趙艷琴，吳元華，趙秀香，安夢楠，陳建光

1 內蒙古民族大學 / 農學院，內蒙古通遼霍林河大街 22 號 028043；2 沈陽農業(yè)大學 / 植物保護學院，遼寧沈陽市東陵路 120 號 110866

應用Taqman探針實時熒光定量PCR技術檢測煙草靶斑病菌Rhizoctonia solaniAG-3 方法的建立

趙艷琴1，吳元華2，趙秀香2，安夢楠2，陳建光2

1 內蒙古民族大學 / 農學院，內蒙古通遼霍林河大街 22 號 028043；2 沈陽農業(yè)大學 / 植物保護學院，遼寧沈陽市東陵路 120 號 110866

分別基于7個煙草靶斑病菌株基因組中ITS-5.8S rDNA序列設計引物和探針; 并對引物及探針特異性進行驗證; 建立檢測體系并對接種煙草靶斑病菌的葉片和土壤中的煙草靶斑病菌進行檢測。結果表明：所設計的引物及探針對R.solaniAG-3 具有特異性，檢測體系可以檢測出煙草葉片及土壤樣品中的煙草靶斑病菌。接種煙草葉片的檢測表明, 接種后6h就可檢測到強致病力菌株YC-9，12h后能檢測到弱致病力菌株LF-2；獲得了煙草靶斑病菌DNA質量的對數(shù)與添加菌絲量的對數(shù)之間的回歸曲線方程，對不同月份土壤樣品的測定結果表明煙草靶斑病菌在土壤中呈周年動態(tài)變化趨勢。

煙草靶斑病菌；AG-3；實時熒光定量PCR；煙草

煙草靶斑病（Rhizoctonia solanikühn）近年來在我國煙草旺長期和成熟期大面積發(fā)生，因其潛育期短、流行性強的特點，對煙葉的產量和品質造成嚴重的影響[1-2]。其病原菌R. solani是一種土壤習居菌，可以通過土壤中的菌核進行土壤傳播，其有性態(tài)瓜亡隔菌（Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk）也可以通過形成的大量擔孢子進行氣流傳播，因此對在煙草葉片及土壤中的煙草靶斑病菌進行定量檢測和監(jiān)測對防治該病害具有重要意義。實時熒光PCR技術（Realtime quantitative PCR, QPCR）已經被用來快速鑒定及定量許多植物病原真菌、植物病毒及植物病原細菌。閆佳會等曾采用該技術對小麥條銹菌在田間的潛伏侵染進行了定量檢測研究[3]；李瓊等應用Taqman探針real-time PCR技術對稻瘟病菌的侵染進行了早期檢測[4]；丁翠珍對蘭花褐斑病菌進行了定量檢測[5]；康振輝對土壤中煙草根腐病菌進行了定量檢測[6]；周國梁和陳長軍分別對油菜莖基腐病菌和油菜菌核病菌進行了定量檢測研究[7-8]；陶萌和王淑芳等采用該技術研究粉紅粘帚霉對水稻紋枯病的田間防治效果[9-10]；趙文軍和朱云聰分別應用該技術檢測番茄環(huán)斑病毒和番茄黃化曲葉病毒在番茄體內的動態(tài)變化情況[11-12]。R. solani作為重要的植物病原菌，可以引起多種植物病害[13-14]，對其進行定量研究有利于明確病害的發(fā)生及動態(tài)變化，而傳統(tǒng)技術多采用活體分離、土壤誘捕等措施進行研究[15-16]，Lees等2000年將Real-time PCR技術首次應用于馬鈴薯黑痣病菌AG-3融合群在土壤中的定量檢測的研究中[17]；此后，Sayler等從感病水稻植株上定量檢測了水稻紋枯病菌AG-1-IA融合群[18]；邢楠也應用該技術研究了水稻紋枯病的周年動態(tài)變化[19]；徐娜娜應用Real-time PCR技術建立了檢測土壤中小麥紋枯病菌的方法[20]。但目前煙草靶斑病菌R. solaniAG-3除采用常規(guī)PCR方法對其進行檢測鑒定外[21]，國內外尚未見到對該病菌的定量檢測研究的報道。本研究根據煙草靶斑病菌rDNA-ITS區(qū)序列設計了一對特異性引物及探針，并建立從葉片及土壤中檢測煙草靶斑病菌的實時定量PCR檢測體系，為實時監(jiān)測煙草靶斑病菌數(shù)量，揭示其發(fā)病規(guī)律及流行動態(tài)等奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為感病煙草品種K326，煙草靶斑病菌株（R. solaniAG-3）YC-9、BKS-5、LJT-8、LF-2、DB-3、YMC-8及QYS-7，其他R. solani融合群的AG-1-IA、AG-1-IB、AG-1-IC、AG-2-1、AG-2-IV、AG-2-IIIB、AG-3、AG-4-HGI、AG-4-HGII、AG-5、AG-6-HGI、AG-6-GV、AG-8、AG-9及AG-BI菌株，常見煙草上病菌包括煙草立枯病菌YCLK、煙草莖基腐病菌YCJJF、煙草赤星病菌YCCX和煙草黑脛病菌YCHJ，各菌株按此順序標記序號1-26，以上菌株及煙草均由沈陽農業(yè)大學煙草所鑒定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Agilent Technologies Strategene MX3000P 實時熒光PCR儀（美國ABI 公司，ABI7500）；Nanodrop-ND-1000微量紫外分光光度計；LEGEND MICRO 17R型冷凍高速離心機。

新型植物基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；土壤基因組DNA 提取試劑盒購自德國MACHEREY-NAGEL公司NucleoSpain Soil 土壤提取試劑盒，引物和探針合成及其他PCR試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，DNA 測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙草接種及葉片總DNA提取

將強致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2于PDA平板上活化后，28℃培養(yǎng)3d后，采用3mm打孔器打取菌餅，采用離體葉片針刺接種法分別接種YC-9和LF-2菌餅于K326葉片上，第張葉片針刺接種4個菌餅，以接種空白PDA圓片為對照，分別于接種0、6、12、24、36、48及72h后用打孔器以病斑為圓心切取病斑組織，并記錄測量病斑直徑。

取上述接種0、6、12、24、36、48及72h的病斑組織各約300mg，加液氮迅速研磨成粉并轉入1.5mL的滅菌離心管中，采用北京天根生物技術公司的植物型DNA提取試劑盒提取DNA，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 土壤接種及土壤總DNA提取

參考王淑芳等含菌絲土壤制作方法[22]，制備菌絲段懸浮液并接種土壤，分別制備添加菌絲濃度為5.0×10-1mg/g、5.0×10-2mg/g、5.0×10-3mg/g、5.0×10-4mg/g和5.0×10-5mg/g的土壤樣品，第份土壤樣品3個重復。用于制作含菌絲土壤樣品的標準曲線。

分別于2012年4月20日、5月14日、6月28日、7月17日、8月9日、8月27日、11月7日，按五點取樣法采集丹東市毛甸子鎮(zhèn)煙田(N 40°35′49″，E 124°39′26″) 0～4cm土層的土壤樣品。將11月7日所采土壤樣品帶回試驗室至于置于沈陽農業(yè)大學煙草研究所試驗田中，分別于12月9日、2013年l月21日、2月26日及3月16日采樣。共11份不同月份樣品，第份樣品3次重復。將各月土壤樣品分別敲碎充分混勻，過2mm直徑的篩，第個土壤樣品取3個重復，于-80℃下保存?zhèn)溆?。另取各月份土壤樣?0g于80℃下烘干計算含水量。

所采集土壤樣品按照采集時間月日進行標記，第個樣品取3次生物重復，采用德國MACHEREYNAGEL公司NucleoSpain Soil 土壤提取試劑盒進行土壤總DNA的提取，選用SL1為裂解液，按照說明書進行土壤DNA樣品提取，所獲得DNA樣品于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 煙草靶斑病菌 ITS-5.8S rDNA特異引物和Taqman 探針的設計及合成

依據煙草靶斑病菌ITS-5.8S區(qū)序列（GeneBank登陸號：HQ827784，JQ219151- JQ219156），采用Clustal X多重比對后，采用DNAMAN 軟件分別設計煙草靶斑病菌特異性引物和Taqman 探針。并對探針5’端標記報告熒光染料6-Carboy fl uorescein(FAM)，3’端標記淬滅熒光染料Tetramethy1-6-carboxyrhodamine( TAMRA)。引物及探針均由大連寶生物公司合成并標記熒光。

1.3.4 引物的特異性靈敏度檢測及標準曲線制作

1.3.4.1 引物的特異性檢測

以1.3.1中供試樣品的DNA為模板，采用1.3.3中設計的引物進行常規(guī)PCR擴增。反應體系如下：2.5μL 10×PCR buffer(TaKaRa), 1.5μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture (TaKaRa), 1μL 10Lmol/L正反引物混合液, 0.5μL模板DNA, 0.2μL 5U/μLTaq酶, 19.3μL ddH2O。反應程序為: 94℃3 min; 94℃1 min, 65℃30 s, 72℃1 min, 35個循環(huán); 72℃延伸7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V, 30min)，Goldview染色后，用Alpha Imager 2200成像系統(tǒng)拍照。

1.3.4.2 煙草靶斑病菌標記序列的克隆

將LJT-8菌株ITS序列片段 653 bp 的 PCR 產物，經1%的瓊脂糖凝膠電泳，用上海生工凝膠回收試劑盒回收DNA片段。在T4 DNA連接酶的作用下與pMD18 -T載體連接，轉入大腸桿菌DH5α，獲得含ITS-5.8S序列陽性克隆。采用北京康為世紀的質粒提取試劑盒，利用NanoDrop ND-1000測定質粒的濃度和純度，測序后獲得正確插入外源片段的質粒即為標準品。

1.3.4.3 標準曲線制作及不同月份土壤樣品的Realtime PCR檢測

采用大連寶生物技術公司生產的Easy Dilution將質粒10倍梯度稀釋，分別獲得104pg/μL、103pg/μL、102pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL和10-1pg/μL樣品，將各濃度樣品各取3個重復，采用Aglient strategene MX3000P進行Real-time PCR反應，并擬合標準曲線；并以所采集的不同月份土樣總DNA為模板進行Realtime PCR反應，反應體系及擴展程序如下：

Real-time PCR反應體系為: 10μL SYBR green I mixture (TaKaRa)，1μL 2μmol/L正反引物混合液，0.4μL ROX，1μL模板DNA，7.6μL ddH2O。通過溶解曲線判斷是否有唯一的產物峰。反應程序為: 95℃預變性2min，95℃20s，60℃30s，72℃1min，40個循環(huán)，于第2階段的退火階段采集熒光信號，以臨界循環(huán)值Ct為縱坐標，模板數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，擬合標準曲線。

2 結果分析

2.1 引物的特異性常規(guī)PCR驗證

通過對煙草靶斑病菌R. solaniAG-3、其他融合群ITS和煙草其它病原菌ITS-5.8S DNA序列比對設計引物及探針序列如下：RsTqF1:5’-ACCCTACTGATGACCTCG-3’ RsTqR4: 5’- AGAC AGAAGGGTTCAATGACTTATTATA-3’， Taqman 探針: 5’-TTTAGGCATGTGCACACCTTTCTCTTTC-3’。

采用引物對進行常規(guī)PCR擴增，由圖1可知，煙草靶斑病菌YC-9、BKS-5、LJT-8、LF-2、DB-3、YMC-8、QYS-7及標準菌株AG-3都能擴增約150bp出較清晰的條帶，與目的片段一致，而其他融合群標準菌株、煙草赤星病菌YCCX，煙草莖基腐病菌YYJJF，煙草立枯病菌YCLK及煙草黑脛病菌YCHJ無片段被檢測出。這表明該引物針對AG-3菌株具有較強的特異性，可用于R. solaniAG-3的檢測。

圖1 常規(guī)PCR檢測引物的特異性Fig.1 Detecting the speci fi city of primers using conventional PCR

2.2 標準曲線建立

采用所設計的引物及探針進行Real-time PCR檢測，由圖2可知，對含ITS-5.8S序列的靶斑病菌質粒標準品進行10倍梯度稀釋后，進行Real-time PCR擴增，擴增曲線都呈“S”型，制作的標準曲線的靶斑病菌質粒標準品的DNA濃度為104pg/μL、103pg/μL、102pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL和10-1pg/μL的對數(shù)之間有較好的線性關系，相關系數(shù)為0.997，得出DNA濃度的對數(shù)值與Ct值的線性方程為：y=-3.312x+35.928。

圖2 Real-time PCR技術擴增質粒DNA的Ct閾值Fig. 2 Plasmid DNA dilutions measured by real-time PCR cycle threshold (Ct) value.

2.3 接種煙草靶斑病菌樣品Real-time PCR檢測

強致病力菌株YC-9在接種煙草K326 36h后，弱致病力菌株LF-2接種后72h出現(xiàn)分別出現(xiàn)肉眼可見約1mm直徑的病斑。這表明強致病力菌株YC-9侵染速度比弱致病力菌株LF-2快。

圖3所示，在接種YC-9菌株后6h的煙草樣品中就檢測到其DNA，而在接種LF-2菌株12h后，在煙葉樣品中檢測到了其DNA，并且二者均明顯高出NTC背景，結果可靠。這表明該檢測體系能較早的檢測出葉片組織中的煙草靶斑病菌，且強致病力菌株YC-9侵入速度明顯比弱致病力菌株LF-2侵入迅速。

圖3 采用YC-9和LF-2接種后的其DNA在煙草離體葉片中的定量Fig. 3 Quanti fi cation of R. solani infection in detached tobacco leaves 3 days after pathogen inoculation using a strong pathotype strain (YC-9) and a weak pathotype strain (LF-2)

2.4 人工接種土壤的Real-time PCR檢測標準曲線的建立

菌絲濃度為500～0.05 mg/g干土樣品的Realtime PCR檢測結果表明，第濃度3次重復之間的質量變化不大。各樣品的濃度為均值在1.59～83785.82 pg之間。在菌絲濃度為 0.05mg/g干土時，Ct值為34.9左右，目的片段的質量為1.70～5.09 pg；而對照土壤樣品中的背景質量在1.59～2.31 pg之間，Ct為36，可將其視為本底信號，將各數(shù)據轉換為對數(shù)值如表1所示。

表1 煙田土壤中添加不同濃度的煙草靶斑病菌菌絲后 DNA 擴增效果及分析（P=0.05）Tab. 1 DNA amplication of R. solani added at different density in non-sterile soil（P=0.05）

以第g干土添加菌絲質量的Lg值作為 X 軸，以扣除了未添加菌絲的干土的本底后的質量平均值的Lg值作為Y軸，獲得回歸方程Y=1.1908X+1.6973（圖4），其R2為0.9811。

圖4 每克干土中菌絲添量的對數(shù)與扣除本底質量后樣本均值的對數(shù)的線性關系圖Fig. 4 Plot generated by plotting log of the mycelium addition in dry soil per gram versus the log of average DNA copy number

2.5 煙田土壤樣品的Real-time PCR檢測

對各月份土壤DNA及標準品進行Real-time PCR擴增，根據2.5方程回歸方程計算出煙草靶斑病菌各月份樣品中質量，并折算出0.02g干土中所含煙草靶斑病菌的質量，如表2所示：自5月中下旬土壤中煙草靶斑病菌的數(shù)量逐漸升高，到6月28日達到最高，此后開始下降；8月末煙草靶斑病菌在土壤中數(shù)量開始增加，直到1月21日達到最高；此后煙草靶斑病菌下降至4月份達到最低水平。在各月份樣品檢測數(shù)據中，有的月份檢測三次重復數(shù)值之間差異較大，這可能是由于靶斑病菌在土壤中分布并不均勻所致。在田間煙草靶斑病在一些地塊6月下旬就已經可以出現(xiàn)在下部葉片上了，這與本試驗中6月28日的數(shù)據最高基本一致；毛甸子地區(qū)在7、8月份由于降水較多導致土壤中含水量較大，在檢測樣品中并沒有發(fā)現(xiàn)預期的較大的測定數(shù)據，這可能是因為該月份所采集土壤樣品中水分較大對土壤樣品中的靶斑病菌的DNA提取效率造成了影響，或者是該時間段田間環(huán)境條件更加適病菌的有性態(tài)生長，產生大量擔孢子，在植株地上部進行為害。尤其過多的水分造成泡田不適合菌核及菌絲的形成。此后，隨著氣溫的下降靶斑病菌開始為度過不良環(huán)境條件形成菌核，在土壤中有所增加。進入12月以后毛甸子地區(qū)氣溫以零下為主，土壤中靶斑病菌變化不大。

表2 各月土壤樣品(3次重復)的定量結果Tab. 2 Quantitative results of soil samples collected each month (3 replicates)

3 結論與討論

本研究通過比較煙草靶斑病菌R. solaniAG-3與其他融合群ITS序列上的差別設計了一對特異性引物及探針，對接種不同致病力煙草靶斑病菌的煙草葉片進行定量檢測結果表明該引物及探針可以檢測出煙草靶斑病菌，0-72h內，煙草靶斑病病菌在組織中成增加趨勢，并且強致病力菌株YC-9數(shù)量增加較弱致病力菌株LF-2快，這揭示了煙草靶斑病菌菌株間存在致病力分化，強致病力菌株在致病中能更快速的增加，最終造成嚴重的病害；該技術嘗試對煙田土壤煙草靶斑病菌進行了定量研究，研究結果揭示了煙草靶斑病菌可以在0-4cm土層中越冬，不同月份土壤中的煙草靶斑病菌呈動態(tài)變化趨勢。

對于土壤及生長中的真菌的檢測是很困難的，傳統(tǒng)技術采用感病寄生誘捕、濕篩分離及直接的微觀檢查等技術進行R. solani定量地調查研究[16,23]，這些方法都僅費時費力，很難大規(guī)模開展研究提供準確的數(shù)據，定量結果也不可信。Lees等首次嘗試采用Real-time PCR檢測技術分析馬鈴薯黑痣病菌的流行動態(tài)問題，討論將其作為一個決策性的工具來指導該病害的防治。Lees等基于ITS區(qū)序列設計對R. solaniAG-3特異的PCR 引物及探針，應用其檢測無可見癥狀的薯塊組織和土壤中的病菌[17]。本文的研究結果與其基本一致，煙草靶斑病菌與馬鈴薯黑痣病菌同源性較高，參考其ITS區(qū)序列設計檢測煙草靶斑病菌的AG-3引物及探針可以特異的檢測出煙草葉片組織及土壤中的煙草靶斑病菌，但Lees等未研究馬鈴薯黑痣病菌在土壤中的周年變化情況。刑楠采用Realtime PCR技術研究了土壤中水稻紋枯病菌R. solaniAG-1的周年動態(tài)變化情況[19]，本文的研究結果與其基本一致，病原菌在土壤中均呈周年動態(tài)變化。

Real-time PCR技術已被應用于土壤中植物病原物的檢測與定量研究，但由于土壤樣品的復雜性而必須建立以添加的病菌的土壤樣品模擬自然情況的標準曲線，對土壤自身的本底信號進行扣除，以使檢測的結果更為準確。Lees等通過添加菌核的土壤模擬自然情況的帶菌土壤，而本文采用添加煙草靶斑病菌新鮮菌絲來建立標準曲線[17]，兩者對檢測結果的影響有待進一步的比較。

此技術的建立對研究煙草靶斑病菌的流行動態(tài)提供了新的方法，可以對揭示R. solani在土壤中的消長情況研究提供較傳統(tǒng)定量方法更為準確的數(shù)據。但因本文中僅僅測定了一年的動態(tài)變化的數(shù)據，還并不能說明代表了自然情況下煙田中煙草靶斑病菌的實際情況，并且由于Real-time PCR技術超級靈敏的特點，試驗中的取樣誤差無法忽略，盡管采用了GPS定位系統(tǒng)，依然無法保證第次從同一地點取樣。在后續(xù)試驗中，可以通過增加田間取樣點及檢測樣品的重復次數(shù)來提高檢測的準確性。此外，煙草靶斑病菌在土壤中是否均勻分布等問題還需要進一步研究。

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Quantitative detection ofRhizoctonia solaniAG-3 in tobacco by Taqman real-time PCR

ZHAO Yanqin1, WU Yuanhua2, ZHAO Xiuxiang2, AN Mengnan2, CHEN Jianguang2
1 College of Agriculture, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, Inner-Mongolia Autonomous Region, China;2 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

A pair of primers and probe was designed based on ITS- 5.8 S rDNA sequences of 7 strainsR. solaniAG-3 and speci fi city was certi fi cated. Detection system was established to detect DNA content of tobacco target spot pathogens from tobacco leaves and soil. Results showed that the designed probes and primers were available to detectR. solaniAG-3 from tobacco leaf and soil samples. Strong virulent strains YC-9 could be detected 6h after inoculation, while weak virulent strains LF-2 could be detected 12h after inoculation. Regression curve equation between logarithmic of DNA copy number and logarithmic of adding amount of hypha for tobacco target spot pathogen was established. Detection of soil samples of di ff erent months showed that tobacco target spot pathogen had an annual dynamic trend in soil.

Rhizoctonia solani; AG-3; quantitative real-time PCR; tobacco

趙艷琴，吳元華，趙秀香,等. 應用Taqman探針實時熒光定量PCR技術檢測煙草靶斑病菌Rhizoctonia solaniAG-3 方法的建立[J]. 中國煙草學報，2016,22（1）

內蒙古民族大學校級課題[NMD1329]；國家煙草專賣局科技項目(國煙辦綜 [2010]182號)和遼寧省煙草專賣局科技攻關項目（遼煙計[2010]86號）

趙艷琴(1978—)，博士，副教授，分子植物病理學，Email：zhaoyanqin782828@qq.com

吳元華(1963—)，博士，教授，植物病理學及生物農藥，Email：wuyh09@vip.sina.com

2015-04-25

: ZHAO Yanqin, WU Yuanhua, ZHAO Xiuxiang, et al. Quantitative detection ofRhizoctonia solaniAG-3 in tobacco by Taqman real-time PCR [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)