?周曉波，吳藝飛，丁茁荑，陳立培，李世樹(shù)，黃麗萍?

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南　長(zhǎng)沙　410125；2. 湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，湖南　長(zhǎng)沙410125；3. 湖南省湘西自治州龍山縣經(jīng)濟(jì)信息局，湖南　龍山　416000）

卷丹百合3種主要病毒脫毒方法研究

周曉波1,2，吳藝飛1,2，丁茁荑1,2，陳立培3，李世樹(shù)3，黃麗萍3

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南長(zhǎng)沙410125；2. 湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410125；3. 湖南省湘西自治州龍山縣經(jīng)濟(jì)信息局，湖南龍山416000）

為了獲得無(wú)病毒的優(yōu)質(zhì)種苗，以感染CMV、LSV和LRV的卷丹百合珠芽為試材，采用熱處理、莖尖培養(yǎng)結(jié)合添加病毒唑的方法，運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)病毒，探討最適宜的脫毒方法。結(jié)果表明：對(duì)于CMV，僅通過(guò)莖尖培養(yǎng)，剝?nèi)?.1～0.3 mm大小莖尖培養(yǎng)脫毒率可達(dá)100%，但成活率僅為45%；對(duì)于LSV，38℃高溫?zé)崽幚?0 d后，剝?nèi)?.1～0.3 mm莖尖培養(yǎng)，脫毒效果最佳，可達(dá)90%以上；對(duì)于LRV，38℃高溫?zé)崽幚?0 d后，剝?nèi)?.4～0.6 mm莖尖培養(yǎng)，添加10 mg/L病毒唑可使脫毒率達(dá)90%以上。綜合3種病毒的脫毒率和成活率，以38℃高溫?zé)崽幚?0 d后，剝?nèi)?.4～0.6 mm莖尖培養(yǎng)，添加10 mg/L病毒唑，成活率較高，脫毒效果最好。

卷丹百合；病毒；脫毒方法

卷丹百合（Lilium lancifolium）屬百合科百合屬，為多年生宿根草本植物。球莖肥大，具有潤(rùn)肺止咳、補(bǔ)中益氣、寧心安神的功效[1]，食用價(jià)值和藥用價(jià)值均非常高，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。卷丹百合在湖南、安徽和江西等?。▍^(qū)）都有分布，僅湖南龍山縣常年種植面積3 400 hm2，是該縣農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一[2]。卷丹百合生產(chǎn)上多采用無(wú)性繁殖，該技術(shù)造成病毒大量累積使植株發(fā)生病毒病。主要包括百合無(wú)癥病毒（lily symptomless virus，LSV）、百合叢簇病毒（lily rosettle virus，LRV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）等[3]，病毒的侵染造成產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣，制約了百合的發(fā)展[4]。因此，當(dāng)務(wù)之急是通過(guò)生物技術(shù)手段獲得百合脫毒苗，從源頭上掐斷病毒的侵染[5]。 1962年，Phillips最早進(jìn)行百合脫毒研究，此后，很多專家相繼進(jìn)行相關(guān)研究并取得了良好進(jìn)展[7-11]。目前，僅2012年周曉波等[12]對(duì)LSV的脫毒條件進(jìn)行探索性的報(bào)道，前人的研究側(cè)重于百合的組織培養(yǎng)或單一病毒的脫毒方法研究[13-17]，脫毒效果不很理想，在大規(guī)模應(yīng)用上有一定的局限性，對(duì)卷丹百合多種病毒脫毒方法進(jìn)行系統(tǒng)地研究暫未見(jiàn)報(bào)。研究分別以感染LSV、LRV和CMV的卷丹百合珠芽為試材，通過(guò)熱處理、莖尖培養(yǎng)結(jié)合添加病毒唑的方法，運(yùn)用RTPCR方法檢測(cè)病毒，旨在探討最適宜的脫毒方法，為繁育優(yōu)質(zhì)的脫毒百合種苗提供參考，為百合產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展提供保障。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為湖南省湘西龍山縣栽培多年的卷丹百合（均由湖南省湘西龍山縣農(nóng)業(yè)局提供）。分別選擇具典型感染百合無(wú)癥病毒（LSV）、百合叢簇病毒（LRV）、黃瓜花葉病毒（CMV）的植株，采集百合珠芽備用。田間試驗(yàn)在湖南省蔬菜研究所完成，室內(nèi)試驗(yàn)在湖南省工程技術(shù)研究中心完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不同脫毒方法對(duì)不同病毒的脫毒處理分別以感染CMV、LSV、LRV的卷丹百合珠芽為試材，在流水下清洗去表面的泥土，分別裝入200 mL玻璃杯中，上面蓋一層打濕的毛巾，放在38℃高溫條件下處理不同天數(shù)（0、10、20、30 d）后（其間注意保持濕度在80%～85%），洗凈表面粘液，用70%酒精處理30 s，再用升汞處理15 min，用無(wú)菌水漂洗5次后備用。將已經(jīng)滅菌的百合珠芽在解剖鏡下，剝?nèi)〔煌笮。?.1～0.3、0.4～0.6、0.7～1.0 mm）的莖尖，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+2.5 mg/L 6-BA+ 1.5 mg/L GA+ 0.5 mg/L NAA+0.1 g/L活性炭+0.6%瓊脂+3%白糖）中，添加不同濃度的病毒唑（0、5、10 mg/L）。每處理接種40個(gè)莖尖，培養(yǎng)40～50 d后統(tǒng)計(jì)植株成活率。培養(yǎng)條件：先在黑暗條件下培養(yǎng)10 d，后轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度600～800 lx，光照時(shí)間為10 h，溫度25℃。

表1　3種病毒的引物

1.2.2百合3種主要病毒檢測(cè)LSV和CMV 2種病毒采用王賢[18]和王麗花[19]所述的引物，LRV引物為通過(guò)NCBI Genebank中登記的病毒序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Prime 6.0設(shè)計(jì)而成，引物核酸序列見(jiàn)表1。

待百合莖尖長(zhǎng)至較大時(shí)，轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基（MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 g/L活性炭+0.7%瓊脂+30 g白糖）中繼續(xù)培養(yǎng)30～40 d。待長(zhǎng)出2～3片葉時(shí)切下葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)，稱取0.1 g百合組培苗葉片在液氮中研磨，用Trizol法提取總RNA，參照陳進(jìn)[20]的RT-PCR法進(jìn)行3種病毒檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同脫毒方法的脫毒率。

1.2.3數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1熱處理時(shí)間及剝?nèi)∏o尖大小對(duì)不同病毒的脫毒效果

分別將3種病毒百合珠芽在不同熱處理時(shí)間及不同莖尖大小的處理下接種在不添加病毒唑的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40～50 d統(tǒng)計(jì)成活率后轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30～40 d，待長(zhǎng)出2～3片葉時(shí)進(jìn)行病毒檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)脫毒情況。由表2可知，對(duì)于CMV而言，莖尖的大小比熱處理的脫毒效果更佳，當(dāng)剝?nèi)〉那o尖在0.1～0.3 mm大小時(shí)脫毒率可達(dá)100%，隨著剝?nèi)∏o尖的增大脫毒效果呈下降趨勢(shì)。由表3可知，對(duì)于LSV而言，熱處理脫毒效果優(yōu)于莖尖大小，在一定范圍內(nèi)，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，脫毒效果呈上升趨勢(shì)，當(dāng)熱處理20 d時(shí)，剝?nèi)∏o尖大小<0.7 mm時(shí)，脫毒效果最佳，達(dá)90%以上，但如果再延長(zhǎng)熱處理時(shí)間，脫毒效率反而下降。由表4可知，對(duì)于LRV而言，各處理脫毒效果均不佳，脫毒效果較好的處理為熱處理20～30 d結(jié)合剝?nèi)?.1～0.3 mm莖尖，脫毒率為70%以上，僅用熱處理結(jié)合剝?nèi)∏o尖不能完全脫除該病毒。

綜合表2～4可以看出，各處理間差異顯著或極顯著。莖尖大小同植株成活率成正比，同病毒脫毒率成反比；熱處理時(shí)間在一定范圍內(nèi)對(duì)植株成活率影響不大，但當(dāng)處理超過(guò)30 d會(huì)大大降低成活率。不同的熱處理時(shí)間和剝?nèi)∏o尖的大小對(duì)同一病毒的脫毒效果差異顯著，不同病毒在相同的處理?xiàng)l件下脫毒效果差異也顯著。

表2　熱處理時(shí)間及剝?nèi)∏o尖大小對(duì)CMV的脫毒效果

表3　熱處理時(shí)間及剝?nèi)∏o尖大小對(duì)LSV的脫毒效果

表4　熱處理時(shí)間及剝?nèi)∏o尖大小對(duì)LRV的脫毒效果

表5　熱處理、莖尖大小及不同濃度病毒唑?qū)Σ煌《镜拿摮Ч?/p>

2.2熱處理、莖尖大小及不同濃度病毒唑?qū)Σ煌《镜拿摱拘Ч?/p>

分別將3種病毒百合珠芽分別在38℃下處理20 d后，剝?nèi)〔煌笮〗臃N在添加不同濃度的病毒唑（0、5、10 mg/L）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40～50 d統(tǒng)計(jì)成活率后轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30～40 d，待長(zhǎng)出2～3片葉時(shí)進(jìn)行病毒檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)脫毒情況。結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可知，各處理間存在顯著或極顯著差異。添加病毒唑?qū)χ仓瓿苫盥视绊懖淮螅珜?duì)脫毒率影響非常顯著，不同病毒種類(lèi)對(duì)病毒唑的最佳濃度略有差異，在一定范圍內(nèi)病毒唑濃度的高低與病毒脫毒率成正比。特別對(duì)于LRV而言，不添加病毒唑時(shí)，脫毒率只能達(dá)到70%左右，添加病毒唑后，各處理差異極顯著，試驗(yàn)中最佳的脫毒方法為：38℃下熱處理20 d后，剝?nèi)?.4～0.6 mm莖尖，接種在添加10 mg/L病毒唑的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，脫毒率可達(dá)92.6%，提高脫毒率20%左右，效果非常明顯。

3　結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)CMV、LSV和LRV 3種病毒的脫毒方法的研究，篩選出適合各種病毒的最佳脫毒方法。3種病毒的脫除難易程度為：CMV

目前，百合的脫毒方法主要有熱處理、莖尖培養(yǎng)、輻射處理和化學(xué)藥劑處理等。由于莖尖頂端分生組織細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，新陳代謝能力快，生長(zhǎng)迅速，病毒含量極少或無(wú)[20]，因此莖尖培養(yǎng)是目前使用最廣泛的脫毒方法。剝?nèi)〉那o尖越小，脫除病毒效果越好，但同時(shí)存在成活率低下，易褐化死亡等問(wèn)題，因此僅以此一種方法難以達(dá)到預(yù)期的效果[21]。高溫?zé)崽幚砟苁共《锯g化，抑制病毒的分化和轉(zhuǎn)移，使其失去活性[22]，但單一使用這種方法不能有效脫除病毒，結(jié)合莖尖培養(yǎng)可大大提高脫毒效率。添加病毒唑也可起到鈍化病毒、抑制病毒的自我復(fù)制和傳播，達(dá)到降解病毒的作用，但也存在單獨(dú)使用效果不明顯的問(wèn)題，需結(jié)合其他方法方可達(dá)到理想效果[23]。

試驗(yàn)采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理及添加病毒唑的方法對(duì)感染CMV、LSV及LRV 3種病毒的卷丹百合進(jìn)行研究，3種脫毒方法對(duì)不同病毒的脫毒效果差異顯著，3種方法相結(jié)合可以達(dá)到最好的脫毒效果，基本可以脫除3種病毒，這一結(jié)果與高慧卿[24]及王超[25]研究結(jié)果一致。試驗(yàn)只針對(duì)CMV、LSV及LRV 3種病毒進(jìn)行研究，其他病毒是否也適用這種脫毒方法還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Detoxification?Methods?of?Three?Viruses?of?Lilium lancifolium

ZHOU Xiao-bo1，2，WU Yi-fei1，2，DING Zhuo-yi1，2，CHEN Li-pei3，LI Shi-shu3，HUANG Li-ping3
（1. Hunan Vegetable Research Institute, Changsha 410125, PRC; 2. Hunan Vegetable Research and Development Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Xiangxi Autonomous Prefecture Economic Information Bureau of Longshan, Longshan 416000, PRC）

In order to obtain high quality seedlings without virus， the tiger Lilium lancifolium three main virus detoxification methods were studied. Taking CMV infection， LSV and LRV tiger Lilium lancifolium bulbil as experimental materials， the heat treatment， stem tip cultivation method of adding ribavirin combination， in the process of test using RT-PCR method to detect virus， discussed the optimum method of detoxification. Research results showed that: for CMV， only through cultivation stem tip， wring 0.1-0.3 mm size stem tip seedling cultivation rate can reach 100%， but the survival rate is only 45%; For LSV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.1-0.3 mm meristem-tip culture， detoxification effect was the best， reached more than 90%; For LRV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin the detoxication rate reached above 90%. Comprehensive seedling rate and survival rate of the three kinds of virus， with heat treatment(38 ℃) after 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin， high survival rate， detoxification effect was the best.

Lilium lancifolium; virus; detoxification methods

S644.1

A

1006-060X（2016）10-0007-04

2016-08-08

湘西科技開(kāi)發(fā)專項(xiàng)（2014FJ4184）

周曉波（1979-），男，湖南岳陽(yáng)市人，助理研究員，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究。

吳藝飛