黃佳琦，楊士花，初雅潔，陶 亮，馮志祥，李華君，嚴(yán) 艷，李雪良，李永強(qiáng),*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

老黑谷米色素的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性分析

黃佳琦1，楊士花2，初雅潔1，陶 亮3，馮志祥1，李華君1，嚴(yán) 艷1，李雪良1，李永強(qiáng)1,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

以老黑谷米為對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計，對老黑谷米色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對色素的體外抗氧化活性進(jìn)行了評價。結(jié)果表明：老黑谷米色素的最 佳提取溶劑為乙醇，在282 nm和342 nm處有最大吸收波長，初步定性為黃酮醇類物質(zhì)；該色素的最佳提取條件為提取溫度30 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間40 min；該色素具有較好的抗氧化活性，DPPH自由基清除能力為（3 512.56±26.28）μg阿魏酸/g，鐵離子還原/抗氧化能力為（44.04±6.60）mmol Fe2+/L，還原能力為（203.47±23.75）μg抗壞血酸/g，H2O2清除活性為（3 676.60±114.32）μg阿魏酸/g，ABTS+·清除能力為（2 778.70±262.90）μg Trolox/g。

老黑谷米；色素；二次通用旋轉(zhuǎn)；提??；抗氧化活性

目前，色素作為食品添加劑或營養(yǎng)補(bǔ)充劑，廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品、飼料和其他領(lǐng)域。但是，由于大部分合成色素具有不同程度的毒性，對人類有一定的致癌作用，被越來越多的國家限制使用[1-5]。天然色素來自天然物質(zhì)，主要是由植物組織中提取，也包括來自動物和微生物的一些色素。植物色素主要包括花色苷、類胡蘿卜素、甜菜素和葉綠素，可分為脂溶性色素和水溶性色素[1,3,6-8]。雖然天然色素穩(wěn)定性差，但是由于安全性高，具有一定的營養(yǎng)和藥理作用，并且在著色時色調(diào)更能接近天然物質(zhì)的顏色，因此開發(fā)利用動植物天然食用色素資源，日益受到人們的普遍重視[1-8]。近年來，研究者對谷物、果蔬、微生物中色素的提取工藝、結(jié)構(gòu)鑒定和生物學(xué)活性進(jìn)行了大量研究[2-17]。以水、乙醇、甲醇及丙酮等作為提取溶劑，采用微波、超聲等輔助提取方法，利用二次通用旋轉(zhuǎn)、響應(yīng)面等試驗設(shè)計對天然色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并利用比色法對黃烷醇、花色苷等進(jìn)行了含量測定[4,10-11,16-19]；利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜、核磁共振、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法對天然色素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定[2-3,8,17]。大量研究[1-2,6,11-13,20]表明，天然色素具有抗氧化、抑菌、抗癌、抑制肥胖、紫外線防護(hù)、抗炎等作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老黑谷米采自云南迪慶州維西縣攀天閣鄉(xiāng)皆菊村，磨粉后過50 目篩，避光于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯基-2-苦基肼基（1,1-d i p h e n y l-2-p i c r y l h y d r a z y l，D P P H）、三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、六水三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、H2O2、2,2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS）、七水硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、抗壞血酸 上海晶純生化科技股份有限公司；Trolox 美國Sigma公司；阿魏酸、兒茶素 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JFS-13A旋風(fēng)式粉碎磨 杭州錢江儀器設(shè)備有限公司；UV-1800CP紫外分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 最佳提取溶劑的選擇和最大吸收波長的確定

準(zhǔn)確稱取9 份老黑谷米面粉各1 g（干質(zhì)量），置于三角瓶中，分別加入10 mL體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-甲醇溶液、1%鹽酸-乙醇溶液、1%鹽酸溶液、60%甲醇溶液、甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、蒸餾水，提取30 min后，分別用提取溶劑定容至50 mL，在200～1 000 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最佳提取溶劑和最大吸收波長。

1.3.2 單因素試驗

以吸光度為指標(biāo)，在不同條件下考察提取時間、提取溫度、液料比和提取次數(shù)對老黑谷米色素提取效果的影響。提取時間分別為10、20、30、40、50 min，提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g），提取次數(shù)分別為1、2、3、4 次。

1.3.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、液料比和提取時間3 個因素，采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計，進(jìn)行三因素五水平試驗，試驗因素水平見表1。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗因素水平Table 1 Factors and levels used in quadratic general rotary design

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 老黑谷米色素對DPPH自由基清除能力的測定[6,20]

分別吸取0.5 mL色素粗提液，添加2 mL 0.19 mmol/L DPPH溶液，充分振搖后，室溫條件下暗處放置10 min，然后在517 nm波長處比色測定，用乙醇替代色素溶液作為空白。用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為y=0.940 6x+28.698（線性范圍為23.2～139.2 μg/mL，R2=0.969），式中：y為DPPH自由基清除率；x為阿魏酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。自由基清除能力表示為每克干燥樣品中阿魏酸當(dāng)量（μg阿魏酸/g）。

式中：A0為DPPH溶液本身的吸光度（空白對照）；A1為樣品或者陽性對照的DPPH溶液的吸光度。

1.3.4.2 老黑谷米色素對鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定[20-21]

FRAP溶液的配制：乙酸緩沖溶液（300 mmol/L，pH 3.6）、六水三氯化鐵（20 mmol/L）和三吡啶基三嗪（10 mmol/L）以體積比10∶1∶1充分混勻。

吸取100 μL色素粗提液加入3 mL FRAP溶液充分混合，于37 ℃反應(yīng)4 min，在593 nm波長處測定吸光度，用乙醇替代色素溶液作為空白。用硫酸亞鐵繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為y=6.24x+0.000 5（線性范圍為0.2～1.2 mmol/L，R2=0.998 4）。式中：y為吸光度；x為硫酸亞鐵濃度/（mmol/L）。FRAP表示為每毫升色素提取液中Fe2+濃度當(dāng)量（mmol Fe2+/L）。

1.3.4.3 老黑谷米色素對ABTS+·清除能力的測定[20,22-24]

ABTS工作液的配制：將ABTS（7 mmol/L）和過硫酸鉀（2.45 mmol/L）兩種溶液等體積混合，于4 ℃條件下反應(yīng)16 h，得到ABTS工作液。

吸取100 μL色素粗提液，加入3.8 mL ABTS工作液，室溫條件下反應(yīng)6 min，于734 nm波長處測定吸光度，用乙醇替代色素溶液作為空白。用Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為y=5.382 7x+3.3472（線性范圍為7.488～37.44 μg/mL，R2=0.999 7），式中：y為ABTS+·清除率；x為Trolox質(zhì)量濃度/（μg/mL）。自由基清除能力表示為每克干燥樣品中Trolox當(dāng)量（μg Trolox/g）。

式中：A0為ABTS溶液本身的吸光度（空白對照）；A1為樣品或者陽性對照的ABTS溶液的吸光度。

1.3.4.4 老黑谷米色素還原能力的測定[23]

吸取1 mL色素粗提液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6），加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min；再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，4 000×g離心10 min；吸取上清液1 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，于700 nm波長處測定吸光度，用乙醇替代色素溶液作為空白。用抗壞血酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為y=0.045 5x-0.115（線性范圍為80～180 μg/mL，R2=0.991 6），式中：y為吸光度；x為抗壞血酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。還原能力表示為每克干燥樣品中抗壞血酸當(dāng)量（μg抗壞血酸/g）。

1.3.4.5 H2O2清除活性測定[24]

吸取0.6 mL色素粗提液，加入0.9 mL H2O2（40 mmol/L），加入磷酸鈉緩沖溶液（45 mmol/L，pH 7.4），30 ℃反應(yīng)40 min，于230 nm波長處測定吸光度，用乙醇替代色素溶液作為空白。用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：y=0.657 1x-11.119（線性范圍為55～275 μg/mL，R2=0.994 3），式中：y為H2O2清除率；x為阿魏酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。自由基清除能力表示為每克干燥樣品中阿魏酸當(dāng)量（μg阿魏酸/g）。

式中：A0為H2O2溶液本身的吸光度（空白對照）；A1為加有樣品或者陽性對照的H2O2溶液的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑的選擇和最大吸收波長的確定

通過采用9 種不同溶劑對老黑谷米中的色素進(jìn)行提取，并在200～1 000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，在最大吸收波長測定其吸光度，發(fā)現(xiàn)在各種溶劑中，乙醇吸光度較大，提取效果較好，說明該色素為醇溶性色素。

圖1 老黑谷米色素浸提液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of pigments extracted from “Laoheigu” rice

由圖1可看出，色素的乙醇提取液和石油醚提取液的吸收光譜在342 nm和282 nm處均有明顯吸收峰，其中乙醇提取液吸光度最大。由文獻(xiàn)[25]得知，黃酮醇在240～400 nm區(qū)域主要有兩個吸收峰，帶Ⅰ在300～380 nm有最大吸收峰，帶Ⅱ在240～280 nm有最大吸收峰，結(jié)合該色素為醇溶性色素，說明該色素可能為黃酮醇類物質(zhì)。如A環(huán)有氧取代，而B環(huán)沒有氧取代的黃酮醇，其光譜具有一個強(qiáng)的帶Ⅱ和一個弱的帶Ⅰ。帶Ⅰ的位置能夠提供關(guān)于黃酮醇及其氧取代類型的信息。故選取乙醇作為最佳提取溶劑，342 nm作為測定該色素溶液的最大吸收波長。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1 g（干質(zhì)量）樣品，在室溫條件下分別用乙醇提取10、20、30、40、50 min，液料比10∶1、提取次數(shù)2 次，定容于50 mL容量瓶中，在342 nm波長處測定吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對色素提取效果影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction efficiency

由圖2可見，隨著提取時間的延長，色素溶液吸光度呈先上升后下降的趨勢?？赡芴崛r間過長，色素會發(fā)生降解，含量降低，從而導(dǎo)致色素溶液吸光度降低。所以選擇提取時間為40 min。

2.2.2 提取溫度對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1 g（干質(zhì)量）樣品，分別用乙醇在30、40、50、60、70℃條件下進(jìn)行提取，提取時間40 min、液料比10∶1、提取次數(shù)2 次，定容于50 mL容量瓶中，在342 nm波長處測定吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對色素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency

由圖3可知，提取溫度對老黑谷米色素提取效果具有一定的影響，隨著溫度的上升，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在溫度為40 ℃時吸光度最大，顏色也有明顯變化，所以選擇提取溫度為40 ℃。

2.2.3 液料比對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1 g（干質(zhì)量）樣品，分別加入5、10、15、20、25 mL乙醇進(jìn)行提取，提取時間40 min、提取溫度40 ℃、提取次數(shù)2次，定容至50 mL容量瓶中，在342 nm波長處測定吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 液料比對色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid to material on the extraction efficiency

由圖4可知，隨著液料比的上升，吸光度逐漸增大，當(dāng)液料比大于15∶1（mL/g）時，吸光度變化不明顯。料液比過小會造成提取不完全，料液比過大會降低溶劑利用率，造成溶劑和能源的浪費，提高生產(chǎn)成本并給后序的濃縮工序帶來困難，所以選擇液料比為15∶1（mL/g）。

2.2.4 提取次數(shù)對色素提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取1 g（干質(zhì)量）樣品，用乙醇分別提取1、2、3、4 次，提取時間40 min、提取溫度40 ℃、液料比15∶1（mL/g），定容至100 mL容量瓶，在342 nm波長處測定吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對色素提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction number on the extraction efficiency

由圖5可見，隨著提取次數(shù)的增加，色素溶液吸光度呈增加趨勢，當(dāng)提取次數(shù)3 次后，吸光度增加不再明顯?？紤]到提取次數(shù)過多會浪費溶劑且延長提取周期，故選擇提取次數(shù)3 次為宜。

2.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗結(jié)果

2.3.1 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計與結(jié)果

二次通用旋轉(zhuǎn)試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of quadratic general rotary design

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗

利用DPS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為：Y=1.548 70-0.039 93X1+0.066 34X2-0.020 82X3-0.035 79X12+0.000 80X2

2+0.002 04X3

2+ 0.015 50X1X2-0.035 50X1X3+0.002 00X2X3。

根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表3可知，該回歸模型達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說明方程與實際情況擬合良好，能夠反映色素提取效果與提取溫度、液料比和提取時間的關(guān)系。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 變量輪換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i= 1、2、3）范圍內(nèi)，每個因素取5 個水平（±1.682、±1、0），對53=125個方案進(jìn)行統(tǒng)計尋優(yōu)，在試驗范圍內(nèi)可得吸光度的最高值為1.66，此時各因素取值為：X1= -1，X2=+1.682，X3=-1.682，對應(yīng)提取溫度20 ℃、液料比23.4∶1（mL/g）、提取時間26.6 min。

2.3.4 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)

對不同設(shè)計水平條件下的組合進(jìn)行模擬試驗，以均值1.53為臨界值，獲得大于臨界值的方案50個，各變量取值的頻率分布見表4。

表4 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 4 Frequency distribution of Xiin the extraction optimization scheme

由表4可以看出，在95%的置信區(qū)間吸光度大于1.53的優(yōu)化方案為：提取溫度26.08～36.46 ℃、液料比19.51∶1～21.22∶1、提取時間38.285～45.15 min。為了貼近實際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：提取溫度30 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間40 min。對此方案進(jìn)行驗證實驗，色素溶液的吸光度為1.54，與優(yōu)化方案的理論值1.53比較接近，進(jìn)一步證實了方案的可靠性。

2.4 老黑谷米色素的抗氧化活性

由表5可見，老黑谷米色素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。其中DPPH自由基清除能力為（3 512.56±26.28）μg阿魏酸/g，F(xiàn)RAP為（44.04±6.60）mmol Fe2+/L，還原能力為（203.47±23.75）μg抗壞血酸/g，H2O2清除活性為（3 676.60±114.32）μg阿魏酸/g，ABTS+·清除能力為（2 778.70±262.90）μg Trolox/g。

表5 老黑谷米色素的抗氧化能力測定（以每克面粉計，干質(zhì)量）Table 5 Antioxidant capacity of pigments from“Laoheigu”eigu rice ice (per g dry weight of flour)

3 結(jié) 論

老黑谷米色素是一種醇溶性色素，乙醇提取效果最佳，在282 nm和342 nm處有最大吸收波長，初步定性為黃酮醇類物質(zhì)。最佳提取工藝為：提取溫度30 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間40 min。該色素具有較好的抗氧化活性，可作為功能性的天然色素進(jìn)一步開發(fā)利用，也為老黑谷米的開發(fā)利用提供新思路。

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Optimization of Extraction and Antioxidant Activities in Vitro of Pigments from the Grains of “Laoheigu” Rice

HUANG Jiaqi1, YANG Shihua2, CHU Yajie1, TAO Liang3, FENG Zhixiang1, LI Huajun1, YAN Yan1, LI Xueliang1, LI Yongqiang1,*
(1. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. College of Foreign Languages, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

The extraction process for pigments from the grains of “Laoheigu” rice, a red-grained rice variety grown in Pantiange town, Diqing prefecture, Yunnan province was optimized by quadratic general rotary design based on single factor experiments and the antioxidant activities in vitro of the extracted pigments were investigated. The results showed that the best extraction solvent for the pigments was determined as alcohol and the maximum absorption peaks appeared at 282 and 342 nm, suggesting that they were flavonol compounds. The optimum extraction conditions were as follows: extraction temperature, 30 ℃; liquid to material ratio, 20:1 (mL/g); and extraction time, 40 min. The pigments had potent antioxidant activities; DPPH radical scavenging activity was (3 512.56 ± 26.28) μg ferulic acid equivalents/g; ferric reducing antioxidant power (FRAP) was (44.04 ± 6.60) mmol Fe2+equivalents/L; reducing power (RP) was (203.47 ± 23.75) μg ascorbic acid equivalents/g; hydrogen peroxide scavenging activity was (3 676.60 ± 114.32) μg ferulic acid equivalents/g, and 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) radical scavenging activity was (2 778.70 ± 262.90) μg Trolox equivalents/g.

“Laoheigu” rice; pigments; quadratic general rotary design; extraction; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201602004

TS201.4

A

1002-6630（2016）02-0019-06

黃佳琦, 楊士花, 初雅潔, 等. 老黑谷米色素的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 19-24. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602004. http://w ww.spkx.net.cn

HUANG Jiaqi, YANG Shihua, CHU Yajie, et al. Optimization of extraction and antioxidant activities in vitro of pigments from the grains of “Laoheigu” rice[J]. Food Science, 2016, 37(2): 19-24. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602004. http://www.spkx.net.cn

2015-06-02

國家自然科學(xué)基金面上項目（31360378；31560428）；云南省自然科學(xué)基金項目（2013FB042）；云南省高校食品加工與安全控制重點實驗室項目（201401）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510676001）

黃佳琦（1993—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：601017577@qq.com

*通信作者：李永強(qiáng)（1975—），男，副教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：Liyongqiang7512@163.com