和東陽(yáng)，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

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高效液相色譜法測(cè)定三七藥材中硝酸鹽含量

和東陽(yáng)，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

高效液相色譜；三七藥材；硝酸鹽；含量測(cè)定

眾所周知，日攝入硝酸鹽含量超過(guò)正常負(fù)荷時(shí)，將會(huì)危害人體健康[1]，但硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境中，為植物天然成分之一[1]。硝酸鹽在人體內(nèi)還原成亞硝酸鹽后，如果累積量過(guò)多，可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，還可與人體內(nèi)的胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成強(qiáng)力致癌物質(zhì)，誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[2-3]。目前常用酚二磺酸法、鎘柱還原分光光度法、紫外分光光度法、離子色譜等方法來(lái)測(cè)定硝酸鹽含量。本文采用高效液相色譜法，選擇四丁基溴化銨作為離子對(duì)試劑，利用四丁基溴化銨與硝酸根陰離子形成中性締合物，在乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀-磷酸溶液為流動(dòng)相中，被非極性鍵合柱(ODS)分離并定量測(cè)定。

1 儀器、試劑和藥材

1.1 儀 器

E2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)，美國(guó)Waters；AG285型電子天平，瑞典METTLER TOLEDO公司；Milli-Q Advantage A10制水機(jī)，XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試劑和藥材

硝酸鹽對(duì)照品溶液(BW3058，1000 mg/L)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇、乙腈均為色譜純(默克)、硼酸鈉(AR)，天津市化學(xué)試劑三廠；磷酸二氫鉀(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸(AR)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；四丁基溴化銨(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑三廠；水為超純水，美國(guó)Milli-Q公司。

三七藥材，均由文山三七花公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Utimate pheny1-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+0.03 mmol/L四丁基溴化銨+磷酸(稱取6.8045 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入0.944 g四丁基溴化銨，再用磷酸調(diào)pH=3.2)=10:90；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密吸取硝酸鹽對(duì)照品溶液(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，BW3058，1000 mg/L)1.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，在逐級(jí)稀釋至C=0.005 mg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取三七粗粉5.0 g加入5.0 mL超純水于100 mL燒杯中，用玻璃棒攪拌制成勻漿，再往燒杯中加入12.5 mL硼砂飽和液攪拌均勻，以70 ℃左右的水約150 mL將試樣轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，于沸水浴中加熱20 min，取出后冷卻至室溫，然后加超純水至刻度，搖勻，靜置片刻。再經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)取濾液，待測(cè)。

2.2.3 空白溶液的制備

直接往250 mL容量瓶中加入70 ℃左右的超純水約150 mL再加入12.5 mL硼砂飽和液搖勻，于沸水浴中加熱20 min，取出后冷卻至室溫，然后加超純水至刻度，搖勻，靜置片刻。再經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)取濾液，待測(cè)。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備對(duì)照品溶液、供試品溶液、供試品溶液+對(duì)照品溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液色譜在相同的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，而空白溶液無(wú)此峰出現(xiàn)，表明三七藥材的其他成分對(duì)硝酸鹽成分的含量測(cè)定無(wú)干擾。另取硝酸鹽對(duì)照品適量加入供試品溶液中，搖勻，照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所得色譜圖中，硝酸鹽峰面積明顯增大，其它色譜峰面積變化不大，比較對(duì)應(yīng)色譜峰的吸收光譜，具一致性，說(shuō)明該色譜峰為硝酸鹽的信號(hào)。

圖1 系統(tǒng)適用性

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液配制并逐級(jí)稀釋配制成一系列濃度的對(duì)照品溶液(見(jiàn)表1)，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算得回歸方程見(jiàn)為y=14637841.30x+84017 (r=0.9999)，對(duì)照品含量5～500 μg范圍峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

2.5 檢測(cè)限及定量限

取上述儲(chǔ)備液用超純水稀釋配制成一系列濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，以信噪比3倍和10倍作為指標(biāo)，考察硝酸鹽含量的檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 硝酸鹽含量的檢測(cè)限和定量限

2.6 精密度試驗(yàn)

取配制好的硝酸鹽對(duì)照品溶液(0.005 mg/mL)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果，以峰面積計(jì)算，峰面積平均值為832706.7，RSD=1.3%(n=6)，結(jié)果表明本法儀器精密度較為良好。

2.7 樣品重復(fù)性

精密稱取同一批次三七藥材(批號(hào)：20150426)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果，三七藥材中硝酸鹽的平均含量為187.6 μg/g(RSD=1.5%)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份三七藥材(批號(hào)：20150426)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，結(jié)果，平均峰面積為885362.3，RSD=1.4%(n=7)，表明供試品溶液中硝酸鹽在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取同一批次已知含量供試品9份(已測(cè)硝酸鹽平均含量為187.6 μg/g，每份約2.5 g，對(duì)照品硝酸鹽堿濃度0.1 mg/mL)，然后按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法同法處理，將處理好的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算平均回收率為100.2%，RSD=1.6% (n=9)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

取6個(gè)不同批次三七藥材，按“2.2”供試品溶液制備法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討 論

本法應(yīng)用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定三七中硝酸鹽的含量，不需要經(jīng)過(guò)鎘柱還原，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，三七中其它成分對(duì)其檢測(cè)均不形成干擾。此外，色譜條件的選擇上，筆者曾比較了甲醇-水、 甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，雖分離度都能達(dá)到要求，但在同一色譜柱上甲醇-乙腈-水柱壓較低，保留時(shí)間適當(dāng)，峰形更好。對(duì)已具備了高效液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室，本方法擴(kuò)展了儀器的檢測(cè)范圍，并且大大提高工作效率，值得推廣使用，同時(shí)本法也適用于其他藥材及產(chǎn)品的硝酸鹽含量測(cè)定。

[1] 楊華梅.反相高效液相色譜法測(cè)定蔬菜鮮樣中硝酸鹽[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008, 35(3):543-544.

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Determination of Nitrate Content in Panax Notoginseng by HPLC

HEDong-yang,NIUYan-fei,XUYi,QINBo,YOUYan

(Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Baoyao Group Innovation and R&D Center, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, Yunnan Kunming 650111, China)

The determination of the nitrate content in Panax notoginseng by HPLC was discussed. The separation was performed with tetrabutyl ammonium (TBABr) dissolved in acetonitrile-0.05 mol/L monopotassium phosphate (KH2PO4) (10:90) buffer as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and accomplished with utimate phenyl-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm) column at 30 ℃. The detection wavelength was 216 nm and the injection volume was 10 μL. Under the detection conditions, the nitrate content in Panax notoginseng showed good linearity(r=0.9998). The recovery rate was 100.2%(n=9), RSD=1.6%(n=9). This method is simple, rapid, accurate, reliable and reproducible. It is suitable for detecting various contents of nitrate in Panax notoginseng.

high performance liquid chromatography; Panax notoginseng; nitrate; content determination

和東陽(yáng)(1987-)，男，碩士，助理工程師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂。

游燕(1976-)，女，高級(jí)工程師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂。

R927.2

A

1001-9677(2016)020-0090-03