李雪犁

摘 要 誘導(dǎo)多能干細胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC）由于其巨大的研究價值和應(yīng)用潛力迅速成為近年來全球干細胞領(lǐng)域關(guān)注的焦點，許多國家的政府、研究機構(gòu)對其加大投入，并取得了巨大進展。本文將對iPSC技術(shù)中體細胞的選擇、重編程誘導(dǎo)因子的篩選、介導(dǎo)載體、誘導(dǎo)效率、臨床學(xué)的應(yīng)用以及研究中存在的問題幾個方面做簡要綜述。

關(guān)鍵詞 誘導(dǎo)多能干細胞 重編程 誘導(dǎo)效率 載體 再生醫(yī)學(xué)

中圖分類號：Q813 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.078

Summary of Research Progress on Induced Pluripotent Stem Cells

LI Xueli

（Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office， SIPO， Wuhan， Hubei 430070）

Abstract Induced pluripotent stem cells due to its great research value and application potential quickly become in recent years the world the focus of attention in the field of cell， the government， research institutes in many countries to increase investment， and have made tremendous progress. This article will make a brief summary on the selection of somatic cells in iPSC technology， the selection of the induced factors of reprogramming， the vector， the induction efficiency， the application of clinical study and the problems in the research.

Key words induced pluripotent stem cells； reprogramming； induced efficiency； carrier； regenerative medicine

0 引言

誘導(dǎo)多能干細胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC），是將幾種因子的基因引入到成熟體細胞中，并重編程為與胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）具有相似特征的一種干細胞。①iPSC于2006年由日本京都大學(xué)山中伸彌（Yamanaka S）研究團隊首次獲得。以此為基礎(chǔ)，Yamanaka和Thomason（美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校）研究團隊于2007年成功獲得人類iPSC。正是iPSC與ESC在形態(tài)、基因表達及多能細胞特異基因的表觀遺傳學(xué)性狀上都表現(xiàn)出了極高的相似性，因此研究成果一經(jīng)報道便迅速引起了干細胞乃至生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。一向?qū)θ祟惻咛ジ杉毎I(lǐng)域研究持有爭議態(tài)度的美國政府，在該研究成果發(fā)布后的幾年中，也逐漸放開了對干細胞領(lǐng)域研究的相關(guān)政策，認為這才是干細胞研究的正道。

iPSC技術(shù)被認為是生命科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一場革命，在其誕生的十年時間里就被廣泛研究并獲得了快速的發(fā)展。世界范圍內(nèi)許多實驗室開始探索其相關(guān)機制及技術(shù)的改良方法，研究主要集中在體細胞和重編程因子的選擇、重編程因子介導(dǎo)載體體系的建立、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率的提升以及疾病特異性的iPSC模型的建立等方面。

1 體細胞的選擇

在體細胞選擇方面，研究發(fā)現(xiàn)，除了成纖維細胞，小鼠的肝細胞、胃細胞、B淋巴細胞、神經(jīng)干細胞，以及人類的骨髓間充質(zhì)干細胞、角化細胞、外周血細胞、皮膚成纖維細胞、胚胎成纖維細胞、脂肪干細胞等都可產(chǎn)生iPSC。②而有絲分裂后的神經(jīng)元和終末分化的淋巴細胞也可誘導(dǎo)形成iPSC。③由此可見，似乎所有的體細胞都具備經(jīng)過重編程而被誘導(dǎo)成為iPSC的潛能，但是不同細胞類型對產(chǎn)生iPSC的效率、誘導(dǎo)因子作用效果和獲得的iPSC的安全性具有很大的差別。④例如，人類角質(zhì)細胞比成纖維細胞重編程的效率高；小鼠胃細胞與肝細胞在激活ESC特異性Fbx15基因時，比成纖維細胞效率高，且整合的病毒少；不同類型的體細胞（小鼠尾部皮膚細胞、胃細胞以及胚胎皮膚細胞）誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSC會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)腫瘤出現(xiàn)概率的不同。

2 重編程因子的選擇

盡管Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4是最先發(fā)現(xiàn)的可以將成纖維細胞重編程轉(zhuǎn)化為iPSC的4種重編程因子，但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在一定情況下，一些因子的調(diào)整或替代，同樣也能獲得良好的誘導(dǎo)效果，⑤如Oct4、Sox2、Nanog、Lin28也可以將人類成纖維細胞重編程轉(zhuǎn)化為iPSC；Oct4和Sox2兩種因子就能將人臍血干細胞重編轉(zhuǎn)化為iPSC；人成纖維細胞可以內(nèi)源性表達c-Myc和Klf4，在重編程轉(zhuǎn)化過程中，沒有外源性c-Myc的參與也能成功獲得iPSC；對于內(nèi)源性高表達Sox2和c-Myc的神經(jīng)干細胞，僅用Oct4即可重編轉(zhuǎn)化為iPSC。這些研究結(jié)果說明成熟體細胞的重編程存在多個信號途徑。

3 重編程因子的介導(dǎo)載體

慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒是iPSC技術(shù)研究初始階段用于介導(dǎo)重編程因子的兩種主要載體。但隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可能會造成外援致瘤因子整合進入細胞基因組內(nèi)，引起插入突變。病毒基因的激活已經(jīng)導(dǎo)致由iPSC分化產(chǎn)生的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了腫瘤，這一結(jié)果無疑給iPSC在臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用方面引入了不小的風(fēng)險，甚至?xí)?dǎo)致不良后果。

正是因為發(fā)現(xiàn)了存在載體在使用過程中、或是誘導(dǎo)基因本身會引發(fā)致瘤的問題，很多研究小組致力于尋找方法能夠產(chǎn)生非整合的iPSC來減少致瘤風(fēng)險。這些方法包括腺病毒、仙臺病毒、質(zhì)粒、合成RNA、蛋白質(zhì)、piggyBac轉(zhuǎn)座子和小分子誘導(dǎo)重編程等，并且這些方法已經(jīng)在實驗室水平得到實現(xiàn)。⑤⑥雖然現(xiàn)階段有關(guān)安全介導(dǎo)載體體系建立的研究還不太成熟，但相信隨著研究的逐步深入，科學(xué)家們終將會尋找到最安全、也最適合用于人類iPSC的誘導(dǎo)方法，從而將風(fēng)險降到最低。

4 iPSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率

雖然iPSC建系可重復(fù)，但效率很低，并且在提高iPSC安全性的同時會伴隨著重編程效率的降低。因此，提高iPSC重編程效率也一直是該領(lǐng)域研究的重點。雖然iPSC形成的分子機制不是十分清楚，但是研究發(fā)現(xiàn)很多因素，如細胞類型、重編程因子、載體，甚至培養(yǎng)條件和微環(huán)境都與iPSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率相關(guān)。④⑤如脂肪干細胞以O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4因子重新編程的效率達到0.2%，且是相同條件下皮膚成纖維細胞的20倍；利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體誘導(dǎo)人幼年角質(zhì)形成細胞重編程的效率要達到成纖維細胞的100倍；缺氧微環(huán)境培養(yǎng)iPSC，其生成效率可提高至原來的2.5-4.2倍。

5 iPSC的應(yīng)用

iPSC對醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最直接的貢獻在于為疾病的研究提供了體外模型，如，Rashid等⑦成功利用肝病患者的皮膚細胞培育出與病人肝臟細胞高度相似細胞；來自iPSC的心肌細胞和肝細胞，可以替代現(xiàn)有的方法用于毒理學(xué)試驗，這些是其它細胞所無法比擬的。一方面，利用從病患身上產(chǎn)生的iPSC，可以簡化建立疾病模型的過程，提高模型仿真性，更有利于了解該種疾病的發(fā)病機理；另一方面，iPSC可以為新藥的開發(fā)提供模型，用于測試候選藥物的療效、毒性，以及篩選新的藥物治療方法。⑧

iPSC技術(shù)為未來使用干細胞研究及治療各種疾病開辟了新的研究途徑，如何將iPSC在體外定向分化為能模擬體內(nèi)情況的功能性細胞，以及如何獲得足夠量的靶細胞用于下游的應(yīng)用將成為今后研究的重點。

6 iPSC研究存在的問題

雖然iPSC技術(shù)發(fā)展迅速，有著誘人的應(yīng)用前景，但對該領(lǐng)域的研究總體還處于最初的探索階段，并且在該技術(shù)發(fā)展的過程中還存在諸多的問題，這些都使得iPSC技術(shù)應(yīng)用在臨床方面還具有很長的距離。

（1）iPSC與ESC有差異嗎？iPSC存在的最重要的問題之一就是它與ESC是否真正相似。雖然有部分結(jié)果顯示它們存在差異，但大部分實驗還是表明iPSC與ESC在各方面都具有驚人的相似性。顯示兩者具有差異性的研究結(jié)果可能是由于不同實驗室所采用的相關(guān)實驗條件的不同所造成的。同時，山中伸彌認為“ESC不應(yīng)當(dāng)成為判斷iPSC特性的金標(biāo)準(zhǔn)，研究者應(yīng)更加關(guān)注iPSC自身的性質(zhì)”。

（2）iPSC產(chǎn)生的效率問題。iPSC產(chǎn)生的效率較低。這與基因?qū)氲姆绞?、整合位點、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子表達的數(shù)量和模式等多種因素有關(guān)。如：Oct-4在胃或腸內(nèi)的表達阻止了原始細胞的分化。同時，由于來源于多能干細胞的組織在移植后的存活率很低，因此iPSC在臨床應(yīng)用上也將會面臨移植后要求組織存活較長時間的問題。

（3）安全問題。在iPSC技術(shù)中，用病毒作為載體可能會導(dǎo)致外援基因整合進入細胞基因組，致使一些癌基因的激活或某些重要基因的表達受阻；并且重編程因子c-Myc和Klf4屬于致瘤因子，因此這些因素都將有可能引起基因的突變，從而產(chǎn)生具有高致瘤性的iPSC。這些問題將成為iPSC科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的最大障礙。

（4）機制問題。幾個轉(zhuǎn)錄因子如何完成細胞由分化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為多能性狀態(tài)？如何從根本上解決致瘤性的問題？為何iPSC誘導(dǎo)效率低下，分化能力存在差異？這些問題都需要通過對體細胞重編程的分子機制、分化機制以及調(diào)控機制等進行深入的研究來解答。

注釋

① Yamanaka S.誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）：過去、現(xiàn)在和未來.朱麗華，譯.中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2012.34（10）：1055-1062.

②⑧Kiskinis E，Eggan K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation，2010.120（1）：51-59.

③ Kim J， Lengner CJ， Kirak O， et al. Reprogramming of postnatal neurons into induced pluripotent stem cells by defined factors. Stem Cells，2011.29（6）：992-1000.

④ 李鑫，王加強，周琪.體細胞重編程研究進展.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2016.46（1）：4-15.

⑤ Gonzalez F， Boue S， Belmonte， JCI. Methods for making induced pluripotent stem cells： reprogramming a la carte. Nature Reviews Genetics，2011.12（4）：231-242.

⑥ Ye JK， Hong JY， Ye FS. Reprogramming rat embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells using transposon vectors and their chondrogenic differentiation in vitro. Molecular Medicine Reports， 2015.11（2）：989-994.

⑦ Rashid ST， Corbineau S， Hannan N， et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest， 2010.120（9）：3127-3136.