) group (n=12). The double injection model of cisterna magna was induced. Cerebrospinal fluid (CSF) was collected and rats were sacrificed at 72 h after the first hemorrhage induction. The degree of CVS was determined by the measurement of the cross-sectional area and thickness of basilar arteries under hematoxylin-eosin (HE) staining. Western blot analysis was applied to evaluate the expression of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) in BA. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in CSF were tested using an enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kit.ResultsThe SAH+r-OPN0.1 group showed significant increased cross-sectional area, decreased wall thickness, decreased expression of p-JNK in basilar arteries, declined TNF-α level and IL-1β level in CSF compared with the SAH+vehicle group.Conclusionr-OPN is demonstrated to alleviate CVS effectively, and its probable mechanism may be associated with the suppression of p-JNK expression, and subsequently inhibition of TNF-α and IL-1β production and suppression of inflammation after SAH.

Recombinant osteopontin; Subarachnoid hemorrhage; Cerebral vasospasm; Inflammation

1671-2897(2016)15-025-04

R 743.35 R 332

A

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(YKK11115)

何駿馳，碩士研究生，E-mail: hejunchi@126.com；劉旻諦，碩士研究生，E-mail: spslmd@163.com

*通訊作者：羅良生，副教授、主任醫(yī)師，E-mail: lsluo@sohu.com

2015-03-20；

2015-05-30)