黃化剛，申燕，王衛(wèi)峰，連文力，陳雪，翟欣，喻奇?zhèn)ィ瑮钫裰?，賈宏昉

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市文化路95號(hào) 450002；2 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，畢節(jié) 55107；3 中國(guó)煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧 530022

生物技術(shù)

煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表達(dá)分析

黃化剛1,2，申燕2，王衛(wèi)峰3，連文力1，陳雪2，翟欣2，喻奇?zhèn)?，楊振智2，賈宏昉1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市文化路95號(hào) 450002；2 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，畢節(jié) 55107；3 中國(guó)煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧 530022

植物NRT2基因家族（高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因）在植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究根據(jù)NRT2基因家族的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增出一條821bp序列，以此序列為信息探針，通過(guò)電子克隆和RT-PCR的方法從煙草中克隆獲得一個(gè)包含1593bp開(kāi)放閱讀框、編碼530個(gè)氨基酸的cDNA序列，命名為NtNRT2.4。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有NRT家族的共有結(jié)構(gòu)特征，與煙草已發(fā)現(xiàn)的三個(gè)本家族基因同源性達(dá)到77.54%，與擬南芥NRT2家族基因同源性達(dá)到81.63%，其啟動(dòng)子中包含多個(gè)與硝酸鹽、光照及根系特異表達(dá)相關(guān)的元件；組織特異表達(dá)分析結(jié)果顯示，煙草NtNRT2.4基因的組織表達(dá)差異較大，在根部的表達(dá)量較高，在葉片和莖部的表達(dá)量低；不同氮素形態(tài)、光照和蔗糖處理下的基因表達(dá)分析結(jié)果表明，硝態(tài)氮、光照和蔗糖處理誘導(dǎo)NtNRT2.4表達(dá)，而銨態(tài)氮抑制其表達(dá)。

煙草；NtNRT2.4；克??；表達(dá)分析

在煙葉生產(chǎn)過(guò)程中，氮素的用量與煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)形成密不可分[1]。煙草是喜硝態(tài)氮作物，對(duì)土壤中硝態(tài)氮的吸收主要是通過(guò)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成的[2]。到目前為止，在高等植物中已發(fā)現(xiàn)兩種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[3-4]：高親和運(yùn)輸系統(tǒng)(high-affinity transport system, HATS)和低親和運(yùn)輸系統(tǒng)(low-affinity transport system, LATS)。其中HATS的吸收動(dòng)力學(xué)特征符合Michaelis-Mente方程，具有可飽和性，Km值較低，主要負(fù)責(zé)外在硝態(tài)氮濃度低于1 mmol/L時(shí)硝態(tài)氮的吸收；而LATS的吸收動(dòng)力學(xué)或者Km值較高，呈線(xiàn)型不飽和特征，主要負(fù)責(zé)外在硝態(tài)氮濃度高于1 mmol/L時(shí)硝態(tài)氮的吸收。由于高親和硝酸鹽運(yùn)輸系統(tǒng)在低硝態(tài)氮條件下發(fā)揮作用，且部分家族成員受低硝態(tài)氮誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)該系統(tǒng)的研究將有助于提高作物的氮素利用率，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者重點(diǎn)研究熱點(diǎn)。

高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT2家族基因編碼的，屬于MFS (major facilitator superfamily) 超家族成員，主要由12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。第一個(gè)高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因crnA是從曲霉菌中克隆出來(lái)，隨后在衣藻中發(fā)現(xiàn)高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。植物NRT2基因最早是從大麥中分離（HvNRT2.1和HvNRT2.2），近年來(lái)又從水稻、擬南芥、玉米和煙草等高等植物中克隆到硝酸鹽高親和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（NRT2）[5-12]。對(duì)植物NRT2家族成員的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該家族基因不僅受NO3-調(diào)控，還受到pH、光照和糖等因素的影響[11]。對(duì)擬南芥的研究結(jié)果證實(shí)AtNRT2.1基因的mRNA表達(dá)與硝酸鹽的吸收速率成正比，白天高晚上低，表明光照對(duì)一些NRT2家族基因起調(diào)節(jié)作用；同時(shí)在遮光下供應(yīng)蔗糖可以提高AtNRT2.1基因轉(zhuǎn)錄水平[13]。目前已從煙草中克隆出高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT2家族成員有3個(gè)（預(yù)測(cè)可能有5～8個(gè)），均與硝酸鹽吸收密切相關(guān)，但對(duì)于該家族成員是否受光和蔗糖調(diào)控還未見(jiàn)報(bào)道[13-14]。

本研究根據(jù)煙草、擬南芥和水稻等物種NRT2基因序列，采用同源序列克隆法獲得煙草NRT2基因家族新成員NtNRT2.4，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、光照和糖的應(yīng)答機(jī)制的研究，為利用NRT2基因改良煙草的氮素吸收和調(diào)控能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究以普通煙草品種K326為試材，煙草植株培養(yǎng)在16h/8h (光/暗)周期的培養(yǎng)箱中，光強(qiáng)為300μmol. m-2·s-1，溫度設(shè)置為25°C/21°C (光/暗)，相對(duì)濕度設(shè)置為60%。待培養(yǎng)至3-4片真葉后，選取大小一致的幼苗移至沙培育苗盤(pán)中，營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至五葉期，營(yíng)養(yǎng)液的配方及濃度為：2mM KNO3，1 mM NH4NO3，1 mM NaH2PO4，0.5 mM Ca(NO3)2，0.25 mM CaCl2，0.5 mM MgSO4，20μM Fe-EDTA，9μM MnCl2，46μM H3BO3，8μM ZnSO4，3μM CuSO4，0.03 μM (NH4)2MoO4，pH調(diào)至6.0左右。氮素形態(tài)試驗(yàn)設(shè)置正常供氮處理（1 mmol/L NO3-和1 mmol/L NH4+）、缺氮處理（無(wú)氮素）、單一銨態(tài)氮NH4+（2 mmol/L NH4+）和單一硝態(tài)氮NO3-（2 mmol/L NO3-）共4個(gè)處理，處理時(shí)間為7d，第個(gè)處理設(shè)置10棵煙株。處理后收集煙株的根、莖和葉片，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱凍存，用于基因表達(dá)分析。光照應(yīng)答機(jī)制試驗(yàn)是在硝態(tài)氮處理（2 mmol/L NO3-）條件下取一個(gè)光周期內(nèi)（16h光照/8h黑暗）的樣品，第隔4h取一次，共取6次（首次取樣為早6:00，光照開(kāi)始），研究光暗交替條件下該基因的表達(dá)規(guī)律，無(wú)對(duì)照；以光暗交替試驗(yàn)為對(duì)照，在光照應(yīng)答機(jī)制研究的基礎(chǔ)上設(shè)置黑暗時(shí)間點(diǎn)添加外源糖試驗(yàn)，研究外源糖處理對(duì)該基因表達(dá)的影響；光照和蔗糖試驗(yàn)樣品均只取根系，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱凍存，用于基因表達(dá)分析。

1.2 NtNRT2.4基因及啟動(dòng)子的克隆

參考GenBank收錄的煙草、擬南芥和水稻等物種NRT2基因序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)煙草兼并引物（表1-NRT2兼并引物），選取兼并引物在普通煙草K326中擴(kuò)增的片段序列（821bp）作為信息探針，應(yīng)用 Sol genomics network和NCBI網(wǎng)站的Blast程序搜索煙草EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)。利用DNAstar軟件中的Seqman程序?qū)⑺阉鞯降腅ST序列與種子序列進(jìn)行拼接、比對(duì)和組裝，以組裝的重疊群（contig）序列作為信息探針在煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索和拼接，獲得煙草NRT2基因及啟動(dòng)子的電子延伸序列。在獲得NRT2.4基因和啟動(dòng)子拼接序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增NRT2.4全長(zhǎng)基因及啟動(dòng)子的引物（表1），以缺氮處理的煙草根部位cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min ；94℃ 30 s ，58℃30s，72℃ 2min ，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。將擴(kuò)增目的片段連接在中間載體pMD19-T上，送Invitrogen生物公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 序列分析方法

利用DNAStar軟件的ORF fi nder進(jìn)行基因序列ORF區(qū)的查找和蛋白翻譯；利用DNAMAN進(jìn)行擬南芥和煙草的NRT2家族核苷酸和氨基酸序列比對(duì)；利用NetPhos 2.0 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）軟件對(duì)NtNRT2.4的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)；利用SMART程序和ScanProsite (au.expasy.org/prosite)網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白特性；利用TMPRED軟件(http://ch.embnet.org/cgi-bin/TMPRED)進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)；利用PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線(xiàn)工具對(duì)啟動(dòng)子序列元件進(jìn)行分析。

1.4 NtNRT2.4基因表達(dá)分析

采用Trizol法提取煙草根、莖和葉三個(gè)部位的總RNA，樣品通過(guò)隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)煙草NRT2.4基因的擴(kuò)增引物(表1-RT-NRT2.4)。以煙草組成型表達(dá)基因L25作為內(nèi)參。按照Invitrogen公司的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RTPCR，實(shí)時(shí)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法[12]進(jìn)行分析，假設(shè)目的基因在脅迫處理下的表達(dá)量是對(duì)照（正常培養(yǎng)）的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt = Treat（Ct樣品 - CtL25）- CK（Ct樣品 - CtL25）。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtNRT2.4基因的克隆與序列分析

通過(guò)設(shè)計(jì)NRT2基因家族的兼并引物，以缺氮處理2周的普通煙草（K326）根系cDNA為模板，擴(kuò)增出一條821bp的未知序列，測(cè)序后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)橐粋€(gè)未報(bào)道的煙草NRT2家族基因（結(jié)果未顯示）。以此序列為信息探針，在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到20條高度同源序列，電子拼接后獲得一條長(zhǎng)度為2010 bp的煙草NRT2基因序列。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)跨起始密碼子和終止密碼子的引物（表1-NRT2.4 full length），RTPCR擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)測(cè)序，結(jié)果表明該序列與電子拼接結(jié)果一致。全長(zhǎng)1593bp（圖1），編碼530個(gè)氨基酸。

圖1 煙草NtNRT2.4基因的全長(zhǎng)cDNA序列Fig. 1 Full length cDNA sequences of NtNRT2.4 in tobacco

Blast序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，克隆基因與已知同科植物NtNRT2基因編碼的氨基酸序列高度同源(圖2)，與煙草已發(fā)現(xiàn)的三個(gè)本家族基因同源性達(dá)到77.54%，其中與NtNRT2.1基因的同源性為69.13%，與NtNRT2.2基因的同源性為69.90%，與NtNRT2.3基因的同源性為54.62%。進(jìn)一步把該基因與擬南芥家族基因(AtNRT2.1-2.4)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與擬南芥NRT2家族同源性高達(dá)81.63%。結(jié)果表明該cDNA序列為煙草NRT2家族基因新成員，將該基因命名為NtNRT2.4。

圖2 煙草和擬南芥NtNRT2家族的氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of the predicted amino acid sequences of NtNRT2 in tobacco and Arabidopsis

2.2 NtNRT2.4編碼的蛋白質(zhì)生物學(xué)信息分析

2.2.1 NtNRT 2.4 基因序列分析

為預(yù)測(cè)NtNRT2.4基因的基本功能，本研究通過(guò)ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)工具分析NtNRT2.4蛋白的氨基酸序列，結(jié)果表明該基因編碼530個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)為9.34，分子量57.974kD，化學(xué)式為C4992H8371N1609O2116S333，包括26個(gè)酸性氨基酸（Asp +Glu）殘基，39個(gè)堿性氨基酸（Arg + Lys）殘基。進(jìn)一步分析其不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ），發(fā)現(xiàn)NtNRT2.4基因編碼的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為33.08，屬于比較穩(wěn)定的蛋白，符合硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT2家族的蛋白特征。

蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過(guò)程在細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物的代謝調(diào)控過(guò)程中起重要作用，為驗(yàn)證NtNRT2.4所編碼蛋白能否通過(guò)磷酸化和去磷酸化起作用，利用NetPhos 2.0 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）軟件對(duì)NtNRT2.4的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)NtNRT2.4氨基酸序列有9個(gè)絲氨酸，7個(gè)蘇氨酸和3個(gè)酪氨酸，推測(cè)在這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化。

2.2.2 NtNRT2.4的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)TMHMM（http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0）軟件分析NtNRT2.4的跨膜結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果如圖3所示，NtNRT2.4包括6個(gè)N端的跨膜區(qū)以及6個(gè)C端的跨膜區(qū)；氨基酸N末端朝向細(xì)胞內(nèi)，C末端朝向細(xì)胞外，12個(gè)疏水的跨膜區(qū)域由一個(gè)帶電荷的親水區(qū)分隔成2組，第組各6個(gè)，在第六個(gè)和第七個(gè)跨膜區(qū)之間有一個(gè)中央親水環(huán)分隔開(kāi)。結(jié)果表明NtNRT2.4是膜整合蛋白，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋，具有NRT2家族的共有結(jié)構(gòu)特征。

圖3 NtNRT2.4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 Transmembrane (TM) topology models of NtNRT2.4

2.2.3 NtNRT2.4同源性分析與功能預(yù)測(cè)

圖4 NtNRT2.4的同源性分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of tobacco NtNRT2.4 and other plant NRT2 homologs

利用ClustalX和DNAMAN等聚類(lèi)比較軟件，將NtNRT2.4基因序列植物中已知擬南芥和煙草的NRT2家族基因進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析，研究NtNRT2.4基因與其余家族成員的關(guān)系以及潛在功能。結(jié)果如圖4所示，與煙草NtNRT2.4同源關(guān)系最近的為雙子葉植物擬南芥AtNRT2.3。前人研究結(jié)果表明AtNRT2.3主要在根中表達(dá)且受硝酸鹽調(diào)控，負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收，我們推測(cè)NtNRT2.4基因具有與擬南芥AtNRT2.3基因相似的功能。

2.3 NtNRT2.4 啟動(dòng)子的克隆及分析

圖 5 煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NtNRT2.4基因啟動(dòng)子克隆及分析Fig. 5 Cloning and analysis of NtNRT2.4 promoter from tobacco

以煙草NtNRT2.4基因全長(zhǎng)序列為探針，利用Sol genomics network網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索，在ATG上游發(fā)現(xiàn)一段長(zhǎng)1000bp的啟動(dòng)子序列。設(shè)計(jì)引物（表1-NRT2.4 Pro）擴(kuò)增該目的片段，測(cè)序發(fā)現(xiàn)該片段與Sol genomics network網(wǎng)站上傳序列一致。進(jìn)一步利用PLANTCARE程序?qū)tNRT2.4基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行motif分析，除發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子所必須的TATABOX和CAAT-BOX外，在NtNRT2.4啟動(dòng)子中有很多與組織特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，例如Root motif box (ATATT)，還有可能與硝酸鹽調(diào)控有關(guān)的A(C/G)TCA，氮信號(hào)相關(guān)的GATABOX (GATA)和DOFCOREZM (AAAG)，與光照相關(guān)的3-AF、BOX-I等(圖5)。這些順式調(diào)控元件可以作為研究基因啟動(dòng)子表達(dá)和調(diào)控機(jī)制的研究依據(jù)。

2.4 NtNRT2.4的表達(dá)特性

2.4.1 不同氮素形態(tài)下 NtNRT2.4的組織表達(dá)特性分析

本研究利用半定量和定量PCR方法進(jìn)一步分析了煙草NtNRT2.4基因的組織表達(dá)特性，結(jié)果表明：NtNRT2.4基因在煙草的根、莖和葉均有表達(dá)，但組織間的表達(dá)差異較大，NtNRT2.4基因在煙草根部的表達(dá)量最高，是葉片和莖部的表達(dá)量的4-5倍；半定量RT-PCR結(jié)果顯示莖和葉基本檢測(cè)不到表達(dá)量(圖6)；對(duì)不同氮素形態(tài)的研究表明該基因受硝態(tài)氮調(diào)控增強(qiáng)表達(dá)，比正常供氮條件下提高40%-60%，且在缺氮條件下該基因表達(dá)量最高，達(dá)到正常供氮條件下的2倍。相反的，該基因受銨態(tài)氮影響降低表達(dá)，其中根部表達(dá)量?jī)H有正常供氮條件下的60%。

圖6 不同氮素形態(tài)下NtNRT2.4的組織表達(dá)分析Fig. 6 Expression patterns of NtNRT2.4 in tobacco

2.4.2 光和蔗糖對(duì)NtNRT2.4的表達(dá)特性影響分析

圖7 煙草根系NtNRT2.4受光照和蔗糖調(diào)控表達(dá)模式Fig. 7 Response of NtNRT2.4 expression to diurnal light/dark changes and to changes of sucrose in roots of tobacco

半定量和實(shí)時(shí)定量RCR結(jié)果均表明，煙草NtNRT2.4基因不僅受氮素形態(tài)的調(diào)控，而且受光照和蔗糖的調(diào)控（圖7）。為了研究光源對(duì)煙草NtNRT2.4基因表達(dá)的影響，選取四片真葉完全展開(kāi)的煙草幼苗轉(zhuǎn)移到含2 mmol/L NO3-的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)3天，培養(yǎng)箱中提供的光源時(shí)間為06:00 am-22:00 pm，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2s-1，第4天開(kāi)始在不同的時(shí)間點(diǎn)采取煙草根系樣品提取RNA。圖7A的結(jié)果表示，NtNRT2.4的表達(dá)水平隨著白天、黑夜而變化，該基因的表達(dá)水平在提供光源4h (10:00 am)后達(dá)到一個(gè)峰值，而基因在關(guān)閉光源的時(shí)候 (22:00 pm)，表達(dá)水平出現(xiàn)第二個(gè)峰值，但總體水平顯著低于10:00 am時(shí)基因的表達(dá)水平。

本研究進(jìn)一步分析了外源C源對(duì)煙草根系NtNRT2.4表達(dá)的影響，同樣選取四片真葉完全展開(kāi)的煙草幼苗轉(zhuǎn)移到含2 mmol/L NO3-的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)3天，第3天關(guān)閉光源的時(shí)候，在營(yíng)養(yǎng)液里加入3%的蔗糖，然后分別在4h和8h后采取煙草根系樣品提取RNA。圖7B的結(jié)果表明加入蔗糖后，NtNRT2.4轉(zhuǎn)錄水平比22:00pm時(shí)間點(diǎn)提高了3-4倍，而在不加蔗糖的情況下02:00am 和06:00am時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于22:00pm時(shí)間點(diǎn)（圖7A）。

3 結(jié)論與討論

植物NRT2基因家族（高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因）在植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)NRT2基因家族的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，從普通煙草（K326）中克隆出一個(gè)新的煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（命名為NtNRT2.4），該基因編碼的蛋白質(zhì)具有NRT家族的共有結(jié)構(gòu)特征，與煙草已發(fā)現(xiàn)的3個(gè)本家族基因同源性達(dá)到77.54%，與擬南芥NRT2家族基因同源性達(dá)到81.63%；進(jìn)一步分析煙草NtNRT2.4基因的表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)該基因主要在根部表達(dá)，負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收，且受硝態(tài)氮、光照和蔗糖處理誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，而受銨態(tài)氮影響抑制表達(dá)。

隨著植物基因組測(cè)序工作的推進(jìn)以及分子生物學(xué)技術(shù)不斷的發(fā)展，已經(jīng)在很多種植物中發(fā)現(xiàn)和克隆到多個(gè)高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有著重要的相似性[5]。通過(guò)氨基酸比對(duì)和蛋白功能域預(yù)測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)NtNRT2.4基因編碼的蛋白質(zhì)與已經(jīng)報(bào)道的擬南芥和煙草等高等植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)上具有高度的同源性，功能結(jié)構(gòu)域高度保守，具有典型的高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員特征，屬于高親和NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NRT2）。進(jìn)一步通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，該基因與擬南芥中的AtNRT2.3基因的關(guān)系最近，可能主要負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收，這與本研究的基因組織表達(dá)特征相一致。

擬南芥和水稻根部的NRT2.4基因均能夠受硝酸鹽調(diào)控增加表達(dá)量[13,15-16]。半定量PCR結(jié)果表明煙草NtNRT2.4基因在煙草根部的表達(dá)量最高，在葉片和莖部基本檢測(cè)不到表達(dá)（圖6）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)NtNRT2.4在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在根中NtNRT2.4的表達(dá)量大約是莖和葉中的4-5倍。半定量和定量PCR結(jié)果均表明該基因主要在根部表達(dá)，這與本研究發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子中包含大量Root motif box (ATATT)相一致（圖5）。進(jìn)一步的研究需要通過(guò)NtNRT2.4基因的轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證實(shí)來(lái)完成。

已有報(bào)道表示在很多植物中NO3-吸收是受晝夜節(jié)律調(diào)控[17]。植物本身的生物鐘調(diào)控著NO3-轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白的表達(dá)以及對(duì)NO3-的吸收。擬南芥中的研究結(jié)果表明，AtNRT2.1和AtNRT1.1基因在根系的轉(zhuǎn)錄水平受到光和晝夜節(jié)律變化的調(diào)控，而且在遮光并加入蔗糖后，這兩個(gè)基因的表達(dá)豐度都迅速提高。本研究對(duì)啟動(dòng)子的分析結(jié)果表明NtNRT2.4基因中包含大量的光調(diào)控元件（圖5）。進(jìn)一步的基因表達(dá)特性分析顯示，NtNRT2.4受光照處理誘導(dǎo)，這與我們的啟動(dòng)子分析結(jié)果相一致；雖然NtNRT2.4受蔗糖處理誘導(dǎo)，但是在啟動(dòng)子中并未發(fā)現(xiàn)已知的蔗糖調(diào)控元件，這表明該啟動(dòng)子中可能有許多潛在的未發(fā)現(xiàn)的蔗糖誘導(dǎo)調(diào)控元件。

迄今為止，NO3-不僅是一種重要的氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更是做為一個(gè)重要的信號(hào)物質(zhì)受到科研工作者的高度重視[18]。然而，高等植物中的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，尤其是調(diào)控因子還沒(méi)有真正得到明確。本研究對(duì)煙草高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族NtNRT2.4基因的克隆和表達(dá)分析為了解煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和調(diào)控提供了一定的研究基礎(chǔ)，為進(jìn)一步通過(guò)分子改良進(jìn)行氮素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供了理論依據(jù)。

[1] 史宏志，韓錦峰. 烤煙碳氮代謝幾個(gè)問(wèn)題的探討[J]. 煙草科技，1998（2）:34-36.

[2] Wang YY, Hsu PK, Tsay YF. Uptake, allocation and signaling of nitrate [J]. Trends in plant science, 2012, 17 (8): 458-467.

[3] Forde BG. Nitrate transporters in plants: structure, function and regulation [J]. Biochimica biophysica acta, 2000, 1465(12):219-235.

[4] Williams LE, Miller AJ. Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes [J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 2001, 52(1): 659-688.

[5] Campble WH. Nitrate reductase structure, function and regulation: bridging the gap between biochemistry and physiology [J]. Annual Review of Plant Physiology, 1999,50(1):277-303.

[6] Trueman LJ，Richardson A，F(xiàn)orde B G. Molecular cloning of higher plant homologues of the high-affinity nitrate transporters ofChlamydomonas reinhardtii and Aspergillus nidulans[J]. Gene, 1996, 175(1-2): 223 - 231.

[7] Vidmar JJ, Zhuo D, Siddiqi MY, et al. Isolation and characterization of HvNRT2.3 and HvNRT2.4，cDNAs encoding high-affinity nitrate transporters from roots of barley[J]. Plant Physiology, 2000, 122(3): 783 - 792 .

[8] Quesada A, Krapp A, Trueman LJ, et al. PCR-identification of aNicotiana plumbaginifoliacDNA homologous to the high-affinity nitrate transporters of the crnA family [J]. Plant Molecular Biology, 1997, 34(2):265 - 274.

[9] Amarasinghe BH，De Bruxelles GL，Braddon M，et al.Regulation of GmNRT2 expression and nitrate transport activity in roots of soybean (Glycine max) [J]. Planta，1998，206(1)：44- 52.

[10] Quaggiotti S, Ruperti B, Borsa P, et al. Expression of a putative high-affinity NO3-transporter and of an H+-ATPase in relation to whole plant nitrate transport physiology in two maize genotypes di ff erently responsive to low nitrogen availability[J].Journal of Experiment Botany，2003，54: 1023- 1031.

[11] 趙學(xué)強(qiáng)，李玉京，劉建中，等. 小麥NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNRT2.3的克隆和表達(dá)分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2004，46(3):347 - 354 .

[12] 張洪映，賈宏昉，張松濤，等. 煙草非生物脅迫應(yīng)答基因NtSnRK2.1的克隆與表達(dá)分析[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2014, 20(4):94-99

[13] Orsel M, Krapp A, Daniel-Vedele F. Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression [J]. Plant Physiology，2002(2): 886 - 896.

[14] 許金，謝小東，馮爽，等. 煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 煙草科技, 2013,7:68-71

[15] Cai CH, Wang JY, Zhu YG, et al.Gene structure and expression of high-af fi nity nitrate transport system in rice roots [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(2):443-451.

[16] Yan M, Fan XR, Feng HM, et al. Rice OsNAR2.1 interacts with OsNRT2.1, OsNRT2.2 and OsNRT2.3a nitrate transporters to provide uptake over high and low concentration ranges [J]. Plant Cell and Environment, 2011, 34(8):1360-1372.

[17] Lejay L, Tillard P, Lepetit M, et al. Molecular and functional regulation of two NO3-uptake systems by N and C status of Arabidopsis plants [J]. Plant Journal, 1999, 18(5): 509-519.

[18] Konishi M, Yanagisawa S. Identi fi cation of a nitrate-responsive cis-element in the Arabidopsis NIR1 promoter defines the presence of multiple cis-regulatory elements for nitrogen response [J]. Plant Journal, 2010, 63(2): 269-282.

Cloning and characterization ofNtNRT2.4 gene fromNicotiana tabacumL.

HUANG Huagang1,2, SHEN Yan2, WANG Weifeng3, LIAN Wenli1, CHEN Xue2, ZHAI Xin2, YU Qiwei2, YANG Zhenzhi2, JIA Hongfang1
1 Key laboratory of Tobacco Cultivation, College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2 Guizhou Bijie Municipal Tobacco Company, Bijie 551700, Guizhou, China;3 Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company, Nanning 530022, China

NRT2gene plays a critical role in nitrate absorption and transport in plants. 821bp sequence ofNRT2gene was screened from cDNA library. Based on the sequence,NtNRT2.4 was isolated from tobacco (Nicotiana tabacumL.) by in silico cloning and RT-PCR.NtNRT2.4 includes an open reading frame (ORF) of 1593 bp and encode 530 deduced amino acid residues (AAR). Phylogenetic analysis suggested thatNtNRT2.4 was high homologous to its paralogous genes from tobacco (77.54%) and orthologous genes fromArabidopsis(81.63%), which were also induced by nitrate stresses. Promoter analysis suggestedNtNRT2.4 had large amount of motif involved in N and light metabolism. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) were used to determine expression patterns ofNtNRT2.4 in tobacco. Results revealed thatNtNRT2.4 expressed more in tobacco roots and less in leaves and stems. Expression patterns under light and sugar responses suggested thatNtNRT2.4 was involved in response to light and sugar treatment, with signi fi cant di ff erent responsive pro fi les.

Nicotiana tabacum;NtNRT2.4; cloning; expression analysis

黃化剛，申燕，王衛(wèi)峰,等. 煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（1）

貴州省煙草公司畢節(jié)市公司科技攻關(guān)項(xiàng)目（畢節(jié)合 2014-59） ；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A210029）

黃化剛（1982—），博士，在讀博士后，高級(jí)農(nóng)藝師，從事煙草植物營(yíng)養(yǎng)方面研究，E-mail: huanghg82@gmail.com

賈宏昉（1982—），博士，講師，從事煙草生物技術(shù)研究，E-mail: jiahongfang@126.com

2015-

: HUANG Huagang, SHEN Yan, WANG Weifeng, et al. Cloning and characterization ofNtNRT2.4 gene fromNicotiana tabacumL. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)