戴宏杰，孫玉林，楊梅語，辛欣欣，馮梓欣，文 菁，陳道海

（1.嶺南師范學(xué)院環(huán)北部灣海洋藥用動(dòng)物保護(hù)與利用研究所，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

擬目烏賊生殖腺堿提多糖的抗氧化及吸濕保濕特性

戴宏杰1,2，孫玉林1,2，楊梅語2，辛欣欣2，馮梓欣2，文 菁1,2，陳道海1,*

（1.嶺南師范學(xué)院環(huán)北部灣海洋藥用動(dòng)物保護(hù)與利用研究所，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

以擬目烏賊生殖腺為材料，采用堿法提取多糖，并對(duì)其抗氧化活性和吸濕保濕性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：擬目烏賊生殖腺堿提多糖最佳工藝為NaOH溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶40（g/mL）、提取時(shí)間3 h、提取溫度80 ℃，此條件下多糖得率為7.697%。擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的抗氧化活性，對(duì)羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基具有較好的清除效果，清除率與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕性能高于殼聚糖、聚乙二醇6000等常規(guī)保濕劑，保濕性能和殼聚糖、聚乙二醇6000、丙三醇接近；吸濕保濕能力均高于翡翠貽貝多糖、近江牡蠣多糖等海洋動(dòng)物多糖。綜上表明，擬目烏賊生殖腺堿提多糖作為天然的抗氧化劑和保濕劑具有一定的應(yīng)用前景。

擬目烏賊生殖腺；多糖；抗氧化；吸濕性；保濕性

擬目烏賊（S e p i a l y c i d a s）屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）、頭足類（Cephalopoda）、鞘亞綱（Coleoidea）、烏賊目（Sepiida）、烏賊科（Sepiidae）、烏賊屬（Sepia），主要分布于我國(guó)東海、南海，菲律賓海，越南和婆羅洲海域[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)擬目烏賊的研究主要集中在胚胎發(fā)育[2-3]、幼體培育[4]、養(yǎng)殖技術(shù)[5-6]和營(yíng)養(yǎng)分析[7]方面，但對(duì)擬目烏賊生物活性物質(zhì)研究較少。多糖具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤和免疫促進(jìn)、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化及抗衰老等[8]。研究表明，從蛤蜊[9]、鮑魚[10]、貽貝[11]、扇貝[12]、海參[13]等海洋動(dòng)物中提取得到的多糖均表現(xiàn)出良好的生物活性。同時(shí)多糖分子中存在大量的羥基、羧基等親水性基團(tuán)，使多糖具有一些優(yōu)良的理化性質(zhì)，如強(qiáng)吸水性、乳化性和良好的成膜性等[14]。越來越多的文獻(xiàn)研究表明，從海洋動(dòng)物中提取得到的多糖具有一定的吸濕保濕性能，如馬氏珠母貝、企鵝珍珠貝、翡翠貽貝、近江牡蠣[15]、鮑魚[16]、蛤蜊[9]、貽貝[17]等。而來自于海洋生物中多糖種類，如殼聚糖、透明質(zhì)酸等，已在美容食品和化妝品開發(fā)方面顯示出良好的市場(chǎng)前景[18]。因此，多糖作為功效型化妝品保濕劑有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，從扇貝性腺[12,19]、鮑魚性腺[20-22]、馬糞海膽生殖腺[23]中獲得的多糖顯示出良好的生物活性，是一種新型的海洋天然藥物和功能性保健食品資源。本實(shí)驗(yàn)以擬目烏賊生殖腺為材料，采用堿法制備擬目烏賊生殖腺多糖，并對(duì)其抗氧化活性和吸濕保濕性能進(jìn)行研究，考察其作為天然抗氧化劑和保濕劑的應(yīng)用前景，以期為擬目烏賊生殖腺在功能性食品、醫(yī)藥制品和化妝品方面的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬目烏賊于2014年4月在廣東省湛江市霞山水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)采集，經(jīng)鑒定為雌性成體；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；馥佩貂油潤(rùn)手霜為廣州中醫(yī)藥大學(xué)研制，購于廣東省湛江市赤坎區(qū)沃爾瑪購物廣場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；DFY-200手提式高速中藥粉碎機(jī) 青州市三寶中藥機(jī)械廠；LGJ-18A冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；AUX320電子天平 日本島津公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-4智能數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；TG16MW臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南赫西儀器有限公司；UV3000紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 擬目烏賊生殖腺基本成分分析

水分含量的測(cè)定參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》，采用105 ℃烘干恒質(zhì)量法；灰分含量的測(cè)定參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》，采用爐550 ℃灼燒法；粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法；粗脂肪含量的測(cè)定參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》，采用索氏抽提法；多糖含量的測(cè)定參照GB/T 9695.31—2008《肉制品總糖含量的測(cè)定》，采用苯酚-硫酸法。

1.3.2 擬目烏賊生殖腺多糖堿法提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 多糖提取工藝流程

參照文獻(xiàn)[24]，采用堿法提取擬目烏賊生殖腺多糖。

材料預(yù)處理：擬目烏賊解剖后取出生殖腺，放置于高速組織搗碎機(jī)中勻漿，采用丙酮脫脂3 次，-70 ℃條件下預(yù)凍3 h后放置于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，粉碎后得到擬目烏賊生殖腺凍干粉，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

擬目烏賊生殖腺凍干粉→NaOH溶液浸提→離心（4 000 r/min，20 min）→取上清液→用4 mol/L鹽酸調(diào)pH值至中性→旋蒸濃縮至原體積的1/5→95%乙醇沉淀（3 倍體積，4 ℃靜置12 h）→離心（4 000 r/min，15 min）→透析脫鹽（4 ℃，48 h）→冷凍干燥→擬目烏賊生殖腺堿提多糖。

1.3.2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中多糖含量[25]。精密稱取105 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖配制成100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，補(bǔ)水至2 mL，加入1 mL 6%苯酚溶液，混勻后迅速加入5 mL濃硫酸，室溫條件下放置30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=12.576X-0.002 7，R2=0.996 2；Y為吸光度，X為葡萄糖含量/（mg/mL），按式（1）計(jì)算擬目烏賊生殖腺堿提多糖得率：

式中：Y為多糖得率/%；C為待測(cè)液中多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為擬目烏賊生殖腺樣品質(zhì)量/g。

1.3.2.3 單因素試驗(yàn)

對(duì)NaOH溶液濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）及提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）4個(gè)影響堿法提取多糖得率的因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定其中3 個(gè)因素不變的情況下，分析單個(gè)因素對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響。

1.3.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取NaOH溶液濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，確定堿法提取擬目烏賊生殖腺多糖的最佳工藝。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Design for factors and levels of orthogonal array experiments

1.3.2.5 擬目烏賊生殖腺多糖成分測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法[25]；蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[25]。

1.3.3 擬目烏賊生殖腺堿提多糖抗氧化活性

1.3.3.1 還原能力的測(cè)定

[26]的方法。取2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液2 mL、1%鐵氰化鉀溶液2 mL，混勻后置于50 ℃水浴20 min，然后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩混勻后，離心（3 000 r/min，10 min），取2 mL上清液、2 mL雙蒸水和0.4 mL 0.1% FeCl3溶液混勻，靜置10 min，測(cè)定其在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度；空白對(duì)照以雙蒸水代替多糖溶液，以VC作陽性對(duì)照。

1.3.3.2 對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[27]的方法。取1 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其在波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。以VC為陽性對(duì)照，空白對(duì)照組以雙蒸水代替多糖溶液，按式（2）計(jì)算清除率：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ax為加入多糖溶液的吸光度；A1為以雙蒸水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.3.3 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[28]的方法，取2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入含0.2 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液2 mL后混勻，在黑暗環(huán)境中常溫反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽性對(duì)照，按式（3）計(jì)算清除率：

式中：A1為2 mL多糖溶液加2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL多糖溶液加2 mL無水乙醇的吸光度；A0為2 mL雙蒸水加2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.4 擬目烏賊生殖腺堿提多糖吸濕保濕性

1.3.4.1 吸濕性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行吸濕性的測(cè)定。擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕性測(cè)定在恒溫恒濕條件下進(jìn)行，將碳酸鉀飽和溶液和硫酸銨飽和溶液分別置于干燥器內(nèi)，環(huán)境溫度為20 ℃，制成相對(duì)濕度分別為43%和81%的環(huán)境。

將多糖、對(duì)照品及數(shù)個(gè)規(guī)格為25 mm×25 mm的稱量瓶置于干燥箱中，50 ℃干燥至質(zhì)量恒定。精確稱取樣品及對(duì)照品各0.1 g放置于在已干燥至質(zhì)量恒定的稱量瓶中，將稱量瓶敞口放置于相對(duì)濕度分別為43%和81%的干燥器中，密封干燥器。每隔8 h分別稱質(zhì)量，按式（4）計(jì)算吸濕率：

式中：m0為吸濕前各樣品的質(zhì)量/g；mt為吸濕不同時(shí)間后各樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4.2 保濕性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[29]的方法并稍作改進(jìn)后進(jìn)行保濕性的測(cè)定。擬目烏賊生殖腺多糖的保濕性測(cè)定選定在恒溫干燥環(huán)境下進(jìn)行?？刂骗h(huán)境溫度為20 ℃，在干燥器底部加入200 g變色硅膠。將多糖、對(duì)照品及數(shù)個(gè)規(guī)格為20 mL的小燒杯置于干燥箱中，50 ℃干燥至質(zhì)量恒定。稱取多糖及對(duì)照品各0.1 g，分別加水10 mL配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。配制完成的溶液均敞口置于恒溫密閉硅膠干燥器中。每隔8 h分別稱質(zhì)量，按式（5）計(jì)算保濕率：

式中：m0為各樣品放置前的質(zhì)量/g；mt為各樣品放置不同時(shí)間后的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬目烏賊生殖腺基本成分分析

表2 擬目烏賊生殖腺基本成分組成Table 2 General composition of Sepia lyciiddaass goonnaadd

由表2可知，擬目烏賊生殖腺的水分含量約為73.33%，粗蛋白含量較高，濕基和干基狀態(tài)下分別可達(dá)到20.21%和75.79%。多糖含量方面，擬目烏賊生殖腺材料參照GB/T 9695.31—2008沸水提取30 min后測(cè)得的多糖含量在濕基和干基狀態(tài)下分別為0.33%和1.24%。粗脂肪的含量較低，濕基狀態(tài)下為0.19%?；曳趾吭诟苫鶢顟B(tài)下為7.05%。綜上所述，擬目烏賊生殖腺具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，同時(shí)含有一定量的多糖成分，具有較好的研究?jī)r(jià)值。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaOH溶液濃度對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響

固定擬目烏賊生殖腺多糖提取時(shí)的料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間2 h、提取溫度60 ℃，考察NaOH溶液濃度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 NaOH溶液濃度對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on the yield of polysaccharides from Sepia lycidas gonad

由圖1可知，NaOH溶液濃度范圍在0.1～0.3 mol/L時(shí)，擬目烏賊生殖腺多糖得率有顯著增加；當(dāng)NaOH溶液濃度大于0.3 mo/L時(shí)，繼續(xù)增加NaOH溶液濃度，多糖得率基本保持不變；同時(shí)過高的堿液濃度會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞，綜合分析選擇NaOH溶液濃度0.3 mol/L為最佳。

2.2.2 料液比對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響

固定擬目烏賊生殖腺多糖提取時(shí)的NaOH溶液濃度0.3 mol/L、提取時(shí)間2 h、提取溫度60 ℃，考察料液比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratios on the yield of polysaccharides from Sepia lycidas gonad

由圖2可知，隨著溶劑用量的增加，擬目烏賊生殖腺多糖得率也逐漸增加。料液比在1∶10～1∶30時(shí)，多糖得率隨溶劑用量的增加顯著上升；料液比在1∶30之后，多糖得率變化緩慢。提取溶劑越多，溶劑與樣品材料的接觸越充分，相同條件下的多糖得率也就越高。當(dāng)提取溶劑達(dá)到一定量時(shí)，樣品中的多糖已最大化地提取出來，多糖得率不再增加?？紤]到后續(xù)需濃縮、醇沉等工作，綜合分析選擇料液比為1∶30為最佳。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響

固定擬目烏賊生殖腺多糖提取時(shí)的NaOH溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶20、提取溫度60 ℃，考察提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Sepia lycidas gonad

由圖3可知，提取時(shí)間在1～2 h范圍內(nèi)，擬目烏賊生殖腺多糖得率增加顯著。當(dāng)提取時(shí)間超過2 h后，多糖得率變化趨于平坦，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響較小。當(dāng)提取時(shí)間超過4 h時(shí)，多糖得率反而出現(xiàn)一定程度的下降。綜合分析選定提取時(shí)間2 h為最佳。

2.2.4 提取溫度對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響

固定擬目烏賊生殖腺多糖提取時(shí)的NaOH溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶20、提取時(shí)間2 h，考察提取溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)提取溫度在50～70 ℃時(shí)，多糖得率隨著提取溫度的上升而增加，70 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大值。提取溫度從70 ℃開始，繼續(xù)升高提取溫度導(dǎo)致多糖得率顯著降低。一定程度上的升高提取溫度會(huì)增加樣品材料的多糖溶出，提高多糖得率，但是過高的提取溫度也會(huì)導(dǎo)致多糖降解。在提取過程中，提取溫度為80、90 ℃時(shí)，提取液顏色較深，呈褐色，其他溫度條件下的多糖提取液顏色較淺。綜合分析選擇提取溫度70 ℃為最佳。

圖4 提取溫度對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Sepia lycidas gonad

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取NaOH溶液濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3、4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal array experiments

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal array experiments

根據(jù)表3、4可知，4 個(gè)因素極差值大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即影響擬目烏賊生殖腺多糖得率的主次因素為NaOH溶液濃度＞提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度，4個(gè)因素都對(duì)擬目烏賊生殖腺多糖得率影響極顯著。根據(jù)直觀分析結(jié)果，擬目烏賊生殖腺多糖堿法提取最優(yōu)工藝為A2B3C3D3，即NaOH溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶40、提取時(shí)間3 h、提取溫度80 ℃。根據(jù)優(yōu)選的最佳工藝，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，擬目烏賊生殖腺多糖的得率為（7.697±0.191）%，顯著高于扇貝[30]、蛤蜊[31]、牡蠣[32]等海洋動(dòng)物中提取多糖的得率。

2.4 擬目烏賊生殖腺粗多糖成分分析

采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法分別對(duì)擬目烏賊生殖腺粗多糖進(jìn)行多糖和蛋白含量的測(cè)定，結(jié)果顯示其多糖和蛋白含量分別為78.91%和14.86%，表明采用堿法提取得到的擬目烏賊生殖腺粗多糖中其主要成分是多糖，具有較高的純度。

2.5 擬目烏賊生殖腺堿提多糖的抗氧化活性分析

2.5.1 還原力的測(cè)定結(jié)果

圖5 多糖（A）和VC（B）對(duì)FFee33＋的還原能力Fig.5 Ferric reducing power of Sepia lycidas gonad polysaccharides

在反應(yīng)體系環(huán)境下，F(xiàn)e3+獲得待測(cè)物質(zhì)所提供的電子而被還原為Fe2+，從而使得反應(yīng)體系的顏色發(fā)生改變，使體系的吸光度增大，在波長(zhǎng)700 nm處有最大吸收。吸光度越大，說明被測(cè)物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。由圖5可知，擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有一定的還原能力，但和VC相比還原力較小。隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其還原力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，吸光度為1.08，高于同質(zhì)量濃度條件下的烏賊墨汁多糖[33]、四角蛤蜊多糖[9]、厚殼貽貝多糖[11]和扇貝性腺多糖[12]吸光度。Zhu Beiwei等[10]從鮑魚臟器中提取多糖，當(dāng)吸光度為0.2時(shí)，其多糖質(zhì)量濃度約為9.25 mg/mL，而擬目烏賊生殖腺多糖質(zhì)量濃度小于2 mg/mL。以上分析表明擬目烏賊生殖腺堿提多糖相對(duì)其他海洋動(dòng)物多糖具有更高的還原力。

2.5.2 清除羥自由基能力的測(cè)定結(jié)果

圖6 多糖（A）和VC（B）對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging abilities of Sepia lycidas gonad polysaccharides and VC

羥自由基是一類化學(xué)性質(zhì)非常活潑的自由基，能奪取糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等生物分子中的氧原子，尤其是對(duì)脂質(zhì)過氧化的作用最強(qiáng)，最終引發(fā)機(jī)體受損和基因突變，導(dǎo)致衰老和癌癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，在510 nm波長(zhǎng)條件下具有最大吸收。由圖6可知，擬目烏賊生殖腺堿提多糖對(duì)羥自由基具有一定的清除作用，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，清除率也逐漸增加，呈現(xiàn)良好的正量效關(guān)系。擬目烏賊生殖腺堿提多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為23.95%，高于同質(zhì)量濃度條件下的翡翠貽貝多糖和牡蠣多糖[34]；多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到54.93%，高于同質(zhì)量濃度條件下的烏賊墨多糖[35]和鮑魚臟器多糖[36]，與扇貝性腺多糖對(duì)羥自由基的清除能力相當(dāng)[12]。與植物類多糖相比，Tseng等[37]從靈芝中提取多糖，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基清除率僅為22.4%。而擬目烏賊生殖腺堿提多糖質(zhì)量濃度2 mg/mL時(shí)，其清除率為23.95%。以上分析表明擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的清除羥自由基能力。

2.5.3 清除DPPH自由基能力的測(cè)定結(jié)果

圖7 多糖（A）和VC（B）對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging abilities of Sepia lycidas gonad polysaccharides and VC

由圖7可知，隨著擬目烏賊生殖腺堿提多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也逐漸增加，呈現(xiàn)出明顯劑量正依賴關(guān)系。擬目烏賊生殖腺堿提多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為76.06%，和同質(zhì)量濃度條件下的厚殼貽貝酶提多糖[11]的清除率接近。宋蓀陽等[12]從扇貝性腺中提取多糖，其質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為51.9%。羅萍等[35]對(duì)烏賊墨多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，質(zhì)量濃度為14.25 mg/mL時(shí)，其清除率不足30%，與2 mg/mL的擬目烏賊生殖腺堿提多糖對(duì)DPPH自由基的清除率相當(dāng)。綜上表明擬目烏賊生殖腺堿提多糖是一種良好的DPPH自由基清除劑。

2.6 擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕性和保濕性

2.6.1 吸濕性分析

圖8 相對(duì)濕度43%（AA）和81%（B）條件下多糖和常規(guī)保濕劑的吸濕率比較Fig.8 Hygroscopicity of Sepia lycidas gonad polysaccharides compared with traditional humectants at RHs of 43% (A) and 81% (B)

如圖8A所示，在低濕度（43%）條件下，擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕率高于殼聚糖和聚乙二醇6000，低于丙三醇。多糖、殼聚糖、聚乙二醇6000和丙三醇的吸濕率在0～8 h內(nèi)增長(zhǎng)較快，8 h后多糖、殼聚糖和聚乙二醇6000的吸濕基本飽和，此時(shí)多糖的吸濕率為7.9%，殼聚糖和聚乙二醇6000的吸濕率分別為6.1%和1.3%。丙三醇在吸濕32 h后達(dá)到最大吸濕率40.5%，然后吸濕率開始緩慢降低，其他樣品吸濕率基本穩(wěn)定不變。鄧一清等[15]對(duì)近江牡蠣、翡翠貽貝、馬氏貝和企鵝珍珠貝多糖在相對(duì)濕度43%條件下進(jìn)行吸濕性研究，結(jié)果表明在吸濕12 h后達(dá)到最大吸濕率，均只有3%左右，顯著低于擬目烏賊生殖腺堿提多糖。如圖8B所示，在高濕度（81%）條件下，擬目烏賊生殖腺堿提多糖、殼聚糖和聚乙二醇6000在吸濕8 h后吸濕率變化緩慢，32 h后吸濕率達(dá)到最大值，分別為16.3%、13.2%、4.8%，其中多糖吸濕率高于殼聚糖和聚乙二醇。丙三醇具有較高的吸濕性，在吸濕56 h后吸濕率基本達(dá)到飽和，吸濕率為84.1%，高于擬目烏賊生殖腺堿提多糖。曲敏等[17]對(duì)貽貝多糖的吸濕性能進(jìn)行研究，在81%條件下吸濕12 h后達(dá)到最大吸濕率11.29%，低于擬目烏賊生殖腺堿提多糖的最大吸濕率16.3%。高瑞英等[38]對(duì)幾種生物活性多糖吸濕保濕性能進(jìn)行研究，結(jié)果顯示透明質(zhì)酸、鯊魚軟骨素在81%條件下的最大吸濕率和擬目烏賊生殖腺堿提多糖相當(dāng)；而在43%條件下透明質(zhì)酸、鯊魚軟骨素、海藻酸鈉、卡拉膠寡糖的吸濕率均小于擬目烏賊生殖腺堿提多糖。綜上分析表明擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的吸濕性能，可作為吸濕劑開發(fā)利用。

2.6.2 保濕性分析

圖9 多糖和常規(guī)保濕劑保濕率比較Fig.9 Moisture retention ability of Sepia lycidas gonad polysaccharides compared with traditional humectants

擬目烏賊生殖腺堿提多糖、常規(guī)保濕劑（殼聚糖、聚乙二醇6000、丙三醇）和馥佩貂油潤(rùn)手霜在硅膠干燥環(huán)境中的保濕性能如圖9所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各樣品的保濕率均逐漸降低。擬目烏賊生殖腺堿提多糖在硅膠干燥環(huán)境中放置64 h后保濕率為75.7%，與殼聚糖、聚乙二醇6000、丙三醇的保濕率相當(dāng)。保濕時(shí)間在0～56 h時(shí)，多糖、殼聚糖和聚乙二醇6000的變化曲線類似，保濕率均較接近。多糖在0～56 h時(shí)的保濕率低于丙三醇，但64 h后和丙三醇保濕率接近。馥佩貂油潤(rùn)手霜的保濕性相對(duì)其他幾種樣品較好，在64 h后其保濕率為83.7%。擬目烏賊生殖腺堿提多糖在硅膠干燥環(huán)境中放置48 h后的保濕率高于同條件下的近江牡蠣多糖、翡翠貽貝多糖、馬氏珠母貝多糖、企鵝珍珠貝多糖[15]和四角蛤蜊多糖[9]。與植物多糖保濕性能相比，擬目烏賊生殖腺堿提多糖在放置48 h后的保濕率高于綠色巴夫藻多糖[39]、金蕎麥多糖[40]以及銀耳多糖、燕麥多糖和麥冬多糖[41]。綜上分析表明，擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的保濕性能。

3 結(jié) 論

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化擬目烏賊生殖腺多糖堿法提取工藝，得到擬目烏賊生殖腺多糖堿提最佳工藝：NaOH溶液濃度0.3 mol/L、料液比1∶40、提取時(shí)間3 h、提取溫度80 ℃。此條件下多糖得率為7.697%，顯著高于擬目烏賊生殖腺水提法多糖得率[42]，同時(shí)也高于其他海洋軟體動(dòng)物多糖得率[30-32]，表明該優(yōu)化工藝參數(shù)能夠較好地提取擬目烏賊生殖腺多糖，指導(dǎo)其生產(chǎn)和綜合開發(fā)利用。

目前，市場(chǎng)上許多人工合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚和特丁基對(duì)苯二酚等被廣泛用作食品添加劑，然而這些抗氧化劑可能有誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的潛在危險(xiǎn)[43]，因此開發(fā)具有無危害的新型天然抗氧化劑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中擬目烏賊生殖腺多具有一定的還原能力，對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除效果較好，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，優(yōu)于扇貝多糖[12]、烏賊墨多糖[35]等海洋動(dòng)物多糖。采用鄰苯三酚法對(duì)擬目烏賊生殖腺堿提多糖清除超氧陰離子自由基的能力進(jìn)行測(cè)定時(shí)，呈現(xiàn)負(fù)清除率，與劉俊等[44]對(duì)三角帆蚌多糖的研究結(jié)果類似。分析原因可能是該多糖分子中含有大量的羥基，超氧陰離子自由基在加速鄰苯三酚的自氧化的同時(shí)，也加速這些物質(zhì)的自氧化，產(chǎn)生更多的超氧陰離子自由基，從而呈現(xiàn)負(fù)清除作用[44]。

傳統(tǒng)的保濕劑，如甘油、丙二醇等，由于吸濕性太強(qiáng)，當(dāng)空氣干燥時(shí)，會(huì)從皮膚中吸收一定量的水分，對(duì)皮膚造成傷害[15]。目前在化妝品開發(fā)領(lǐng)域，具有天然活性的多糖等物質(zhì)正在逐步取代甘油等常規(guī)保濕劑，因此研究海洋貝類多糖的吸濕保濕性具有重要意義。擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的吸濕保濕效果，在相對(duì)濕度43%和相對(duì)濕度81%條件下的最大吸濕率分別為7.9%和16.3%，高于常規(guī)保濕劑殼聚糖、聚乙二醇6000；在相對(duì)濕度43%條件下的吸濕率高于透明質(zhì)酸、鯊魚軟骨素、海藻酸鈉、卡拉膠寡糖等海洋生物多糖[38]；在相對(duì)濕度81%條件下的吸濕率高于貽貝多糖[17]，與透明質(zhì)酸、鯊魚軟骨素的吸濕率接近。擬目烏賊生殖腺堿提多糖的保濕效果與殼聚糖、聚乙二醇6000接近，硅膠環(huán)境中放置64 h后和丙三醇的保濕率相當(dāng)，高于四角蛤蜊多糖[9]和其他植物多糖[39-41]的保濕率。擬目烏賊生殖腺堿提多糖的吸濕保濕性均高于近江牡蠣多糖、翡翠貽貝多糖、馬氏珠母貝多糖和企鵝珍珠貝多糖[15]。綜上分析表明，擬目烏賊生殖腺堿提多糖具有良好的吸濕保濕性能，可作為一種優(yōu)良的天然保濕劑開發(fā)利用。

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Antioxidant Activity, Moisture Absorption and Retention Capacities of Alkali-Soluble Polysaccharides Extracted from Gonad of Sepia lycidas

DAI Hongjie1,2, SUN Yulin1,2, YANG Meiyu2, XIN Xinxin2, FENG Zixin2, WEN Jing1,2, CHEN Daohai1,*
(1. Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China; 2. College of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

The extraction of alkali-soluble polysaccharides from the gonad of Sepia lycidas was investigated, and the antioxidant activity, moisture absorption and retention capacities of the extracted polysaccharides were evaluated. The optimal extraction conditions were determined as follows: NaOH concentration, 0.3 mol/L; solid/liquid ratio, 1:40; extraction time, 3 h; and extraction temperature, 80 ℃, respectively. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides was 7.697%. Antioxidant assays showed that the polysaccharides possessed good radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH radicals in a marked dose-dependent manner. Moisture absorption capacity of Sepia lycidas gonad polysaccharides was better than that of chitosan, polyethylene glycol 6000 and other conventional humectants, and moisture retention capacity was close to that of chitosan, polyethylene glycol 6000 and glycerol. The moisture absorption and retention capacity of Sepia lycidas gonad polysaccharides were better than those of the polysaccharides from Perna viridis, Crassostrea rivularis and other marine animals. These results clearly established the possibility that Sepia lycidas gonad polysaccharides could be effectively employed as a natural antioxidant and moisturizer.

Sepia lycidas gonad; polysaccharides; antioxidant activity; moisture absorption; moisture retention

10.7506/spkx1002-6630-201602006

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A

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2015-04-27

中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)（0003015119）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310406）；廣東省科技廳項(xiàng)目（2014B040404071）；廣東“特支計(jì)劃”項(xiàng)目（2014TQ01N621）；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專項(xiàng)（2013B090500036）；湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目（2013A05004）；湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2014A03011）；嶺南師范學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（ZL1313）；中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（LMB131006）

戴宏杰（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：daihjdemo@163.com

*通信作者：陳道海（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail：dhchen11@21cn.com