韓燕　馬登超　劉譯陽　崔鳳　孫秀芹　李榮沖　萬書波　李國衛(wèi)

摘要：以魯花14、Tifrunner和四粒紅為親本通過正、反交獲得的雜種F₁代群體為材料，結(jié)合親本間特異性單核苷酸多態(tài)性（single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點，建立起一套利用限制性內(nèi)切酶酶切方法鑒定花生雜交F₁，代真假雜種的技術(shù)。結(jié)果表明，真雜種表現(xiàn)出父、母本帶型，而假雜種只表現(xiàn)出母本帶型；4個組合中F₁代真雜種率為10.5%～36.7%。因此，該技術(shù)能夠有效應(yīng)用于花生雜交F₁代的真假雜種鑒定。

關(guān)鍵詞：花生；SNP；雜種鑒定；限制性內(nèi)切酶

中圖分類號：S565.2+Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0014-04

花生（Arachis hypogaea L.）也稱作長生果，是我國重要的農(nóng)作物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價值。通過雜交育種將優(yōu)良基因?qū)朐耘嗷ㄉ腔ㄉ耘喾N改良的主要手段。但是，目前有關(guān)花生真假雜種鑒別的途徑較為繁瑣，形態(tài)表型觀察仍是花生雜種真?zhèn)舞b別的主要方法。然而由于花生品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，形態(tài)表型差異較小，通過形態(tài)表型鑒別真假雜種難度較大，并且有較多的假陽性。在基因組序列未知的條件下，利用人們已開發(fā)出的多種分子標(biāo)記如SSR、Ah-MITE1等，對雜種后代進(jìn)行鑒定，得到了廣泛地應(yīng)用。

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polynor-phisms，SNP）是指由于單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。SNP在基因組位點上呈現(xiàn)為單個核苷酸的變化，多發(fā)生在T和C之間。SNP在技術(shù)上有著較大的比較優(yōu)勢，它能夠穩(wěn)定地存在于生物體的整個基因組中，突變率低，在遺傳上常呈現(xiàn)惰性和顯性；此外，SNP能夠分辨等位基因上的差異，簡單地對基因進(jìn)行分型，從而擺脫了電泳分型的瓶頸。在此基礎(chǔ)上，SNP成為繼RFLP和SSR后發(fā)展起來的第三代遺傳標(biāo)記，被廣泛運用在動植物性狀的關(guān)聯(lián)性研究中。在花生中，Zhou等利用簡化基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的SNP位點，構(gòu)建了花生基于高密度SNP的遺傳圖譜。Chopra等利用下一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定了市場上四類花生品種的SNP，結(jié)果顯示SNP可被有效用為分子標(biāo)記來鑒定花生品種資源。

本研究旨在建立一套利用不同花生品種問存在的SNP位點，根據(jù)其多態(tài)性選取合適的酶切位點，設(shè)計開發(fā)有效引物，擴(kuò)增片段，利用上述酶切位點進(jìn)行酶切驗證，根據(jù)其片段的多態(tài)性來簡便、有效地鑒定花生F₁代真假雜種的鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以早熟直立大花生品種魯花14、匍匐型品種Tifrunner與四粒紅品種及以其作為親本正反交得到的F₁代群體為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取花生基因組DNA。取新鮮幼嫩的葉片約0.5g，用液氮研磨成粉狀；加入0.5mL65℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液（使用前加入2%β-巰基乙醇），充分混合，65℃水浴30min，期間搖動數(shù)次，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的酚+氯仿+異戊醇（25：24：1），緩慢顛倒混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的氯仿充分混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的冰凍異丙醇，置于-200℃冰箱中30min；12000r/min離心10min，棄上清液；用800μL70%乙醇漂洗2次，風(fēng)干；用50μL無菌水溶解DNA，置于-200℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序 PCR擴(kuò)增體系（20μL）：正、反向引物（10μmol/L）各0.6μL，10×Buffer2μL，dNTPs（2mmol/L）2μL，MgSO₄（25mmol/L）1.2μL，KOD酶（1U/μL）0.4μL，50ngDNA模板1tμL，ddH₂O12.2μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測及回收 將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進(jìn)行水平電泳，電泳電壓130V，時間15min。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。

在紫外光下對照Marker觀察電泳結(jié)果，用干凈的小刀從膠板上切下目的條帶。使用Axygen瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒對目的DNA片段進(jìn)行回收與純化，方法詳見說明書。

1.2.4 F₁代雜種鑒定 對上述純化目的DNA片段進(jìn)行酶切反應(yīng)（10μL）：膠回收產(chǎn)物5μL、限制性內(nèi)切酶Hindm0.3μL、10×M Buffer（M Buffer為內(nèi)切酶對應(yīng)的Buffer）1μL、ddH₂O 3.7μL。37℃酶切5h。電泳觀察酶切片段的位置和大小。

酶切條帶表現(xiàn)為父母本雜合帶型的F₁代植株為真雜種，僅含有母本條帶的為假雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間SNP位點篩選及引物設(shè)計

利用對魯花14、Tifrunner及四粒紅高通量測序及SNP分析的結(jié)果，從花生基因組中選取一段序列，該段序列中含有特異的SNP位點（圖1），該位點在魯花14與Tifrunner中表現(xiàn)為胞嘧啶（C），而在四粒紅中則突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）。該SNP位點前后6個堿基恰好為限制性內(nèi)切酶HindⅢ所能識別的酶切位點AAGCTT，而在四粒紅中則由于突變?yōu)門不能被HindⅢ識別。

以此段序列為模板，在其兩端設(shè)計正向引物TTTGCCAAGAGTACAAGCACA、反向引物CG-CAAGTAGTITCGCAAATG，該引物擴(kuò)增目的片段大小為755bp。

2.2 DNA質(zhì)量及產(chǎn)物特異性檢測

由于花生葉片中含有較多的次生代謝物及糖類雜質(zhì)，本試驗在CTAB使用前加入2%β-巰基乙醇可有效地防止次生代謝物質(zhì)使DNA變色，同時在抽提的過程中多使用一次氯仿可以有效去除葉片中的蛋白質(zhì)，從而得到雜質(zhì)較少的DNA（圖2A）。以此DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，可有效、特異地擴(kuò)增出目的條帶（圖2B）。

2.3 F₁代真假雜種鑒定

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ分別對4個雜交組合的F₁代擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，部分材料的鑒定結(jié)果見圖3。魯花14、Tifrunner與四粒紅雜交組合的F₁代后代中，由于從魯花14或Tifrun-ner基因組序列獲得的片段具有HindⅢ的識別位點，因而擴(kuò)增產(chǎn)物能夠切出395bp和362bp兩條片段，兩條片段大小非常相近，故電泳只顯示為一條帶；而從四粒紅基因組獲得的片段不具有HindⅢ識別序列，故只有一條755bp的帶。因此，真雜種具有父母本的帶型，電泳顯示為兩條帶，而假雜種僅表現(xiàn)出母本的帶型，電泳顯示為一條帶。統(tǒng)計并計算各雜交組合的真雜種率（表1），魯花14與四粒紅正、反交組合的真雜種率分別為10.5%與25.9%，低于Tifrunner與四粒紅正、反交組合的真雜種率。

3 結(jié)論與討論

目前，花生真假雜種的鑒定往往采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合DNA分子標(biāo)記技術(shù)。DNA分子標(biāo)記雖然具有多態(tài)性高、檢測靈敏等優(yōu)點，然而利用分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定時，對DNA的質(zhì)量要求較高，需要開發(fā)篩選多對引物，因此鑒定過程較為繁瑣，不利于大規(guī)模的后代鑒定。本研究采用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法，開發(fā)出有效的SNP位點，首次鑒定了四粒紅與魯花14、Tifrunner的雜交后代。該方法既能快速有效、省時省力地鑒定花生基因型及真假雜種，又可為建立花生連鎖圖譜做準(zhǔn)備，具有潛在的應(yīng)用價值，為高效利用花生種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。