王 會

(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)系，河南 鄭州 450042)

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表征天然抗氧化劑活性的方法

王 會

(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)系，河南 鄭州 450042)

抗氧化劑能使含有油脂或脂肪的食品保質(zhì)期延長，保持其營養(yǎng)質(zhì)量和風(fēng)味；對人體內(nèi)因過氧自由基引起的氧化損傷有調(diào)節(jié)作用，對人類的健康有益。因此，從蔬菜、水果、草藥等植物中尋找天然抗氧化劑并對其活性加以表征成為研究的熱點(diǎn)。本文在脂質(zhì)氧化機(jī)理的基礎(chǔ)上討論了抗氧化劑的作用機(jī)理，并以此為依據(jù)總結(jié)、概括了四類用于表征天然植物抗氧化劑活性的方法。

抗氧化劑；抗氧化活性；表征方法

氧化在人體和食品中的重要性已被普遍認(rèn)可。氧化代謝是細(xì)胞生存的本質(zhì)，其副作用是生成自由基和活性氧。過量的自由基破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞呼吸作用中斷；活性氧造成人體的氧化損傷。這些反應(yīng)能加速老化，在癌癥、心臟病等疾病中起重要作用。氧化是食品變質(zhì)的主要原因之一，氧化造成食品酸敗，導(dǎo)致營養(yǎng)品質(zhì)、色澤、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和安全的降低。

近年來，植物來源的食品和飲料(如水果、茶、紅葡萄酒等)及草藥等對人類健康的有益影響引起人們的廣泛關(guān)注，主要是因?yàn)槠渌械奶烊豢寡趸瘎?。因此，從植物中篩選出具有活性的物質(zhì)并加以表征成為研究的熱點(diǎn)。

抗氧化劑能修復(fù)過氧自由基對人體的損傷，延長含脂食品的保質(zhì)期及營養(yǎng)質(zhì)量，因此測量、表征抗氧化劑活性的方法就分為在人體內(nèi)和在食品體系中兩類。本文只討論在食品中測定和表征抗氧化劑的方法。

1 抗氧化劑的作用機(jī)理

脂質(zhì)氧化是造成食品變質(zhì)的主要原因之一。脂質(zhì)的氧化主要是自動氧化，自動氧化是一個(gè)自由基鏈反應(yīng)，其反應(yīng)過程如下[1]：

引發(fā)：

傳播：

終止：

LH是被氧化的含有不飽和鍵的脂質(zhì)底物，H是雙鍵旁亞甲基上最活潑的氫原子，M為過渡金屬離子，X·為未知自由基。

抗氧化劑AH與脂質(zhì)自由基L·反應(yīng)，延緩或抑制自由基鏈反應(yīng)的引發(fā)(發(fā)生)；與脂質(zhì)過氧自由基LOO·或脂質(zhì)自由基LO·反應(yīng)，抑制鏈反應(yīng)的傳播：

抗氧化劑自由基A·也可與與LOO·或LO·反應(yīng)，生成LOOA、LOA，從而進(jìn)一步阻止鏈傳播反應(yīng)的進(jìn)行：

此外，AH也可與M3+作用，阻止鏈的引發(fā)。

因此，抗氧化劑的活性的表征主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：

2 表征抗氧化劑的方法

2.1 抑制脂質(zhì)過氧化的方法

該法是建議使用的最佳表征方法。脂質(zhì)氧化涉及到反應(yīng)物、氧化的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。通過添加被測物質(zhì)，氧化過程中反應(yīng)物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物出現(xiàn)的時(shí)間長短或數(shù)量減少，表明被測物具有抗氧化活性。

氧化反應(yīng)的底物一般常使用純的甘三酯、植物油、魚油或豬油，也有使用磷脂或脂蛋白、海產(chǎn)油、多不飽和脂肪酸(如亞油酸)作為底物的[2]。氧化反應(yīng)的底物在使用過程中常被制成(水)膠束和反膠束體系或用有機(jī)溶劑溶解。這些常用的底物大多是混合物，且不同實(shí)驗(yàn)中選用的底物往往不同，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性一般較差。另外，有些含有VE等抗氧化劑的植物油因自身所含有的抗氧化活性成分也可能會干擾測定。因此，進(jìn)行抗氧化活性表征時(shí)應(yīng)根據(jù)具體的測試方法選擇合適的反應(yīng)物和測試體系。

在常溫條件下，食品中脂質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)行得很慢；在測定抗氧化劑活性時(shí)，因?yàn)榭寡趸瘎┑奶砑樱沟弥|(zhì)氧化反應(yīng)的進(jìn)行變得更慢[2]。因此，在表征抗氧化活性時(shí)，常要加速氧化反應(yīng)的進(jìn)行，比較常用的加速氧化的方法有升溫或增加氧濃度，如烘箱法、活性氧法、Rancimat法、OSI法。但是，人為加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)的進(jìn)行與食品自動氧化變質(zhì)的反應(yīng)條件不同，而且高溫可能改變氧化反應(yīng)機(jī)理，用加速氧化的方法表征的抗氧化活性有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果[2]。近年來也常用自由基引發(fā)劑加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)，最常用的是具有熱不穩(wěn)定性的偶氮化合物，其中水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN用得最多[2]。但偶氮化合物加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)時(shí)，抗氧化劑的活性主要體現(xiàn)在其供氫快慢上。而且有些抗氧化劑除其自身有活性外，其被氧化后的產(chǎn)物也具有抑制自由基的作用，在表征抗氧化活性時(shí)如果不考慮這一點(diǎn)，也可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。此外，加速氧化的方法還有使用Fe3+或Cu2+等過渡金屬離子、光照(如紫外光)。但是光照引起脂質(zhì)氧化的機(jī)理與上述的氧化機(jī)理不同，因此這種方法不常用[2]。

測定脂質(zhì)氧化過程中反應(yīng)物、中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的量的變化的方法很多[2]，主要有：

(1)化學(xué)法：過氧化值、碘值、酸值、TBARS法、羰基化合物、克雷斯試驗(yàn)和茴香胺值；

(2)物理法：粘度、顏色、共軛二烯含量、折光指數(shù)、介電常數(shù)的測定；紅外光譜法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用；測不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率(C18:2/C16:0)、聚合物的含量、極性脂類的含量；測量體系中氧的減少造成壓力變化的氧壓法、測量氧消耗的氧電極法、測量底物中不飽和脂肪酸的減少以及氧化后底物的增重等方法。

在這些方法中，以過氧化值、共軛二烯含量、TBARS法和氣相色譜法最為常用。各種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際測定中將各種方法結(jié)合使用。

2.2 清除人工生成的自由基的方法

用人工合成的自由基替代脂質(zhì)氧化生成的自由基來測定抗氧化劑的活性也是目前廣泛采用的方法。根據(jù)被測物清除自由基能力的強(qiáng)弱，確定其抗氧化活性的高低。常用的人工合成的自由基有[2-4]：

(1)ABTS+·：ABTS [2, 2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt]在K2S2O8、MnO2、ABAP或H2O2等氧化劑作用下生成的藍(lán)綠色的自由基陽離子，相當(dāng)穩(wěn)定，在414、645、734和805nm處有最大吸收峰；

(2)DMPD+·：DMPD(N, N-dimethyl-p-phenylenediamine) 在酸性條件下被ABAP、FeCl3、CuCl2或H2O2等氧化，生成的穩(wěn)定的自由基陽離子，它在505nm處有最大吸收峰；

(3)DPPH· (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl)是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在515 nm處有最大吸收；

(4)Fremy自由基(potassium nitrosodisulphonate，五硫化二鉀)；

(5)galvinoxyl自由基量[2,6-di-tert-butyl-a-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy]。

在抗氧化劑的作用下，ABTS+·、DMPD+·和DPPH·的濃度降低，吸光度減小，吸光度的減少可用分光光度計(jì)測定；而Fremy自由基和galvinoxyl自由基濃度的降低可用電子自旋共振-ESR儀測定。根據(jù)吸光度的變化和自由基濃度的變化就可測定抗氧化劑的活性。在這幾種自由基中，ABTS+·和DPPH·使用最廣。

人工合成的自由基的最大不足之處在于其穩(wěn)定，存在的時(shí)間長。生物體或食品中的自由基存在的時(shí)間短，大多存在幾秒甚至是不足1 s，而人工合成的自由基往往存在幾小時(shí)甚至是幾天或更久，用它們代替因氧化而生成的自由基，與抗氧化劑實(shí)際抗氧化活性起作用的環(huán)境不同，所以在實(shí)驗(yàn)中測得的具有抗氧化活性的抗氧化劑，在真實(shí)的食品或生物體系中有無活性，還需要做具體實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

2.3 測定抗氧化劑還原能力的方法

金屬離子是氧化的催化劑，抗氧化劑能螯合金屬，分解過氧化物，從而在氧化發(fā)生前中止自由基引發(fā)的氧化。因此，抗氧化劑抗氧化活性的高低還可以通過其還原能力的強(qiáng)弱來表示。常用的測定方法有[5]：

(1)FRAP(ferric ion reducing antioxidant power，鐵離子還原抗氧化能力)法；

(2)CUPRAC法(Copper Reduction Assay,銅還原法)；

(3)FC(Folin-Ciocalteu，福林酚)法；

(4)CV(Cyclic Voltammetry，循環(huán)伏安)法；

FRAP法是在酸性介質(zhì)中抗氧化劑將Fe3+-TPTZ (2,4,6-tripyridyltriazine，2,4,6-三吡啶三嗪)絡(luò)合物還原成深藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，其在593 nm吸光度增加，表明其抗氧化活性的強(qiáng)弱。但此法測得的只是還原Fe3+的能力，不一定反映抗氧化活性，且不能測量含有巰基的抗氧化劑如谷胱甘肽。

CUPRAC法用Cu而不是用Fe，抗氧化劑將Cu2+還原為Cu+。Cu+與顯色劑結(jié)合，生成在某一波長處有最大吸收的物質(zhì)。顯色劑有兩種，在Bioxytech AOP-490法中，顯色試劑bathocuproine (2,9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)與Cu+形成在490 nm處有最大吸收的絡(luò)合物；另一種顯色劑neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline)與Cu+的絡(luò)合物在450 nm有吸收。對于抗氧化測定，銅優(yōu)于鐵，且銅反應(yīng)比鐵快。

CV法的原理如下：樣品放入裝有工作電極(玻璃化碳電極)、參比電極(Ag/AgCl)和輔助電極(鉑線)的測試皿中。測定時(shí)，記錄電壓電流曲線(即循環(huán)伏安圖)。樣品的還原能力由峰電位和陽極電流兩個(gè)參數(shù)組成。峰電位由被測物的氧化還原性質(zhì)決定，電流值表示這種化合物的數(shù)量。CV法是一種很有前途的方法，測得的是復(fù)雜混合物的總抗氧化能力。CV法不可逆，敏感度低，但是結(jié)果可靠，重復(fù)性好，適于比較研究。

2.4 抗氧化劑抑制自由基對底物的氧化降解的方法

此類方法的測試體系中既有底物又有自由基，但底物自身不能生成自由基，它與外源自由基反應(yīng)，形成有熒光或帶顏色的特征物質(zhì)，抗氧化劑的加入使生成的特征產(chǎn)物減少，熒光或吸光度減小，由此可測得抗氧化活性。此類方法也可以稱為競爭法，主要有[5]：

(1)ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity，氧自由基吸收能力)法；

(2)TRAP(Total Radical Trapping Antioxidant Parameter，總自由基清除抗氧化參數(shù))法；

(3)DCFH-DA(dichorofluorescin-diacetane，二氯熒光素二乙酸酯)法；

(4)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence, CL)法；

(5)β-胡蘿卜素漂白法(β-carotene bleaching test)；

(6)藏花素漂白法(crocin bleaching test)；

(7)KI法；

(8)TOSC(Total Oxyradical Scavenging Capacity，總氧自由基清除能力)法。

此類方法中最為常用的是ORAC法，此法測得的是總的抗氧化活性，可自動化、標(biāo)準(zhǔn)化。TRAP法與ORAC法類似，它也是采用藻紅蛋白(PE)為底物，不同之處在于動力學(xué)曲線以及由動力學(xué)曲線計(jì)算出的抗氧化活性。TRAP法中PE熒光的減弱與時(shí)間呈線性關(guān)系(以恒定的速率減弱)，直到熒光減弱80%；而ORAC法中熒光強(qiáng)度的減小隨時(shí)間減慢(不以恒定的速率進(jìn)行)。其他的幾種方法用得比較少，只在少數(shù)表征抗氧化活性的研究中使用。

3 結(jié) 語

在實(shí)際研究中，表征某種物質(zhì)是否具有抗氧化活性，一般選擇兩種或兩種以上的方法。通過上述方法證明某物質(zhì)具有抗氧化活性，在真實(shí)的食品體系中該物質(zhì)不一定有活性或者其活性不一定很強(qiáng)，往往需要多方面加以表征。開發(fā)通用性好、重現(xiàn)性好，與真實(shí)食品體系相似的實(shí)驗(yàn)體系是篩選和研究植物來源抗氧化劑的趨勢。

[1] 畢艷蘭. 油脂化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:62-63.

[2] 王會，郭立，謝磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測定方法(一)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(3)：92-98.

[3] 王會，周燕. 篩選和表征抗氧化劑的方法-ABTS法[J].廣州化工，2012，40(22)：41-43.

[4] 王會. 篩選和評價(jià)天然抗氧化劑的方法-DPPH法[J].廣州化工，2013，41(22)：30-32.

[5] 王會，郭立，謝磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測定方法(二)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(4)：98-102.

Methods of Evalution of Natural Antioxidant Activity

WANGHui

(Department of Pharmaceutical and Laboratory, Henan Vocational College of Applied Technology,Henan Zhenghou 450042, China)

Antioxidants can prolong the shelf life of foods containing oil or fat, and maintain their nutritional quality and flavor. Antioxidants can also regulate the oxidative damage induced by free radicals of human body, which is beneficial to human health. So it is a hot research topic to search for natural antioxidants from vegetables, fruits, herbs and other plants. The mechanism of lipid oxidation and the mechanism of the oxidation resistance action of antioxidants were discussed. Based on the mechanisms, four kinds of methods used to characterize the antioxidant activity of natural plants were reviewed.

antioxidant; antioxidant activity; evaluating methods

王會(1970-)，女，副教授，主要從事化工及相關(guān)專業(yè)的教學(xué)及科研。

TS227

A

1001-9677(2016)020-0030-03