傅芳萌， 黃建平， 黃　萌， 王　川

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TSP-1和MMP-9在乳腺癌組織中的表達(dá)意義

傅芳萌， 黃建平， 黃萌， 王川

目的探討乳腺癌組織中凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)及其與腫瘤微血管生成、患者預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測131例乳腺癌患者組織中TSP-1、MMP-9的表達(dá)情況，比較研究指標(biāo)的表達(dá)情況和腫瘤組織中微血管密度(MVD)及其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果131例中，腫瘤間質(zhì)中TSP-1的表達(dá)和腫瘤的MVD呈負(fù)相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)=-0.241,P=0.006)；腫瘤細(xì)胞中MMP-9與腫瘤間質(zhì)中TSP-1共同高表達(dá)與乳腺癌組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期密切相關(guān)(P<0.05)；生存分析發(fā)現(xiàn)二者共同高表達(dá)的患者相對于二者非共同高表達(dá)的患者預(yù)后不佳。結(jié)論乳腺癌組織中MMP-9聯(lián)合TSP-1共同高表達(dá)可作為評價乳腺癌預(yù)后有價值的標(biāo)記物。

乳腺腫瘤； 凝血酶敏感蛋白1； 基質(zhì)金屬蛋白酶9； 基質(zhì)金屬蛋白酶類； 毛細(xì)血管； 預(yù)后

腫瘤微環(huán)境(tumor microenviroment)是由腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)共同組成，二者相互作用，貫穿腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程，并影響腫瘤細(xì)胞的生長、血管形成、轉(zhuǎn)移等多個病理生理過程。本研究中的2個分子分別為來源于腫瘤間質(zhì)的凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin 1, TSP-1)和來源于腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)，其各自在乳腺癌中的表達(dá)以及對乳腺癌各種生物學(xué)行為的影響已有報道，但把這2個分子置于乳腺癌微環(huán)境中，對2種分子之間的相互作用、對腫瘤血管生成的影響，以及二者的表達(dá)狀態(tài)對乳腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后影響的研究尚未見報道。筆者采用免疫組織化學(xué)檢測方法，評估131例乳腺癌患者的組織切片，以期判斷2種分子在乳腺癌中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)情況對乳腺癌患者預(yù)后的影響。

1　對象與方法

1.1對象收集2002年2月-2004年12月于筆者醫(yī)院行手術(shù)治療的女性乳腺癌患者131例，發(fā)病年齡(51.42±11.76)歲(24～92歲)，其中浸潤性導(dǎo)管癌99例，浸潤性小葉癌及其他類型的乳腺癌32例，具體臨床病理特征見表1?；颊呔?jīng)病理檢查證實為浸潤性乳腺癌，且術(shù)前均未進(jìn)行任何的新輔助化療及內(nèi)分泌治療等其他抗腫瘤治療，均行包含手術(shù)的綜合治療。

表1131例浸潤性乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)概況

Tab 1The clinicopathological character of 131 breast cancer patients

臨床病理參數(shù)n(%)月經(jīng)史　絕經(jīng)前67(51．1)　絕經(jīng)后64(48．9)病理類型　浸潤性導(dǎo)管癌99(75．6)　浸潤性小葉癌及其他類型32(24．4)腫瘤大小　T1+T2114(87．0)　T3+T417(23．0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移　陰性72(55．0)　陽性59(45．0)病理分期?、衿?1(23．7)　Ⅱ期67(51．1)?、笃?3(25．2)組織學(xué)分級　Ⅰ級22(16．8)?、蚣?7(51．1)?、蠹?2(32．1)ER表達(dá)狀態(tài)　陰性50(38．2)　陽性81(61．8)PR表達(dá)狀態(tài)　陰性58(44．3)　陽性73(55．7)HER?2表達(dá)狀態(tài)　陰性103(78．6)　陽性28(21．4)

ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2.

1.2方法

1.2.1調(diào)閱檔案資料所有病例均重新在病案室和病理科調(diào)閱檔案資料，核對患者病案號、姓名、年齡、術(shù)前臨床檢查資料、術(shù)后病理資料、治療情況和預(yù)后信息，對部分術(shù)后病理信息不明確的患者均復(fù)審病理切片或取原有蠟塊重新切片檢測評估。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)H-E染色。常規(guī)連續(xù)石蠟切片，厚約4 μm，本實驗中僅CD34抗原進(jìn)行高溫高壓檸檬酸熱修復(fù)，TSP-1和MMP-9抗原不需進(jìn)行抗原修復(fù)。抗體分別是羊抗人TSP-1多克隆一抗(N-20，美國Santa Cruz Biotecnology公司)，進(jìn)行1∶400稀釋；鼠抗人MMP-9單克隆一抗工作液(56-2A4)，鼠抗人CD34單克隆一抗工作液(VG1)，均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，為即用型抗體。TSP-1抗原采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，MMP-9、CD34抗原采用MaxvisionTM法進(jìn)行染色。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知骨髓巨核細(xì)胞TSP-1陽性標(biāo)本作為TSP-1陽性對照，以已知乳腺癌MMP-9陽性標(biāo)本作為MMP-9陽性對照。

1.2.3結(jié)果判定(1)TSP-1蛋白主要定位于間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個熱點區(qū)域視野計算陽性細(xì)胞百分率并計分，參照文獻(xiàn)[1]將TSP-1蛋白表達(dá)分為2組，其中低表達(dá)組為TSP-1蛋白呈局灶陽性且<30%腫瘤間質(zhì)著色；高表達(dá)組為超過30%腫瘤間質(zhì)著色，即強陽性。(2)MMP-9蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，部分間質(zhì)細(xì)胞亦可著色，采用半定量積分法判斷結(jié)果。400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個有代表性的視野計算陽性細(xì)胞百分率并計分，陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按細(xì)胞顯色強度計分：無顯色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項積分相乘，≥8分為高表達(dá)組，<8分為低表達(dá)。以CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，平均微血管密度(microvescular density，MVD)根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行計算[2]，所有患者平均MVD為(12.7±4.59)，以12.7為標(biāo)志，將平均MVD分為高M(jìn)VD組和低MVD組。

1.2.4隨訪通過電話及門診復(fù)查的方式對131例乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2010年12月31日。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理將患者信息及實驗檢測結(jié)果用EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。TSP-1和MMP-9表達(dá)情況與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；兩個獨立變量間的相關(guān)性評估采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier曲線法，Log-rank檢驗單因素和多因素Cox回歸比例風(fēng)險模型。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果MMP-9蛋白陽性信號主要定位于乳腺癌癌細(xì)胞胞質(zhì)中，腫瘤間質(zhì)細(xì)胞亦有輕度表達(dá)，呈黃色或棕黃色。乳腺癌癌細(xì)胞多呈強陽性表達(dá)，常為片狀、灶狀散在分布，其MMP-9高表達(dá)約64.9%(85/131)，周圍正常乳腺組織小葉及導(dǎo)管上皮細(xì)胞中呈無表達(dá)或弱表達(dá)。TSP-1蛋白陽性信號主要定位于腫瘤間質(zhì)中，特別是同癌巢鄰近的間質(zhì)，主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，血管周圍基底膜等，常呈片狀分布。TSP-1高表達(dá)率約52.3%(69/131)，部分乳腺癌細(xì)胞胞質(zhì)呈輕度非特異性染色。2種蛋白共同高表達(dá)的患者50例(38.2%)。同一張乳腺癌切片的近同一個區(qū)域TSP-1、MMP-9及微血管的表達(dá)情況見圖1。

2.2各個指標(biāo)與乳腺癌MVD及臨床病理特征的關(guān)系從表2可看出，腫瘤間質(zhì)TSP-1的高表達(dá)同腫瘤MVD呈弱的負(fù)相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.241,P=0.006)，而腫瘤細(xì)胞MMP-9高表達(dá)、TSP-1和MMP-9的共表達(dá)與MVD無關(guān)(結(jié)果另文發(fā)表)。如表3所示，131例中，將MMP-9和TSP-1同時呈高表達(dá)的病例歸為共同高表達(dá)組，與其他病例組成的非共同高表達(dá)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)共同高表達(dá)組和更高的腫瘤大小分期(T3+T4)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及更高的病理分期密切相關(guān)(χ2分別為8.700，5.488，8.615，而相應(yīng)的P值達(dá)到0.003，0.019，0.013)，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而與腫瘤病理類型、組織學(xué)分級及雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)的表達(dá)狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)，提示MMP-9和TSP-1共同高表達(dá)組的乳腺癌患者較其他病例組的患者具有更多不良的預(yù)后因素，可能與腫瘤的惡性生物學(xué)行為存在關(guān)系。

表2　乳腺癌組織TSP-1表達(dá)及其與MVD的相關(guān)性

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MVD：微血管密度.

表3MMP-9和TSP-1共同表達(dá)同乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Tab 3The relationship of Co-expression of MMP-9 and TSP-1 with clinicopathologic character of breast cancer

臨床病理參數(shù)n總MMP?9和TSP?1表達(dá)情況n非共同高表達(dá)n共同高表達(dá)月經(jīng)狀態(tài)　絕經(jīng)前644222　絕經(jīng)后673928病理類型　浸潤性導(dǎo)管癌996237　其他類型321913腫瘤大小☆☆　T1+T21147638　T3+T417512淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移☆　陰性725121　陽性593029病理分期☆?、衿?1247?、蚱?74324?、笃?31419組織分級?、窦?Ⅱ級895732　Ⅲ級422418ER狀態(tài)　陰性502921　陽性815229PR狀態(tài)　陰性583424　陽性性734726HER?2狀態(tài)　陰性1036637　陽性281513

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1； MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9； ER：雌激素受體； PR：孕激素受體； HER-2：人表皮生長因子受體2.☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.3MMP-9和TSP-1共同表達(dá)情況與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性如圖2所示，先采用Kaplan-meier曲線法和Log-rank檢驗對乳腺癌MMP-9、TSP-1二者共同高表達(dá)與乳腺癌無病生存率(disease-free survival, DFS)和總生存率(overall survival, OS)的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9、TSP-1共同高表達(dá)可以顯著降低DFS和OS,其5年DFS和OS分別為68.0%和74.0%，而MMP-9、TSP-1二者非共同高表達(dá)的患者，5年DFS和OS分別為87.2%與90.8%，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示這2個指標(biāo)共同高表達(dá)可能預(yù)示患者預(yù)后不良。進(jìn)入多因素Cox回歸風(fēng)險比例模型進(jìn)行分析后(表4，5)，除了腫瘤大小、組織學(xué)分級為影響患者DFS和OS的獨立預(yù)后因素之外，MMP-9、TSP-1共同過表達(dá)也成為影響DFS的獨立預(yù)后因子(P=0.028，危險比為2.288，95%CI為1.094～4.786)，但是對OS的影響接近有意義的統(tǒng)計學(xué)差異(危險比為2.169，95%CI為0.963～4.887)。

3　討　論

TSP-1是一種高分子量的糖蛋白，主要來源于腫瘤間質(zhì)，是一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，在腫瘤微環(huán)境中廣泛與其他蛋白相互作用，從而影響活化的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的水平。TSP-1還可以調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)的構(gòu)成以及間質(zhì)中MMP的活性[3]，這其中也包括了MMP-9，而且TSP-1表達(dá)還可以影響到腫瘤組織中MMP-9的表達(dá)量[4]，從而進(jìn)一步影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。此外疾病病程中，TSP-1和MMP-9亦可以參與病變組織中微血管生成，從而影響疾病的發(fā)展[5-6]。

筆者的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織間質(zhì)中TSP-1蛋白的表達(dá)同腫瘤間質(zhì)中的MVD存在弱的負(fù)相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.241，P=0.006)，與Fontana等觀察到的結(jié)果一致[7]。而Rice等并未在乳腺導(dǎo)管原位癌病例中發(fā)現(xiàn)間質(zhì)TSP-1的表達(dá)與MVD的高低存在著相關(guān)[8]，這與浸潤性乳腺癌和導(dǎo)管原位癌有著不同的腫瘤微環(huán)境相關(guān)，腫瘤發(fā)展的不同時期,血管的生成受微環(huán)境中多種促血管生成因子(如VEGF等)和抑制血管生成因子共同作用，因而筆者觀察到浸潤性乳腺癌間質(zhì)TSP-1蛋白的表達(dá)確實同MVD存在著負(fù)相關(guān)，但是相關(guān)性很弱，與其他調(diào)節(jié)血管生長因子的作用影響相關(guān)。Naumov等發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的早期階段，僅有一小部分腫瘤細(xì)胞具有促血管生成能力和發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時間質(zhì)成纖維細(xì)胞中增加TSP-1的表達(dá)，并發(fā)揮抑制血管生成和腫瘤生長的作用；以后隨著腫瘤的進(jìn)展，延長TSP-1的作用時間，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生轉(zhuǎn)變，增加VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等促血管生成因子的表達(dá)，并激活PI3K/MYC信號傳導(dǎo)途徑，此時高水平的VEGF可慢慢抑制TSP-1的作用，并促進(jìn)血管生成，但何時發(fā)生轉(zhuǎn)變還不明確[9]。

表4　MMP-9、TSP-1共同高表達(dá)及臨床病理參數(shù)對乳腺癌患無病生存率影響的多因素Cox回歸風(fēng)險比例模型

ER：雌激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9.B：回歸系數(shù)；SE：標(biāo)準(zhǔn)誤；Wald：χ2統(tǒng)計量；df：自由度；Sig：顯著性檢驗值；Exp(B)：危險比；95%CI：95%可信區(qū)間.

本課題通過免疫組織化學(xué)檢測方法對腫瘤細(xì)胞MMP-9陽性表達(dá)和腫瘤間質(zhì)中TSP-1高表達(dá)分別與乳腺癌的各種常見臨床參數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者共同表達(dá)與腫瘤體積大(T3+T4)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期高均密切相關(guān)。隨后的生存分析發(fā)現(xiàn)，MMP-9、TSP-1陽性以及二者共同陽性表達(dá)病例相對于MMP-9、TSP-1陰性以及二者非共同陽性表達(dá)病例，其5年DFS及OS均顯著降低，經(jīng)過多因素Cox回歸風(fēng)險比例模型分析后，發(fā)現(xiàn)MMP-9、TSP-1共同陽性表達(dá)可顯著降低乳腺癌患者的5年DFS。

表5　MMP-9、TSP-1共同高表達(dá)及臨床病理參數(shù)對乳腺癌患者總生存率影響的多因素Cox回歸風(fēng)險比例模型

ER：雌激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9.B：回歸系數(shù)；SE：標(biāo)準(zhǔn)誤；Wald：χ2統(tǒng)計量；df：自由度；Sig：顯著性檢驗值；Exp(B)：危險比；95%CI：95%可信區(qū)間.

近年來不少文獻(xiàn)針對TSP-1和MMP-9表達(dá)同惡性腫瘤預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果并不完全一致，有的甚至相互矛盾。在TSP-1表達(dá)與腫瘤預(yù)后的研究中，部分腫瘤TSP-1的陽性表達(dá)同腫瘤的預(yù)后良好相關(guān)，例如胃癌、黏液表皮樣癌中TSP-1陽性表達(dá)提示著患者預(yù)后良好[10-11]，而在膀胱癌中卻是預(yù)后不良的指標(biāo)[12]。此外Maeda等發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，TSP-1陽性表達(dá)抑制腫瘤微血管形成，且陽性表達(dá)患者預(yù)后和肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率優(yōu)于陰性表達(dá)的患者，是一個預(yù)后良好的指標(biāo)[13]；然而在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中，TSP-1的表達(dá)卻是預(yù)后不良的標(biāo)記[14]。這可能和TSP-1在不同腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的調(diào)節(jié)血管生長、腫瘤間質(zhì)塑造等發(fā)揮的作用不同有關(guān)。

MMP-9高表達(dá)常出現(xiàn)在浸潤性癌癥中，并成為惡性腫瘤的一個獨立的預(yù)后因子。例如，在卵巢癌中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MMP-9，其10年DFS也高[15]；但是在胃癌中，高表達(dá)MMP-9會降低患者與腫瘤相關(guān)的生存率[16]；食管癌中，MMP-9高表達(dá)常同腫瘤浸潤深度、淋巴管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤低分化密切相關(guān)[17]；而在前列腺癌中，MMP-9的高表達(dá)同腫瘤的高Gleason分級相關(guān)，同預(yù)后無關(guān)[18]。這些研究結(jié)果提示，TSP-1和MMP-9的陽性表達(dá)對惡性腫瘤的預(yù)后影響是依不同性質(zhì)的腫瘤而改變的。

目前在通過免疫組織化學(xué)方法檢測MMP-9蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況和乳腺癌患者的預(yù)后關(guān)系的研究中，大多認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)越高，患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性就越大，生存期越短。Giannelli和Zeng等學(xué)者通過免疫組織化學(xué)方法證實，高表達(dá)MMP-9的乳腺癌同腫瘤侵襲性強、預(yù)后不佳相關(guān)[19-20]。Puzovic等研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中，MMP-9、MMP-2和ETS-1共同高表達(dá)的患者是患者預(yù)后不良的一個獨立影響因子，而MMP-9蛋白的表達(dá)并不是一個獨立預(yù)后因子[21]。這個與筆者的研究結(jié)果類似，腫瘤細(xì)胞中MMP-9蛋白單一指標(biāo)表達(dá)改變可能不足以影響患者的預(yù)后，聯(lián)合其他預(yù)后指標(biāo)共同表達(dá)的情況可能可以更準(zhǔn)確預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后。對乳腺癌的基因表達(dá)譜進(jìn)行大規(guī)模分析后表明，MMP-9基因表達(dá)高低和乳腺癌侵襲性密切相關(guān)，是乳腺癌一個重要的預(yù)后指標(biāo)[22]。

本研究結(jié)果表明，通過較為簡單的免疫組織化學(xué)檢測，分析乳腺癌間質(zhì)中TSP-1的表達(dá)可以抑制腫瘤組織中微血管生成，此外腫瘤間質(zhì)中TSP-1與腫瘤細(xì)胞中MMP-9的共同高表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，二者共同表達(dá)的情況可以作為判斷乳腺癌不良預(yù)后的指標(biāo)之一。

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(編輯：何佳鳳)

Expression and Prognostic Significance of TSP-1 and MMP-9 in Breast Cancer

FU Fangmeng, HUANG Jianping, HUANG Meng, WANG Chuan

Department of Breast Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo investigate how the expression of Matrix metalloproteinases 9 (MMP-9) and Thrombospondin 1 (TSP-1) would be related to microvessel density (MVD) in breast cancer and its implication for the prognosis.MethodWith immunohistochemical staining method, the expression level of MMP-9 and TSP-1 were measured in tissues from 131 breast cancer patients.The relation between the two biomarkers and MVD and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsIn 131 breast cancer patients, expression of TSP-1 in stroma was negatively related to MVD (Spearman relation index=-0.241,P=0.006).The co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was significantly related to tumor size, lymph node metastasis, and pathological stage(P<0.05).And survival analysis revealed that co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was unfavorable prognostic factor in breast cancer.ConclusionMMP-9/TSP-1 co-overexpression was an independent unfavorable prognostic factor for breast cancer.

breast neoplasms; thrombospondin 1; matrix metalloproteinase 9; matrix metalloproteinases; capillaries; prognosis

2016-03-02

福建省衛(wèi)生廳青年基金(2009-2-28)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福州350001

傅芳萌(1978-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士

王川. Email:chuanwang68@qq.com

R345.63； R345.9； R730.7； R737.9； R977.6

A

1672-4194(2016)05-0295-07