錢雪峰，Krupakar Jyothi，趙 曄，凌春華，黃建安，季 成

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院,江蘇 蘇州 215006)

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·論著·

阿薩希毛孢子菌和頭狀地霉菌血流感染的鑒別診斷初探

錢雪峰，Krupakar Jyothi，趙 曄，凌春華，黃建安，季 成

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院,江蘇 蘇州 215006)

目的 為臨床微生物實驗室建立少見類酵母樣真菌血流感染診斷和鑒別診斷方法提供參考。方法 采用臨床資料分析，形態(tài)學檢查、生化反應和分子生物學技術相結合的方法，對阿薩希毛孢子菌和頭狀地霉菌血流感染進行診斷和鑒別診斷。結果 病例1和病例2類酵母樣真菌血流感染均發(fā)生于患者白血病化療后粒細胞缺乏期，患者病情嚴重，相似度高。挑取病例1、2血平皿上培養(yǎng)菌落進行革蘭染色鏡檢，前者可見菌絲、關節(jié)孢子和小分生孢子，菌絲分枝分隔粗細不等，關節(jié)孢子長短不一，多呈矩形和桶型；后者可見中隔透明的菌絲斷裂成關節(jié)孢子，呈長方形，不產生芽生分生孢子。API 20C AUX鑒定，提示分別為阿薩希毛孢子菌、頭狀地霉菌。所得序列在NCBI上進行比對，結果分別為阿薩希毛孢子菌、頭狀雙足囊菌-頭狀地霉菌的有性期。結論 綜合應用多種技術手段有助于提高類酵母樣真菌血流感染診斷的準確性。將毛孢子菌和地霉菌鑒定到種水平有利于提高臨床對該類少見真菌感染的認識，合理選擇抗真菌藥物和改善預后。

血流感染； 阿薩希毛孢子菌； 頭狀地霉菌； 類酵母樣真菌； 鑒別診斷

[Chin J Infect Control，2016，15(10)：764-768]

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展和有效治療措施的不斷推出，許多疾病病死率得到不同程度的控制，患者生命得以延長。但同時也造成患有嚴重基礎疾病和免疫功能受損的患者數(shù)量的明顯增加，特別是在重癥監(jiān)護病房(ICU)、血液科和腫瘤科病房，醫(yī)院獲得性真菌感染的機會明顯上升[1-3]。對法國300個ICU的調查顯示，侵襲性假絲酵母菌感染的病死率高達45.9%[4]。特別是非白假絲酵母菌感染的比例有逐漸增高的趨勢。既往不常見的絲狀真菌、暗色絲狀真菌和其他類酵母樣真菌在致命性侵襲性感染中所占的比重越來越大[5-6]。普通假絲酵母菌通常可通過顯色平皿和自動化微生物鑒定儀酵母菌鑒定卡進行分析，但一些少見類酵母樣真菌卻無法完全依此進行鑒定。如對毛孢子菌和地霉菌種屬的鑒定，傳統(tǒng)的API 20C AUX system 和VITEK 2 Compact YST system確鑒率僅為70.8%、 56.3%，誤鑒率高[7]，目前臨床尚缺乏統(tǒng)一標準化的檢測方法。我們通過分析阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)和頭狀地霉菌(Geotrichumcapitatum)血流感染的臨床資料，結合病原形態(tài)學檢查、生理生化反應和分子生物學技術,對兩種類酵母樣真菌血流感染進行診斷和鑒別診斷?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 病例1，患者男性，48歲，初治急性紅白血病，于2010年6月1日入住本院，血常規(guī)白細胞計數(shù)(WBC)2.05×109/L，中性粒細胞(N)0.38×109/L，血紅蛋白(Hb)122g/L，血小板計數(shù)(PLT) 29×109/L。6月3日經外周靜脈置入中心靜脈導管(PICC)，化學治療(化療)后血白細胞未見明顯下降。6月22日復查骨髓穿刺提示未緩解，改予IA方案再次誘導化療， 7月10日出現(xiàn)發(fā)熱39.2°C，WBC 0.19×109/L，N 0.01×109/L，血CMV-DNA和PP65檢查陰性，7月14日起連續(xù)兩次血培養(yǎng)真菌生長，疑似阿薩希毛孢子菌。給予脂質體兩性霉素B聯(lián)合亞胺培南/西司他丁鈉、利奈唑胺抗感染治療，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)及促紅細胞生成素(EPO)促進造血恢復。

病例2，患者男性，13歲，初治急性單核細胞白血病，2010年8月9日因間斷中等度發(fā)熱入院。查血常規(guī)：WBC 346.87×109/L，Hb 109g/L，PLT 52×109/L。骨髓穿刺示急性單核細胞白血病。先后給予白細胞清除3次，羥基脲降白細胞治療，但白細胞仍維持在200×109/L左右，8月10置入股靜脈導管，給予IA方案誘導化療，8月19日復查骨髓穿刺：急性單核細胞白血病化療后未緩解伴骨髓抑制(幼稚單核細胞45%)。8月20日再予Ara-C 100mg/m2/d，2 d化療。期間反復出現(xiàn)高熱，予亞胺培南/西司他丁鈉聯(lián)合替考拉寧、米卡芬凈熱峰不降。8月24日起給予G-CSF刺激粒系造血。9月6日起外周血培養(yǎng)連續(xù)兩次真菌生長，考慮為真菌敗血癥，兩性霉素B加量至3 mg/kg/d，并聯(lián)合伏立康唑口服加強抗真菌治療。9月12日起脫離粒細胞缺乏期，WBC 4.32×109/L，N 3.12×109/L，體溫降至基礎體溫。9月13日起連續(xù)3次血培養(yǎng)回報無菌生長，提示真菌敗血癥得到有效控制。9月15日復查骨髓穿刺提示本病緩解，幼單核細胞1%。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學鑒定 分別接種血平皿、假絲酵母菌顯色平皿和SDA平皿，進行革蘭染色鏡檢。

1.2.2 生化反應鑒定 采用法國生物梅里埃VITEK2 Compact 鑒定儀YST卡鑒定和API 20C AUX鑒定。

1.2.3 分子生物學鑒定 使用天根生化酵母基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。真菌核糖體大亞基26SD1/D2區(qū)引物：NL-1F：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL-4R：GGTCCGTGTTTCAAGACGG[8]；核糖體DNA的內轉錄間隔區(qū)(ITS)引物：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴增26S和ITS序列：反應體系50 μL，dd H2O 41.25 μL，10×Buffer(含2.0 mmol/L MgCl2)5 μL，dNTP(10mmol/L)1 μL，primer(10 mol/L)各1 μL，Taq酶0.25 μL，模板DNA 0.5 μL。反應程序：94°C 4 min；94 °C 0.5 min,56 °C 1 min，72 °C 1 min，30個循環(huán)；72 °C 7 min。PCR產物回收：按生工生物SK1131試劑盒說明。目的片段連接反應：5 μL T4 DNA連接酶2×快速連接緩沖液，1 μL Pgem-T Vector，4 μL PCR product，16°C連接過夜。連接產物轉化：50 μL 感受態(tài)細胞置于冰上，解凍后將細胞均勻懸浮。加入10 μL連接液冰上放置30 min，42°C水浴90 s，冰上放置15～20 min。加400 μL SOC培養(yǎng)基，37°C 200～250 r/mim振蕩培養(yǎng)1 h。室溫下4 000 r/mim離心5 min，吸去400 μL 上清，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。將細菌涂布在預先用20 μL 100 mmol/L IPTG和100 μL 20 mg/mL X-gal 涂布的氨芐西林平板上。37°C下正向放置1 h，倒置培養(yǎng)過夜。選擇白色菌落，挑至5 mL含氨芐西林LB試管，37°C搖床過夜。使用生工SK1191 UNIQ-10 柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒DNA，M13+/-測序，所得序列在NCBI上進行比對。

1.2.4 抗真菌藥物體外敏感性試驗 采用丹麥Rosco公司藥敏紙片和改良Shadomy瓊脂，檢測兩種類酵母樣真菌對氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、咪康唑和5-氟胞嘧啶6種抗真菌藥物的敏感性。標準菌株ATCC 64548和ATCC 64550白假絲酵母菌作藥敏試驗質控菌株。

2 結果

2.1 病原表型鑒定結果 病例1，血平皿上菌落形態(tài)：35°C培養(yǎng)24 h后，菌落白色、干燥、邊緣不整齊，牢固黏附于培養(yǎng)基上，邊緣觸之易碎，菌落較小，48 h后頂部呈粉末狀。假絲酵母菌顯色平皿上生長產綠色色素的菌落。SDA上形態(tài)：27 °C培養(yǎng)24 h，奶油色、稍干燥、表面呈粉狀、邊緣有寬而深的裂隙。鏡檢：革蘭染色后可見菌絲、關節(jié)孢子和小分生孢子，菌絲分枝分隔粗細不等，關節(jié)孢子長短不一，多呈矩形和桶型。見圖1。VITEK2 Compact 鑒定儀YST卡：87%為阿薩希毛孢子菌。API 20C AUX鑒定： 30°C孵育24、48 h，提示為阿薩希毛孢子菌。

圖1 阿薩希毛孢子菌

病例2，血平皿上菌落形態(tài)：35°C培養(yǎng)24 h后，菌落白色、中小、偏干、邊緣呈粉末狀。假絲酵母菌顯色平皿上呈淡粉紅色、濕潤柔軟、邊緣皺折。SDA上形態(tài)：27 °C培養(yǎng)24 h，白色、表面堆積呈腦回狀，邊緣薄呈細小粉末狀。鏡檢可見中隔透明的菌絲斷裂成關節(jié)孢子，呈長方形，不產生芽生分生孢子。見圖2。VITEK2 Compact 鑒定儀YST卡：79%為頭狀地霉菌。API 20C AUX鑒定提示為頭狀地霉菌。

圖2 頭狀地霉菌

2.2 病原體分子生物學鑒定結果 提取患者分離菌的質粒DNA，測序所得序列在NCBI上進行比對，結果病例1為阿薩希毛孢子菌，26S rDNA D1/ D2區(qū)域序列為642 bp，轉錄間區(qū)(ITS)為543 bp，；病例2為頭狀雙足囊菌-頭狀地霉菌(Dipodascuscapitatus)的有性期，26S rDNA D1/ D2區(qū)域序列為452 bp， ITS為466 bp。

2.3 抗真菌藥物體外敏感性試驗結果 阿薩希毛孢子菌對大多數(shù)抗真菌藥物處于中介水平，僅對伊曲康唑和咪康唑敏感；而頭狀地霉菌對酮康唑、兩性霉素B和5-氟胞嘧啶敏感。見表1。

表1 2株類酵母樣真菌對抗真菌藥物的體外藥敏感結果

Table 1 In vitro antifungal susceptibility testing results of two kinds of yeast-like fungi

抗真菌藥物阿薩希毛孢子菌頭狀地霉菌氟康唑II酮康唑IS伊曲康唑SI兩性霉素BIS咪康唑SI5-氟胞嘧啶IS

I:中介；S：敏感

3 討論

絲孢酵母屬為半知菌亞門隱球菌科真菌,該菌可以引起表淺部位感染、深部侵襲性感染,患者預后極差。阿薩希毛孢子菌是近年由絲孢酵母屬中新確定的一個種，也是臨床侵襲性毛孢子菌屬中最常見的致病菌，多見于粒細胞減少的白血病、淋巴瘤患者、器官移植，以及重度免疫缺陷患者[9-11]，病死率高達42%～80%[12]。

地霉菌屬內孢霉綱，除具關節(jié)分生孢子外還具有由合軸延伸細胞產生的分生孢子，以前曾將此菌分類于毛孢子菌屬,形態(tài)上有時難于與毛孢子菌區(qū)別。地霉屬目前最常引起侵入性及系統(tǒng)性感染者為頭狀地霉菌，所引起的感染包括敗血癥、呼吸道感染、胃腸道感染、心內膜炎、肝腎感染、口腔感染、腦膜炎、骨髓炎和椎間關節(jié)盤炎,多見于急性白血病患者。90%以上是侵襲性感染[13]，致死率超過50%[9]。

在長度為500～600 bp的26S rDNA D1/ D2區(qū)域和rRNA轉錄間區(qū)( ITS)，絕大多數(shù)酵母菌種間具有明顯的序列差異，而同一種內不同菌株間的堿基差異卻≤1%[14]。目前，幾乎所有真菌D1/ D2區(qū)域的堿基序列已測定并公布，絲孢酵母屬內所有種菌株的ITS序列也已測定并公布。DNA序列數(shù)據(jù)為類酵母樣真菌的鑒定提供了便利條件。當未知菌株的相應序列測定后，在數(shù)據(jù)庫內進行同源性比對，就可判定該菌與哪個種的序列相同或最相近。文中1例阿薩希毛孢子菌和1例頭狀地霉菌血流感染均發(fā)生于化療后粒細胞缺乏期間，并且連續(xù)多次血培養(yǎng)陽性，可確定為真菌血流感染，而非污染。綜合臨床資料分析，病原形態(tài)學檢查、生理生化反應和分子生物學技術等多種手段，有助于提高類酵母樣真菌血流感染檢出的可靠性與準確性，有利于提高臨床對該類少見真菌感染的認識，合理選擇抗真菌藥物和改善預后。

阿薩希毛孢子菌對伏立康唑最敏感，而對卡泊芬凈耐藥[10, 15-16]，對兩性霉素B的敏感性存在地區(qū)差異，國外多數(shù)耐藥[10, 16]，而國內大陸地區(qū)仍敏感。頭狀地霉菌則對兩性霉素B高度敏感，其次是伏立康唑[17]。體外藥物敏感性試驗表明，阿薩希毛孢子菌對大多數(shù)抗真菌藥物處于中介水平，僅對伊曲康唑和咪康唑敏感；而頭狀地霉菌對氟康唑、伊曲康唑和咪康唑處于中介水平，對酮康唑、兩性霉素B和5-氟胞嘧啶敏感。臨床治療的結果也顯示，病例1在給予兩性霉素B經驗性治療后，盡管阿薩希毛孢子菌對兩性霉素B處于中介水平，但隨著粒細胞的回升，感染得到有效控制。病例2在給予米卡芬凈后熱峰不降，藥敏也提示該頭狀地霉菌對米卡芬凈不敏感，改予兩性霉素B和伏立康唑后，真菌敗血癥得到控制。另一個不容忽視的事實是2例類酵母樣真菌血流感染均發(fā)生在粒細胞缺乏期，而感染的控制均發(fā)生在粒細胞缺乏緩解期，提示患者自身免疫狀況對感染控制的作用。另外，我們建議在確診真菌敗血癥時拔除PICC或深靜脈導管，有利于感染的控制。

近年來，臨床上毛孢子菌病和地霉菌病的發(fā)病率呈上升趨勢，但是對抗真菌藥物敏感性的研究依然十分有限，且存在地區(qū)差異，目前尚缺乏可參考的經驗性治療方案。我們建議有條件的單位保存菌株，進一步研究，以期今后能為少見類酵母樣真菌的治療積累經驗和提供數(shù)據(jù)。

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(本文編輯：左雙燕)

Differential diagnosis in bloodstream infection withTrichosporonasahiiandGeotrichumcapitatum

QIANXue-feng,KrupakarJyothi,ZHAOYe,LINGChun-hua,HUANGJian-an,JICheng

(TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Objective To provide reference for establishing diagnosis and differential diagnosis methods of rare yeast-like fungal bloodstream infection for clinical microbiology laboratory. MethodsTrichosporonasahii(T.asahii) andGeotrichumcapitatum(G.capitatum) bloodstream infection was diagnosed and differentially diagnosed through clinical data analysis, morphological examination, biochemical reactions,and molecular biology technology.Results Two types of yeast-like fungal bloodstream infections in case 1 and case 2 both occurred in leukemia agranulocytosis phase after chemotherapy, such infections were serious and highly similar. The cultivated colonies on blood agar plates of case 1 and case 2 were performed gram stain and microscopic examination. Hyphae, arthrospores and microconidia were visible in the former, thickness of hyphae branches and length of arthrospores were different, most presented rectangular and barrel shape; the latter can be seen hyphae with transparent septum broken up into arthrospores, presented rectangular shape, did not produce blastoconidia. Identification with API 20C AUX showed that they wereT.asahiiandG.capitatum. The PCR product sequences were compared with NCBI, suggesting thatT.asahiiandG.capitatumwere at sexual stage. Conclusion Comprehensive application of a variety of technical methods is helpful for improving the diagnosis accuracy of bloodstream infection with yeast-like fungi, identifyingTrichosporonandGeotrichumto the species level may help physicians to understand such rare fungal infection, choose antifungal agents rationally, and improve clinical prognosis.

bloodstream infection;Trichosporonasahii;Geotrichumcapitatum; yeast-like fungus; differential diagnosis

2015-11-01

國家自然科學基金(81501425)

錢雪峰(1974 -)，男(漢族)，江蘇省蘇州市人，副主任檢驗師，主要從事病原生物檢測和醫(yī)院感染預防與控制相關研究。

季成 E-mail: jichengsky@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.011

R379

A

1671-9638(2016)10-0764-05