?劉　最，李玉中，林慧敏，宋瑞洪?

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，湖南　衡陽 421008）

稀有放線菌的選擇性分離、鑒定及生物活性研究

劉最，李玉中，林慧敏，宋瑞洪

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，湖南衡陽 421008）

聚乳酸（PLA）和絲蛋白粉分別作為選擇性碳、氮源可以有效提高稀有放線菌的分離效率，同時海洋環(huán)境中蘊藏著豐富的活性稀有放線菌，是發(fā)現新藥的有效途徑。為了篩選并鑒定海洋環(huán)境中產生活性物質的稀有放線菌，以聚乳酸和絲蛋白粉分別作為選擇性碳、氮源，配制6種分離培養(yǎng)基，用平板稀釋法分離放線菌；并用濾紙片法和MTT法對供測菌株發(fā)酵產物進行活性篩選。結果表明：共分離出96株稀有放線菌，分屬于11個屬；其中，80株菌對7種靶標菌顯示出一定的抗菌活性；78株菌對腫瘤細胞具有不同程度的細胞毒活性。另外，比較了6種培養(yǎng)基對稀有放線菌的分離效果。從分離結果來看，最理想的是聚乳酸培養(yǎng)基。

稀有放線菌；選擇分離；聚乳酸（PLA）；絲蛋白粉；活性篩選

天然產物是生物活性物質、新化學結構、開發(fā)合成及半合成藥物使用的先導化合物的重要來源[1]。它種類繁多，主要涵蓋微生物、動物及植物領域。其中，微生物領域是尋找新型天然產物的巨大寶庫，而開發(fā)天然產物的關鍵在于研究菌株能否產生多種結構新穎的化合物[2]。放線菌是一類重要的微生物資源，目前產生的兩萬余種活性天然產物中[3]，有一半以上產生于放線菌[4]，包括各種抗生素[5]、酶類[6]、免疫抑制劑[7]及各種抗菌抗腫瘤物質[8]等。這些天然產物多數來自于鏈霉菌屬，并且篩選重復率日益增高，因此研究者們逐漸將目光轉向稀有放線菌。碳、氮源是培養(yǎng)基的基本成分，不同類型放線菌可利用的碳、氮源也不同，所以對于稀有放線菌的分離要采用不同于常規(guī)的分離方法[3]。

聚乳酸Poly-L-lactic Acid （PLA）也稱為聚丙交酯，單體是乳酸，具有良好的耐熱性、透明度、機械性能等，被認為是最理想的可降解綠色高分子材料[9-12]。目前，篩選出的可降解聚乳酸的微生物主要是Pseudonocardiaceae家族以及相關菌屬[13-15]。明膠作為其誘導物，在一定程度上能加速PLA的降解。絲蛋白粉作為PLA的類似物，能有效誘導聚乳酸降解酶的產生，同時絲蛋白粉在一定程度上也能被放線菌生物降解[15]。

研究選取聚乳酸、絲蛋白粉分別作為選擇性碳、氮源來分離放線菌，并對分離菌株進行16SrRNA基因序列分析。此外，還對分離菌株進行活性篩選，以期為開發(fā)新型微生物藥物提供材料。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土樣來源土樣來源具體情況見表1。將采集的土樣置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2指示菌和腫瘤細胞株指示菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、白色假絲酵母（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）。腫瘤細胞株：人子宮頸癌HeLa細胞和人肝癌HepG2細胞。

表1　土樣來源

1.1.3主要試劑和儀器主要試劑有：溶菌酶（上海生工公司），蛋白酶K（上海生工公司），其他生化試劑均為國產分析純。主要儀器有：Taq DNA 聚合酶（Takara 公司），PCR所用引物由上海生工公司合成，PCR擴增儀（BioRad 公司），電泳儀（6003EN，北京六一儀器廠）。

1.1.4培養(yǎng)基分離基礎培養(yǎng)基：酵母提取物 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO41 g/L，CaCl2·2H2O 0.02 g/L，NaCl 0.1 g/L，K2HPO41.6 g/L，KH2PO40.2 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.000 5 g/L，Na2WO40.000 5 g/L，MnSO40.000 5 g/L，瓊脂20 g/L，海水1 000 mL，pH值7.2～7.4[16]。聚乳酸培養(yǎng)基：聚乳酸 2 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。聚乳酸+明膠培養(yǎng)基：聚乳酸 1 g/L+明膠1 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。聚乳酸+絲素粉培養(yǎng)基：聚乳酸 1 g/L+絲素粉1 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。聚乳酸+絲肽粉培養(yǎng)基：聚乳酸 1 g/L+絲肽粉1 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。絲素粉培養(yǎng)基：絲素粉2 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。絲肽粉培養(yǎng)基：絲肽粉2 g/L+分離基礎培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉 25 g/L，淀粉40 g/L，葡萄糖 5 g/L，酵母提取物5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，CaCO31 g/L，50%自來水+50%海水，pH值 7.2～7.4。

1.2試驗方法

1.2.1放線菌選擇性分離稱取樣品1 g加至裝有9 mL無菌水與小玻珠的無菌離心管中，28℃搖床，轉速220 r/min，充分振蕩30 min后，將樣品依次稀釋到10-2和10-3的濃度梯度。吸取100 μL土壤稀釋液分別涂布至加有抑制劑制霉菌素、重鉻酸鉀、萬古霉素的分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3周至單菌落出現。

1.2.2菌株發(fā)酵粗提物制備將分離純化的放線菌接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d。離心除去菌體，收集發(fā)酵液。

1.2.3活性檢測（1）濾紙片法：吸取甲醇溶解的乙酸乙酯萃取物50 μL于直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片上，置于指示菌平板上，在指示菌適合的溫度培養(yǎng)后觀察，并用游標卡尺測定其抑菌圈大小[17]。（2）MTT法：先將腫瘤細胞進行傳代培養(yǎng)，然后進行活性測定，用酶標儀在波長595 nm下測OD值，計算各個樣品對腫瘤細胞的抑制率[18]。

1.2.4菌株DNA提取與16S rRNA基因的PCR擴增采用溶菌酶法[19]快速提取放線菌基因組總DNA。采用細菌通用引物27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和1492 R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3′）進行PCR擴增[20]。純化后的PCR產物交由上海英駿生物技術有限公司完成。

2　結果與分析

2.1稀有放線菌的選擇性分離結果

對不同來源的6份樣品進行分離，結果見表2。由表2可知，①不同樣品分離的放線菌數差別大，廈門集美潮間帶土樣分離結果最理想；②相同土樣采用不同培養(yǎng)基分離效果也各不同，以添加選擇碳源聚乳酸的培養(yǎng)基分離效果最理想；③在6種選擇分離培養(yǎng)基中，添加碳源聚乳酸的培養(yǎng)基分離效果最佳，不僅放線菌出菌率最高，種類豐富，稀有放線菌比例也較大。

表2　不同地點樣品分離的放線菌數量及培養(yǎng)基類型

2.2分離菌株的多樣性

通過形態(tài)觀察，將分離到的160株放線菌進行初步分類，從中挑選出120株進行16SrRNA基因序列測定。將擴增的16SrRNA 基因序列在GenBank 中利用BLAST進行序列同源性分析，其中96株為鏈霉菌屬之外的稀有放線菌，分屬于5個亞目，7個科，11個屬，分別是馬杜拉菌屬（Actinomadura）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、野野村氏菌屬（Nonomuraea）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、糖霉菌屬（Glycomyces）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、韓國生工菌屬（Kribbella）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）、糖單孢菌屬（Saccharomonospora）和姜氏菌屬（Jiangella）。

2.3抗菌活性檢測

對進行分子鑒定的96株稀有放線菌進行抗菌活性檢測，結果如表3所示。有80株菌對7種靶標菌顯示出一定的抗菌活性，其中抗Bacillus subtilis的活性菌株數最多，占供測菌株76.0%；抗革蘭氏陰性菌Escherichia coli的菌株較少，占供測菌株41.7%；抗2種真菌靶標菌的菌株最少，分別占供測菌株的18.8%和12.5%。這些活性菌株以馬杜拉菌屬和擬無枝酸菌為主。

表3　96株稀有放線菌的抗菌檢測

2.4抗腫瘤活性檢測

由表4可知，對HeLa細胞有細胞毒活性且樣品濃度為50 μg/mL的有53株，占總供測菌株的55.2%；樣品濃度為100 μg/mL的有70株，占總供測菌株的72.9%；對HepG2細胞有細胞毒活性且樣品濃度為50 μg/mL的有42株，占總供測菌株的43.8%；樣品濃度為100 μg/mL的有61株，占總供測菌株的63.5%。在96株稀有放線菌中，共有78株呈現出對HeLa或HepG2具有不同程度的細胞毒活性，占供測菌株的81.3%。

表4　96株稀有放線菌的抗腫瘤活性檢測

3　討　論

目前，已發(fā)現的天然產物多數來自于鏈霉菌，為了開發(fā)新的天然產物，研究者們不斷將眼光轉向稀有放線菌[3]。試驗結果顯示，在分離培養(yǎng)基中添加聚乳酸和絲蛋白粉，共獲得160株放線菌。經16SrRNA基因序列分析，這些菌株分屬于5個亞目，7個科，11個屬。這與Yutaka等[15]篩選到的降解聚乳酸的放線菌屬于Pseudonocardiaceae家族以及相關菌屬的結果有些類似。除此之外，還分離到韓國生工菌屬、野野村氏菌屬、諾卡氏屬、姜氏菌屬、糖霉菌屬和擬諾卡氏菌屬的菌株，這均為首次報道。目前，利用聚乳酸和絲蛋白粉作為培養(yǎng)基成分來分離稀有放線菌的報道較少見，進一步證實這兩種復合成分在稀有放線菌分離上有著較大的研究開發(fā)潛力。

活性測定結果顯示，供試菌株有一半以上具有抗藤黃微球菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的活性，而對大腸桿菌有抗菌活性的菌株數目不多。對兩種真菌靶標菌有抗菌活性的菌株較少，如馬杜拉菌屬只有4株菌株具有抗兩種真菌靶標菌的活性；野野村氏菌屬中只有1株菌株具有抗兩種真菌靶標的活性。大多數菌株都顯示出對HeLa或HepG2兩種腫瘤細胞株有較強的抑制能力，說明菌株的次級代謝產物中可能含有抗腫瘤活性的化合物。對于以上檢測到活性強的菌株大部分分布在馬杜拉放線菌屬和擬無枝酸菌屬，活性好的菌株可為次級代謝產物的研究提供良好的資源。

要避免優(yōu)良菌株的漏篩，提高天然產物的分離率，必須不斷建立新的篩選模型，不能局限于抗菌和抗腫瘤活性的篩選。研究只是對海洋環(huán)境中的土樣進行稀有放線菌的分離，結果表明，海洋中蘊藏著豐富的稀有放線菌資源。而一些極端環(huán)境、未開發(fā)的原始森林環(huán)境中必然也含有大量具有利用價值的菌株和更多未知的放線菌群，值得深入研究。

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（責任編輯：成平）

Selective?Iolation?and?Identification?of?Rare?Actinomycetes?from?Marine?Habitats?and?Its?bioactivity

LIU Zui，LI Yu-zhong，LIN Hui-min，SONG Rui-hong
（College of Life Science and Environment Heng Yang Normal University, Hengyang 421008, PRC）

Poly-L-lactic acid and silk protein powder as selective carbon， nitrogen for isolation of rare actinomycetes is worth further researches. Marine habitats are rich in rare actinomycetes with bioactivity and may be an effective method of finding new medicine. This study was aimed to isolate and identify rare actinomycetes with bioactivity isolated from marine habitats. Rare actinomycetes were isolated using poly-L-lactic acid and silk protein as a selective carbon， nitrogen from six samples by agar plate dilution method. To test the biological active effects， we used paper-disk method with seven indicator organisms to detect the antimicrobial activity by its fermentation extracts，MTT assay with 2 human tumor cell lines to monitor anti-tumor activitiy. Among of them， by eliminating the same strains from one genus and then 120 strains were identified by 16SrRNA gene sequence analysis， 96 strains were classified into 11 genera besides Streptomyces. 80 strains displayed anti-microbial activities. Meanwhile， 78 strains displayed anti-tumor activities. Six types of culture medium for isolating rare actinomycetes had been compared， and results revealed that poly-L-lactic acid culture medium was the best for isolation.

rare actinomycetes; selective isolation; poly-L-lactic acid; silk protein; bioactivity screening

Q939.13

A

1006-060X（2016）10-0004-03

2016-07-13

衡陽師范學院基金青年項目（14A04）；衡陽市科技局一般項目（2015KJ25）

劉 最（1984-），女，湖南邵陽市人，實驗員，主要從事放線菌分類研究。