盧秋榕,韋迎春,黎 慧,曾雪霞,李 梅

(右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 百色 533000)

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熒光分析法測定芒果葉總黃酮含量的研究*

盧秋榕,韋迎春,黎 慧,曾雪霞,李 梅

(右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 百色 533000)

采用熒光分析法測定芒果葉中總黃酮含量。根據(jù)Al3+與黃酮類化合物形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，以蘆丁為標(biāo)樣，采用低共熔溶劑作為提取溶劑，對芒果葉總黃酮進(jìn)行微波輔助提取，選擇激發(fā)波長λex=436 nm、發(fā)射波長λem=483 nm條件下，測定四種品種的芒果葉中總黃酮含量。該方法檢測限為0.12 μg/mL，線性范圍在0.16～0.80 μg/mL之間，線性方程為：y=11.41+1789.2x，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9989，回收率為97.2%～102.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為1.39%。熒光分光光度法測定芒果葉中總黃酮含量準(zhǔn)確度較高，操作簡便，成本低。

芒果葉；總黃酮；熒光光譜法

有“果王”之稱的芒果屬漆樹科植物，其色、香、味、形極佳，是五大熱帶名果之一[1]，也是熱帶亞熱帶地區(qū)常用于出口的水果之一[2-3]。芒果葉富含黃酮類化合物、槲皮素、芒果苷、異芒果苷、抗壞血酸、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分[3-4]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抗血管增生、消炎、抗變應(yīng)性、和抗病毒等藥理作用[5-8]，許多以黃酮類成分為主的制劑已作為成藥上市。目前，作為主要原料芒果葉部分已用于生產(chǎn)中成藥芒果止咳片[9]，然而芒果葉資源尚未得到充分的利用與開發(fā)。因此，對芒果葉中主要的黃酮類成分進(jìn)行研究有著更深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義與應(yīng)用前景。

對芒果葉中總黃酮的質(zhì)量控制研究有利于芒果葉的質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性，確保臨床用藥的安全性和有效性。分光光度法根據(jù)黃酮與Al3+形成穩(wěn)定的配合物，產(chǎn)生特征的吸收光譜而進(jìn)行測定。由于芒果葉中成分比較復(fù)雜，其中可能含有的酚類物質(zhì)，對吸光度值的測定產(chǎn)生干擾，進(jìn)而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[10-11]。本文根據(jù)黃酮類化合物與Al3+形成穩(wěn)定的熒光配合物，用熒光光度法測定總黃酮的含量[12-14]。該方法操作簡便，成本低，準(zhǔn)確、靈敏度高，具有良好的分析應(yīng)用前景，廣泛用于植物中總黃酮含量的測定具有潛在的應(yīng)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器

XH-100A微波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司； RF-5301PC熒光分光光度計(jì)，日本津島；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9240電熱鼓風(fēng)干燥箱；HP-01D無油真空泵，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；普力菲爾FST-III-20純水機(jī)；BSBT223S型電子天平；XS205DU十萬分之一天平；NNJ-100萬能粉碎機(jī)，浙江省永康市景雄不銹鋼制品、PHSJ-4F pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.1.2 樣品與試劑

芒果葉，采摘于廣西百色市田東縣農(nóng)場，經(jīng)鑒定為漆樹科植物芒果的葉。洗凈，于65 ℃烘干，粉碎過80目篩，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；氯化膽堿、氯化銅二水、氯化鐵四水，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙二醇、乳酸，成都市科龍化工試劑廠；乙醇，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；蔗糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘油，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；檸檬酸，天津市化學(xué)試劑供銷公司；硝酸鋁、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、醋酸、醋酸鈉，汕頭市西隴化工有限公司，以上所用的試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配置

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：精密稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶液溶解，并定容至50 mL，配置成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mL，分別加入12.5%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，pH=3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液0.25 mL，用60%的乙醇溶液定容至2.5 mL，搖勻，即配制得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液的制備：采用含水量30%、摩爾比1:3、固液比1:90 g/mL的氯化膽堿/乙二醇體系為提取溶劑，按照微波提取工藝參數(shù)：功率為500 W、提取溫度為65 ℃、提取時(shí)間為10 min，對芒果葉總黃酮進(jìn)行微波輔助提取。經(jīng)抽濾后，取0.10 mL的提取液，加入12.5%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，pH=3.8 的醋酸-醋酸鈉緩沖液0.25 mL，用提取溶劑定容至2.5 mL，搖勻，即配制得樣品溶液。

1.2.2 總黃酮含量的熒光檢測條件

選擇激發(fā)光譜通帶3 nm，發(fā)射光譜通帶5 nm，激發(fā)波長λex=436 nm，發(fā)射波長λem=483 nm，并在此條件下測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度，以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在此相同的條件下測定提取的樣品總黃酮的熒光強(qiáng)度，再用回歸方程求取含量。

1.2.3 芒果葉總黃酮提取率的計(jì)算

式中：X——樣品液所測吸光值所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線上的濃度，μg/mL

V0——定容的樣品液體積，此處為50 mL

V1——測吸光值時(shí)所吸取樣品液的體積，此處為0.1 mL

V2——測吸光值時(shí)的樣品液體積，此處為2.5 mL

m——芒果葉重量，mg

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光化合物的激發(fā)及發(fā)射光譜

圖1 熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

根據(jù)上述的光譜掃描條件，對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行激發(fā)及發(fā)射光譜掃描。激發(fā)及發(fā)射光譜如圖1所示，本文選擇的激發(fā)光譜為 436 nm，發(fā)射光譜為483 nm。

2.2 熒光測定條件的優(yōu)化

2.2.1 硝酸鋁的加入量

黃酮類化合物與Al3+可生成穩(wěn)定的熒光配合物，本實(shí)驗(yàn)分別對用量為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15%的Al(NO3)3溶液0.5 mL進(jìn)行了考察，加入12.5% AlCl3溶液0.5 mL時(shí)熒光強(qiáng)度最大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇12.5%的Al(NO3)3，加入量為0.5 mL。

2.2.2 pH值的影響

pH值影響配合物的形成和熒光強(qiáng)度。溶液呈酸性時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度較大，本實(shí)驗(yàn)對pH 3.8～6.2進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)pH為3.8時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度值最大，因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH=3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液。

2.2.3 靜置時(shí)間的影響

在不同的時(shí)間5、10、15、20、30 min分別測定蘆丁對照品溶液的熒光強(qiáng)度。10 min后溶液的熒光強(qiáng)度有平緩下降趨勢，綜合考慮樣品制備時(shí)間，因此，選擇反應(yīng)10 min為最佳的測定時(shí)間。

2.2.4 金屬離子的干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)對一些常見的金屬離子進(jìn)行了干擾測定。結(jié)果表明，溶液中加入100倍的Ca2+、Mg2+、K+對總黃酮的測定無影響，然而100倍的Fe3+、Cu2+對測定有干擾。

2.3 校準(zhǔn)曲線及方法的檢出限

在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下，按實(shí)驗(yàn)方法測定了蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，溶液的熒光強(qiáng)度與蘆丁濃度在0.16～0.80 μg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9989，線性回歸方程為y=11.41+1789.2x，式中：y為熒光強(qiáng)度，x為蘆丁的濃度(μg/mL)。方法的檢出限(3σ，σ=S0/S，S0為空白溶液多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)為0.12 μg/mL。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品測定及回收率實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)方法測定百色地區(qū)產(chǎn)的四種芒果葉中的總黃酮含量，對提取的樣品溶液進(jìn)行平行測定(n=3)，結(jié)果如表1所示。

往經(jīng)處理后的桂七芒果葉樣品溶液中加入不同濃度的蘆丁對照品，計(jì)算其回收率，其結(jié)果如表2所示。由表2可知，本方法測定桂七芒果葉中總黃酮含量的平均回收率在97.2%%～102.5%之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確，說明本方法可行。

表1 四種品種芒果葉總黃酮含量

表2 桂七芒果葉樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

廣西百色地區(qū)盛產(chǎn)芒果，芒果樹種植廣泛，而芒果葉中含有豐富的黃酮類化合物，因此,芒果葉具有良好的開發(fā)和利用價(jià)值。

本研究以百色地區(qū)產(chǎn)芒果葉為原料，利用微波輔助低共熔溶劑提取芒果葉的總黃酮，通過熒光分光光度法測定芒果葉中總黃酮的含量，排除了芒果葉中可能含有的酚類物質(zhì)直接用鋁離子顯色分光光度法測定總黃酮的干擾，方法準(zhǔn)確度和精密度均較高，線性關(guān)系和重現(xiàn)性較好，操作簡便，分析成本低，具有良好的潛在的分析應(yīng)用前景。

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Determination of Total Flavanoid in Leaves of Mango by Spectrofluorimetry*

LUQiu-rong,WEIYing-chun,LIHui,ZENGXue-xia,LIMei

(Pharmaceutical College,Youjiang Medical University for Nationalities,Guangxi Baise 533000, China)

A method of determining total flavone in leaves of mango by spectrofluormietry was established. Taking rutin as standard sample and using deep eutectic solvents(DESs) as extractic solvents and microwave-assisted extraction of total flavonoids from leaves of mango, total flavanoid content leaves of various mango was determined by spectrofluormietry at the excitation wavelength of 436 nm and the emission wavelength of 483 nm. The detection limit was 0.12 mg/mL, in the linear range of 0.16 and 0.80 mg/mL with the regression equation of y=11.41+1789.2x, correlativity was 0.9989, RSD was 1.39%. The method of determining the total flavone content in leaves of mango by fluorescence spectrofluormietry had high accuracy, and it was easy to operate with low cost.

leaves of mango; total flavonoid; spectrofluorimetry

廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(NO: xzdsysyy2015309)； 2016年度廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(NO: 201610599029)。

盧秋榕(1995-)，女，學(xué)生，主要研究方向：藥物分析與檢測。

李梅。

O657.3

A

1001-9677(2016)020-0085-03