邱妍川，鐘 玲，邢于政，楊宗芹，朱照靜，何 靜△

(1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 401331；2.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司 401121)

?

論著·基礎(chǔ)研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.007

水飛薊素PLGA腸溶納米粒大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

邱妍川1，鐘 玲2，邢于政1，楊宗芹1，朱照靜1，何 靜1△

(1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 401331；2.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司 401121)

[摘要] 目的 研究水飛薊素PLGA腸溶納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為。方法 利用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定大鼠灌胃市售制劑水飛薊素片益肝靈片與水飛薊素PLGA腸溶納米粒后的血藥濃度，并采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果 在25.3～5 051.0 ng/mL范圍內(nèi)，水飛薊賓血藥濃度呈線性關(guān)系，r=0.999 9，日內(nèi)、日間精密度RSD均小于8.5%；灌胃給藥水飛薊素PLGA腸溶納米粒后，藥-時(shí)曲線符合二室模型，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax為(2 255.84±315.44)ng/mL，t1/2β 為(13.85±2.29)h，相對(duì)益肝靈片的生物利用度為126%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、專屬性好，適合大鼠血漿中水飛薊素PLGA腸溶納米粒藥代動(dòng)力學(xué)學(xué)研究。水飛薊素PLGA腸溶納米粒提高了口服生物利用度。

水飛薊素；水飛薊賓；藥代動(dòng)力學(xué)

[Abstract] Objective To investigate the pharmacokinetics of enteric coated silymarin-PLGA nanoparticles in rats.Methods Rats were given silymarin tablets and enteric coated silymarin-PLGA nanoparticles by intragastric administration.The HPLC method was established to detect drug concentration in plasma of rats,and the obtained data were processed with 3P97 software.Results In 25.3-5 051.0 ng/mL range,silybin plasma concentration showed a linear relation,r=0.999 9,the intra- and inter- precisions(RSD)were all lower than 8.5%.The concentration-time curve was fitted to a 2-compartment model,the pharmacokinetic parameters of the enteric coated silymarin-PLGA nanoparticle were as follows:Cmax was(2 255.84±315.44)ng/mL,t1/2β was(13.85±2.29)h,and the relative bioavailability espectively was 126%.Conclusion The method is accurate,simple and reproducible.It is fit to study the pharmacokinetics of the enteric coated silymarin-PLGA nanoparticle in plasma of rats.The enteric coated silymarin-PLGA nanoparticle could improve the oral bioavailability significantly.

水飛薊素是從菊科植物水飛薊果實(shí)中分離提取得到的，包含水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭等成分的一類黃酮化合物的總稱，其中，水飛薊賓含量最高、藥理活性最強(qiáng)[1-2]。臨床上，水飛薊素對(duì)慢性肝炎，各種肝損傷、肝纖維化和早期肝硬化等肝臟疾病有較好治療作用[3-4]，目前，市售制劑主要為普通口服制劑，但由于其難溶于水，口服后生物利用度低，影響了藥物的治療作用[5-6]。

腸溶納米粒(enteric nanoparticles)是近年來發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，由于其能延長藥物滯留時(shí)間，促進(jìn)藥物與腸壁接觸，且使藥物以分子狀態(tài)分布于腸溶載體，提高了藥物穩(wěn)定性及口服生物利用度，得到了越來越多的關(guān)注[7-9]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究制備得到水飛薊素PLGA腸溶納米粒自制制劑的基礎(chǔ)上，選用含量最多，藥理活性最強(qiáng)的水飛薊賓作為指標(biāo)成分，研究了自制制劑與市售制劑水飛薊素片給藥后大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為，比較了二者藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與生物利用度的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本Shimadzu LC-2010C HT高效液相色譜(HPLC)儀；Min1512臺(tái)式高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；CP225D電子天平(德國賽多利斯公司)，QL-901 旋渦混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；LG-50F冷凍干燥機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；超速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)；F1-A10超純水器(默克密理博公司)；Sartorius BS210S電子天平(德國Sartorius 公司)；Eppendorf移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 藥品與試劑 水飛薊素(西安瑞林生物科技有限公司，純度大于98%)；水飛薊賓對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110856-200604)，柚皮素(上海佳和生物科技有限公司，純度99.6%)；水飛薊素片(商品名：益肝靈片，規(guī)格：38.5 mg，沈陽東陵藥業(yè)股份有限公司)；乳酸-乙醇酸共聚物PLGA(中科院成都有機(jī)化學(xué)研究所)；羥丙甲纖維素鄰苯二甲酸酯HPMCP(HP55，黏度40 cpa.s，日本信越化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)；聚乙烯醇PVA(美國Sigma-Aldrich公司)；β-葡萄糖醛酸酶(美國Sigma公司)；乙醚(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；丙酮(化學(xué)純，重慶川江化學(xué)試劑廠)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。自制水飛薊素PLGA腸溶納米粒：精密稱取一定量水飛薊素、PLGA和HPMCP溶于丙酮中，在磁力攪拌下，快速注入到1% PVA水溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，30 000 r/min高速離心30 min，用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，得到水飛薊素腸溶PLGA納米粒。

1.3 動(dòng)物 選取SD大鼠12只，健康合格，雌雄各半，體質(zhì)量(250±30)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0001。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Dikma-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值2.77)=48∶52(v∶v)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長288 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取柚皮素10 mg置25 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,制成內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(400 μg/mL)。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1.0 mL于100.0 mL量瓶中，加流動(dòng)相配成內(nèi)標(biāo)溶液(4 000 ng/mL)。

1.4.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取水飛薊賓對(duì)照品置量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成水飛薊賓儲(chǔ)備液(50.51 μg/mL)。精密量取水飛薊賓儲(chǔ)備液1.0 mL于100.0 mL量瓶中，加流動(dòng)相配成水飛薊賓對(duì)照品溶液(505.1 ng/mL)。

1.4.4 血漿樣品的處理 取血漿樣品200 μL，加入磷酸鹽緩沖液400 μL(pH值5.00)，用50 μL β-葡萄糖醛酸酶溶液混勻，培育16 h(37 ℃水浴)。加內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，硼酸鹽緩沖液1.0 mL(pH值8.50)，加入無水乙醚萃取2次(每次3 mL)，離心，分離醚層，合并乙醚層，空氣吹干，流動(dòng)相100 μL 溶解殘留，離心，取上清液進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 專屬性考察 采用1.4.1色譜條件，分別取空白血漿、對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)樣考察空白血漿、水飛薊賓、異水飛薊賓(水飛薊賓的同分異構(gòu)體)、內(nèi)標(biāo)柚皮素的出峰時(shí)間。

1.4.6 血漿中水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取血漿200 μL，加入水飛薊賓儲(chǔ)備液，使水飛薊賓血漿樣品濃度分別為：25.3、126.3、252.6、505.1、2 526.0、5 051.0 ng/mL，按1.4.3進(jìn)行樣品處理，在1.4.1色譜條件下測(cè)定，記錄內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)并計(jì)算水飛薊賓與異水飛薊賓峰面積之和(As)與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(As/Ai)，以水飛薊賓濃度X對(duì)峰面積之比Y(As/Ai)進(jìn)行回歸分析。

1.4.7 最低檢測(cè)限 分別以空白血漿定量稀釋某一濃度的水飛薊賓，按照1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測(cè)定信號(hào)噪音比為3∶1時(shí)的濃度即為最低檢測(cè)限。

1.4.8 回收率試驗(yàn)

1.4.8.1 相對(duì)回收率 分別配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各5份，按1.4.3處理，進(jìn)樣20 μL作HPLC分析，將所得峰面積比代入回歸方程算得濃度，與標(biāo)示濃度相比，即得相對(duì)回收率。

1.4.8.2 絕對(duì)回收率 分別配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各5份，按1.4.3處理，進(jìn)樣20 μL作HPLC分析，另用1.4.3處理所得的空白血漿配制相應(yīng)濃度水飛薊賓對(duì)照品溶液，直接進(jìn)樣，記錄峰面積，將所得峰面積相比，即得絕對(duì)回收率。

1.4.9 精密度試驗(yàn)

1.4.9.1 日內(nèi)精密度 分別配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各5份，按1.4.3處理，進(jìn)樣20 μL作HPLC分析，記錄峰面積比，按回歸方程計(jì)算樣品濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度。

1.4.9.2 日間精密度 分別連續(xù)5 d配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各1份，按1.4.3處理，進(jìn)樣20 μL作HPLC分析，計(jì)算日間精密度。

1.4.10 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.4.10.1 日內(nèi)穩(wěn)定性 分別配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各1份，按1.4.3處理后，常溫下保存，在當(dāng)天0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)穩(wěn)定性。

1.4.10.2 冰凍穩(wěn)定性 分別配制含水飛薊賓低、中、高3種濃度(25.3、505.1、5 051.0 ng/mL)的血漿樣品各6份，置于-20 ℃的冰箱保存，分別在1、2、4、6、12、24 d各取出1份后，按1.4.3處理進(jìn)樣，計(jì)算冰凍穩(wěn)定性。

1.4.11 藥代動(dòng)力學(xué) SD大鼠12只，分成2組(每組6只)，禁食12 h，自由飲水。以水飛薊素32 mg/kg給藥量，分別灌胃自制水飛薊素PLGA腸溶納米粒及水飛薊素片(各制劑分別用超純化水分散后按照劑量灌胃)。分別于0.15、0.35、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取血0.5 mL，肝素抗凝，分離血漿。-20 ℃冷凍保存待用。

2 結(jié) 果

2.1 方法可行性考察 在本試驗(yàn)色譜條件下，水飛薊賓和異水飛薊賓的保留時(shí)間分別約為16.5 min和18.6 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為22.3 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響藥物的分離測(cè)定，色譜圖見圖1。

A：空白血漿；B：空白血漿+藥物+內(nèi)標(biāo)。

圖1 大鼠血漿中水飛薊賓的HPLC圖

2.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線 以峰面積比值R對(duì)血漿濃度C進(jìn)行線性回歸分析。求得線性回歸方程R=0.0039C-0.018，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，血漿樣品中水飛薊賓濃度在25.3～5 051.0 ng/mL范圍內(nèi)，峰面積比值與血藥濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.3 回收率 血漿中相對(duì)回收率為97.1%～98.5%，見表1，絕對(duì)回收率67.6%～72.1%，見表2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，滿足方法學(xué)要求。

表1 血漿中水飛薊賓的相對(duì)回收率(n=5)

表2 血漿中水飛薊賓的絕對(duì)回收率(n=5)

2.4 精密度 血漿樣品日內(nèi)RSD和日間RSD在0.1%～8.5%，均小于10.0%，滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求，見表3。

2.5 樣品穩(wěn)定性 血漿樣品日內(nèi)穩(wěn)定性考察中濃度變化在97.8%～100.7%，見表4，冰凍穩(wěn)定性考察中濃度變化在97.4%～100.2%，見表5，滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.6 最低檢測(cè)限 以信噪比為3計(jì)算，得到水飛薊賓在血漿中的最低檢測(cè)限為10 ng/mL。

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究 圖2為12只SD大鼠給藥后，獲得的血藥濃度-時(shí)間曲線。3P97軟件計(jì)算得到兩種制劑給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)，見表6。軟件SPSS20.0統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax，t1/2β，AUC(0～∞)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 水飛薊賓在血漿中的精密度(n=5)

表4 日內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%)

表5 冰凍穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%)

圖2 水飛薊賓血藥濃度-時(shí)間曲線

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)水飛薊素PLGA腸溶納米粒益肝靈片(水飛薊素片)Cmax(μg/mL)2255．84±315．44a1033．89±105．77tmax(h)1．32±0．281．41±0．62t1/2α(h)1．17±0．690．86±0．41t1/2β(h)13．85±2．29a3．71±0．73t1/2kα(h)0．48±0．210．62±0．13AUC(0?∞)(h)8．37±4．09a6．64±2．86K21(h)0．67±0．170．88±0．23K10(h)0．28±0．130．59±0．17K12(h)0．30±0．150．06±0．04

a:P<0.01，與益肝靈片比較。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定大鼠血漿中水飛薊賓的方法，按照AIC最小原則[10]，確定水飛薊素PLGA腸溶納米粒大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程符合二室模型，權(quán)重為1/C2，計(jì)算得到其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax=(2 255.84±315.44) mg/mL，t1/2β=(13.85±2.29)h，較市售水飛薊素片(益肝靈片)明顯提高，相對(duì)生物利用度F=(AUC自制納米粒/D自制納米粒)/(AUC市售制劑/D市售制劑)為126%，表明將水飛薊素制備成PLGA腸溶納米粒后，口服吸收得到很大改善，且在檢測(cè)過程中顯示，市售水飛薊素片(益肝靈片)給藥后，24 h未能從血漿中檢測(cè)出水飛薊賓，而水飛薊素PLGA腸溶納米粒仍能檢測(cè)到活性成分，表明市售制劑相對(duì)于自制水飛薊素PLGA腸溶納米粒消除更快。

分析其原因可能如下：(1)水飛薊素制成PLGA腸溶納米粒后，平均粒徑減小，比表面積增大[11]，提升了與腸道接觸的機(jī)會(huì)；同時(shí)由于納米粒的強(qiáng)黏附性，有利于延長藥物滯留時(shí)間，提高藥物口服吸收生物利用度[12-14]。(2)以納米粒作為載體，改善了藥物溶解、潤濕狀況，且文獻(xiàn)報(bào)道表明，口服納米?？赏ㄟ^腸道內(nèi)集合淋巴結(jié)(約占整個(gè)腸道黏膜的25%)[15-16]的微褶皺細(xì)胞(M細(xì)胞)吞噬，隨淋巴細(xì)胞通過淋巴管從淋巴循環(huán)進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮療效[17]。

[1]肖衍宇，宋赟梅，陳志鵬,等.水飛薊素前體脂質(zhì)體的制備和大鼠藥代動(dòng)力學(xué)的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(7):758-763.

[2]Zeng QP,Liu ZH,Huang AW,et al.Preparation and characterization of silymarin synchronized-release microporous osmotic pump tablets[J].Drug Des Devel Ther,2016,10:519-531.

[3]Vargas MN,Madrigal SE,Morales GA,et al.Hepatoprotective effect of silymarin[J].World J Hepato,2014,6(3):144-149.

[4] Frank JB,Guqi W,Nguyan D,et al.SiIymarin and hepatoprotection[J].J Cent South Univ,2012,37(1):6-10.

[5] Cacciapuoti F,Scognamiglio A,Palumbo R,et al.Silymarin in non alcoholic fatty liver disease[J].World J Hepatol,2013,5(3):109-113.

[6]Kawabata Y,Wada K,Nakatani M,et a1.Formulation design for poorly water-soluble drugs based on biopharmaceutics classification system:basic approaches and practical applications[J].Int J Pharm,2011,420(1):1-10.

[7]DongW,Bodmeier R.Encapsulation of lipophilic drugs with in enteric microparticles by a novel coacervation method[J].International J Pharm,2006,326(1/2):128-138.

[8]Wang XQ,Dai XD,Chen Z,et al.Bioavailability and pharmacokinetics of Cyxlosporine A-loaded pH-sensitive nanoparticles for oral administration[J].J Controlled Release,97(3):421-429.

[9]王路軍,邱瑞桂,李建宇,等.葛根素腸溶納米粒的制備及體外釋放度研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(6):514-517.

[10]劉建平.生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011.

[11]DoaneT,BurdaC.Nanopartielemediatednon-covalentdrugdelivery[J]．AdvDrugDelivRev,2013,65(5)：607-621.

[12]富天驕,劉建平,金方,等.胃腸道滯留型微粒釋藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2006,37(3):201-205.

[13]Woodley J.Bioadhesion:possibilities for drug administration[J].Clin Pharmacokinet,2001,40(2):77-84.

[14]Ma Y,He S,Ma X,et al.Silymarin-Loaded Nanoparticles Based on Stearic Acid-Modified Bletilla striata Polysaccharide for Hepatic Targeting[J].Molecules,2016,21(3):265.

[15]王緒兵,易以木.納米粒胃腸道吸收影響因素[J].中國藥學(xué)雜志,2002,37(7):484-487.

[16] Lavelle EC,Sharif S,Thomas NW,et al.The importance of gastrointestinal uptake of particles in the design of oral delivery systems[J].Adv Drug Del Rev,1995,18(1):5.

[17]黃雅潔,李雅彬,袁海龍,等.南五味子總木脂素腸溶納米粒的制備和藥代動(dòng)力學(xué)初步研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(9):1046-1050.

Pharmacokinetics of enteric coated silymarin-PLGA nanoparticles in rats

QiuYanchuan1,ZhongLing2,XingYuzheng1,YangZongqin1,ZhuZhaojing1,HeJing1△

(1.ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing400016,China;2.ChongqingYaopharmaPharmaceuticalCo.Ltd.,Chongqing401121,China)

silymarin；silybin；pharmacokinetics

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(cstc2012gg-yyis10008)。 作者簡(jiǎn)介：邱妍川(1982-)，講師，碩士，主要從事藥物制劑研究。△

R945

A

1671-8348(2016)28-3910-03

2016-06-08

2016-07-09)