何 雯，王選東，陶大勇

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

研究簡報(bào)

小花棘豆對羊血漿中抗氧化指標(biāo)的影響

何 雯，王選東，陶大勇

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

為了探討小花棘豆中苦馬豆素的中毒機(jī)理及其對羊體內(nèi)氧自由基代謝的影響，將12只卡拉庫爾羊隨機(jī)分為2組，即對照組、實(shí)驗(yàn)組。采用紫外可見分光光度法分別測定了對照組和攻毒組羊血漿中超氧化物歧化酶（SOD）的活性、還原型谷胱甘肽（GSH）的活性、脂質(zhì)過氧化終末代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量、總巰基（TSH）、非蛋白巰基（NPSH）的含量及一氧化氮（NO）。結(jié)果表明：攻毒組羊血漿中SOD活性和GSH、TSH、NPSH含量在攻毒21 d之后均顯著或極顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量和NO含量在攻毒21 d之后均極顯著高于對照組（P＜0.01）。表明苦馬豆素能誘發(fā)機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，顯著降低機(jī)體主要器官和組織中某些抗氧化酶的活性，提高M(jìn)DA的含量；發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而損傷機(jī)體主要組織器官，細(xì)胞發(fā)生空泡變性，可能是苦馬豆素引起中毒的原因之一。

小花棘豆；羊；抗氧化指標(biāo)

小花棘豆為豆科棘豆屬的多年生草本植物，主要成分為苦馬豆素（swainsonine，SW）。國內(nèi)外大量研究資料證實(shí)，SW能抑制溶酶體α-甘露糖苷酶、高爾基體α-甘露糖苷酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞質(zhì)α-甘露糖苷酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)蛋白的N-糖基化合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及富含甘露糖的寡聚糖代謝等過程發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞表面膜黏附分子、細(xì)胞膜受體正常功能變化，出現(xiàn)生殖、內(nèi)分泌及免疫功能異常及細(xì)胞廣泛空泡變性，使家畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)器官受到損害，造成細(xì)胞功能紊亂，尤其是神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，而使家畜表現(xiàn)出一系列神經(jīng)癥狀［1-2］。

小花棘豆中毒的主要組織病理學(xué)特征是腦、脊髓、各內(nèi)臟器官以及外周血液淋巴細(xì)胞的胞漿空泡變性，與氧自由基（oxygeli free radical，OFR）引起的空泡變性相似，可能是由于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而引起。因此，本研究通過對羊進(jìn)行小花棘豆攻毒，測定不同時(shí)期血漿中抗氧化指標(biāo)變化，進(jìn)而分析驗(yàn)證小花棘豆對羊的毒性作用，進(jìn)一步完善小花棘豆的中毒機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

小花棘豆2013年7月采集于新疆策勒縣恰哈鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。取植株地上部分，陰干、保存?zhèn)溆谩Ｐ陆ɡ瓗鞝栄?2只。

1.2 試劑與儀器

試劑：SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），GSH測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），MDA測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），GSH標(biāo)準(zhǔn)品，2-硝基苯甲酸（DTNB），乙二胺四乙酸二鈉，Tris緩沖液，磺基水楊酸，TCA溶液，甲醇，對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)液：用0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值10.14）將分析純的對硝基酚配成2mmol/L的母液，然后稀釋成濃度分別為100，200，300……1 500μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)對硝基酚溶液以制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，對-硝基苯基-α-D-甘露糖吡喃糖苷（Sigma公司），醋酸鹽緩沖液，0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH值10.14）。

儀器：美的2110電磁爐，Analyst800型原子吸收分光光度計(jì)（Perkin Elmer公司），自動(dòng)超純水系統(tǒng)（美國密理博），F(xiàn)A1004N電光分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），恒溫水浴鍋，酶標(biāo)儀（美國伯樂公司），等等。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的初步處理 對12只實(shí)驗(yàn)羊用驅(qū)蟲凈進(jìn)行前期驅(qū)蟲處理，隨機(jī)分為2組，每組6只。對照組羊飼喂青干草和少量精料，實(shí)驗(yàn)組羊每天按照10 g/kg體重的劑量飼喂小花棘豆干粉，待采食完畢后，再添加青干草和精料（飼養(yǎng)量同對照組）。自由飲水。在實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)稱重，每天飼喂時(shí)進(jìn)行臨床癥狀觀察。

1.3.2 樣品采集和處理 實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)于卡拉庫爾羊頸靜脈采血5 mL，裝于肝素鈉抗凝管中，做好標(biāo)記，3 000 r/min離心20 min，分離血漿，4℃冷藏保存，備用。

1.3.3 SOD活性測定 采用紫外分光光度法測定。

1.3.4 GSH活性測定 采用DTNB直接法測定。

1.3.5 MDA含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)比色法測定。

以上方法均按各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel2007進(jìn)行初步處理，用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.2中的ANOVA進(jìn)行單因素分析，若差異顯著時(shí)用Dunan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

通過羊的攻毒試驗(yàn)，每一周分別采取對照組和攻毒組羊的全血，分離血清，對抗氧化指標(biāo)SOD活性及GSH、MDA、TSH、NPSH、NO等含量進(jìn)行測定（見表1）。對照組羊隨時(shí)間的增加，抗氧化指標(biāo)GSH、TSH含量呈現(xiàn)明顯上升趨勢，而MDA含量和NO含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，SOD活性和NPSH含量變化不明顯；攻毒組羊隨攻毒時(shí)間的增加，抗氧化指標(biāo)SOD活性、GSH、TSH、NPSH含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，而MDA含量和NO含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。與對照組相比，攻毒組羊隨著攻毒時(shí)間的增加，SOD含量在連續(xù)攻毒15 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到21 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；GSH含量在連續(xù)攻毒8 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到15 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；MDA含量在連續(xù)攻毒8 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到15 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；TSH含量在連續(xù)攻毒21 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到28 d至實(shí)驗(yàn)終止表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；NPSH含量在連續(xù)攻毒21 d時(shí)表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），攻毒到28 d至實(shí)驗(yàn)終止均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；隨著實(shí)驗(yàn)組羊SW在體內(nèi)積累的增多，NO含量呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，在攻毒21 d至實(shí)驗(yàn)終止均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）。

表1 攻毒組與對照組羊攻毒期間血清SOD、GSH、MDA、TSH、NPSH、NO含量對比

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在前期對羊的臨床癥狀、剖檢、組織學(xué)及血清學(xué)進(jìn)行了觀察及測定，進(jìn)而對抗氧化指標(biāo)進(jìn)行了檢測，驗(yàn)證SW對機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步完善了SW中毒機(jī)制。SOD是機(jī)體內(nèi)一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì)，主要分布于胞液和線粒體基質(zhì)中。SOD能與O2·-發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，消除O2·-過程中產(chǎn)生了H2O2，對機(jī)體同樣造成損害［3］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，給羊飼喂一段時(shí)間苦馬豆素后，SOD活性在羊的血漿和腦組織中均顯著降低。表明苦馬豆素對羊SOD活性的影響是很嚴(yán)重的，而SOD活性的顯著降低，說明機(jī)體抗氧化能力顯著減弱，機(jī)體清除氧自由基的能力嚴(yán)重降低，自由基代謝發(fā)生障礙，使得機(jī)體組織器官受到損傷，而腦組織損傷最為嚴(yán)重。說明小花棘豆中毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與機(jī)體血漿和腦組織中SOD活性的降低有關(guān)。

還原型谷胱甘肽（GSH）是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具多種重要的生理功能，是一種能夠清除多種氧化物的小分子清除劑，而GSH含量的多少是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)［4］。SW能顯著降低血漿中GSH的含量，使得機(jī)體合成GSH-PX和GSH-ST的量減少，不能足夠地分解氫過氧化物，造成血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，引起動(dòng)物機(jī)體組織器官發(fā)生病變，出現(xiàn)小花棘豆中毒后的組織病理學(xué)變化。梁剛等［5］研究表明，在氟中毒后，引起大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，抗氧化能力降低，在這種情況下口服GSH，發(fā)現(xiàn)氟中毒引起的脂質(zhì)過氧化作用顯著降低，使得抗氧化能力增強(qiáng)。說明GSH能夠作用于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，也為治療小花棘豆中毒引起的脂質(zhì)過氧化作用提供了研究方向。

MDA作為反映氧化損傷的指標(biāo)之一，其生成量與氧自由基生成量成正相關(guān)［6］。通過對MDA含量測定，機(jī)體能夠正確快速地反映出受到自由基影響的程度及脂質(zhì)過氧化的程度，進(jìn)而評估出機(jī)體損傷的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)中，血漿及腦組織MDA含量都隨著SW含量的積累而升高，說明SW中毒時(shí)，機(jī)體自由基大量產(chǎn)生，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。

巰基水平的降低可增強(qiáng)自由基的氧化損傷作用。研究表明［7］，巰基含量的降低可加重氧自由基的脂質(zhì)過氧化損傷作用，主要起著內(nèi)源性抗氧化損傷作用，在一定程度上，NPSH含量變化比較敏感。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組羊攻毒至21 d時(shí)，其血漿中TSH和NPSH含量與對照組相比明顯下降，表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）。表明當(dāng)羊采食一定量的小花棘豆后，總巰基、非蛋白巰基的含量會(huì)出現(xiàn)下降，使得體內(nèi)組織中多余的氧自由基不能有效清除，加重了氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷，對組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷。NO具有舒張血管的作用，能調(diào)節(jié)組織器官的血流量，又是血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦細(xì)胞及吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種較穩(wěn)定的自由基［8］。NO在體內(nèi)具有復(fù)雜的病理生理作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對血漿中抗氧化指標(biāo)含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)小花棘豆苦馬豆素對血漿中的指標(biāo)都有影響，影響隨中毒量的變化而改變，使得機(jī)體抗氧化能力減弱，清除氧自由基能力降低，引起自由基代謝發(fā)生障礙，組織器官發(fā)生病理性損傷，引起疾病的發(fā)生。這些變化也是引起小花棘豆苦馬豆素中毒后的組織器官病理學(xué)變化重要指標(biāo)。

［1］Hueza IM，Dagli M L，Gorniak S L，et al.Toxic effect of prenatal Ipomoe a carnea administration to rats［J］.Vet Hum Toxicol，2003，45：298-302.

［2］Barbosa RC，Riet-Correa F，Medeirosb RM T，et al.Intoxication by Ipomoea sericophylla and Ipomoea riedelii in goats in the state of Parai'ba，Northeastern Brazil［J］.Toxicon，2006，47：371-379.

［3］廖日滔，郭靜科，李冰潔，等.自由基相關(guān)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的研究進(jìn)展［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2014，11：1573-1583.

［4］劉愛華.還原型谷胱甘肽的作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥指南，2013（9）：391-393.

［5］梁剛，孫貴苑，黃麗君，等.口服谷胱甘肽對氟所致大白鼠脂質(zhì)過氧化的影響［J］.環(huán)境與健康雜志，2001，18（2）：77-79.

［6］陳瑗.自由基醫(yī)學(xué)［M］.北京：人民醫(yī)學(xué)出版社，1991：83-84.

［7］陳震陽，潘立群，譚淑珍，等.血清中總巰基和非蛋白巰基含量分別測定研究［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1999，4（4）：268-269.

［8］劉兆紅，岳炳輝.氧自由基對動(dòng)物機(jī)體的毒性作用［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005，3：57.

S826.1

A

2095-3887（2016）04-0062-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.017

2016-05-26

國家自然科學(xué)基金（31160520）；校級研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGR1201504）

何雯（1989-），女，碩士研究生。

陶大勇（1967-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)及中草藥學(xué)研究。