金 虎，時(shí) 杰，關(guān) 品，李坤朋，黃鳳洪，鈕琰星，王改改，陳 洪，周新安

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062；2.湖北嘗香思食品有限公司，湖北潛江 433121）

大豆品種和混菌發(fā)酵對(duì)納豆品質(zhì)及風(fēng)味改良效果研究

金 虎1，時(shí) 杰1，關(guān) 品2，李坤朋1，*黃鳳洪1，鈕琰星1，王改改1，陳 洪1，周新安1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062；2.湖北嘗香思食品有限公司，湖北潛江 433121）

以納豆激酶活性和游離氨基酸含量為納豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了不同品種大豆對(duì)發(fā)酵納豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)的影響，并考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵模式對(duì)改善納豆風(fēng)味的作用效果。結(jié)果表明，不同大豆品種中蛋白含量差異對(duì)納豆品質(zhì)影響不大，對(duì)同一品種大豆而言，種植地域差異對(duì)納豆激酶活性有影響，但對(duì)游離氨基酸含量影響不大；乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發(fā)酵能夠明顯改善納豆風(fēng)味，但同時(shí)也會(huì)降低納豆中游離氨基酸含量，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對(duì)納豆激酶分泌具有促進(jìn)作用，適合納豆激酶表達(dá)的最佳接種體積比為1.6∶1。

納豆；納豆激酶；乳酸菌；風(fēng)味；混菌發(fā)酵

0 引言

納豆是日本傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，歷史悠久，其以大豆為原料，經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成。在納豆發(fā)酵過(guò)程中，納豆芽孢桿菌會(huì)產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶（即納豆激酶），該酶具有纖溶活性，可以治療和預(yù)防血栓疾病。另外，納豆還具有抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高蛋白質(zhì)的消化率等多種保健功能。納豆作為一種具有多種保健功能的大豆發(fā)酵食品，值得在我國(guó)推廣，但傳統(tǒng)的日本納豆帶有氨臭味，其風(fēng)味使我國(guó)消費(fèi)者難以接受。

為改善納豆的風(fēng)味，許多研究者從工藝優(yōu)化［1］、輔料添加［2］、混合發(fā)酵［3］和菌株改造［4］等方面做了大量的研究工作。該研究以湖北省幾個(gè)具有代表性的大豆品種為研究對(duì)象，對(duì)比考察以這幾種大豆以及市購(gòu)東北大豆為原料對(duì)發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響。同時(shí)，考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發(fā)酵對(duì)納豆品質(zhì)及風(fēng)味改良的作用效果，為篩選適合納豆發(fā)酵的優(yōu)異大豆品種及實(shí)現(xiàn)納豆產(chǎn)品的本土化和工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1.1 試驗(yàn)原料

鄂豆8號(hào)、早熟8號(hào)、鄂豆10號(hào)、中豆32、中豆30、天隆1號(hào)和天隆2號(hào)大豆，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所周新安研究員提供；東北大豆，于附近市場(chǎng)購(gòu)買。

1.1.2 菌種

納豆芽孢桿菌，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；乳酸菌為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）乳酸菌種子培養(yǎng)基。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，pH值調(diào)節(jié)至6.5。

（2）納豆芽孢桿菌種子培養(yǎng)基。蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.2。

1.2.1 菌種活化和搖瓶種子培養(yǎng)

先將保藏于-80℃冰箱中的納豆芽孢桿菌和乳酸菌分別轉(zhuǎn)接于LB和MRS斜面培養(yǎng)基上，然后分別放入28℃和37℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，得到活化的菌株。分批挑取活化后的納豆芽孢桿菌和乳酸菌單菌，落于納豆芽孢桿菌和乳酸菌種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，納豆芽孢桿菌培養(yǎng)溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間14 h；乳酸菌培養(yǎng)為靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

1.2.2 納豆發(fā)酵

將一定量不同品種大豆用清水沖洗除雜后，置于3倍量的清水中浸泡14～18 h。將浸泡好的大豆瀝水后，于121℃條件下滅菌30 min。待滅菌后的大豆冷卻至40℃左右時(shí)，將乳酸菌和納豆芽孢桿菌以不同體積比接種液態(tài)種子，攪拌均勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵好的納豆放入4℃冰箱后熟24 h，即得成熟的納豆。

1.2.3 納豆激酶活性檢測(cè)

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法，具體方法見參考文獻(xiàn)［3］。取5 g納豆，加5 mL生理鹽水?dāng)嚢?，在低溫?℃）條件下提取1 h，吸取0.5 mL提取液于離心試管中，以轉(zhuǎn)速1 000 r/min于低溫（4℃）下離心10 min，取上清液待用。制瓊脂糖-纖維蛋白平板時(shí)，取1%瓊脂糖溶液16.2 mL，在45℃水浴中保溫30 min，然后將1.3 mL凝血酶溶液倒入瓊脂糖中，混勻后置于45℃水浴中保溫5 min的纖維蛋白原溶液16.2 mL，充分混合后立刻倒入培養(yǎng)皿中，室溫放置1 h，即得瓊脂糖-纖維平板。然后在平板上打直徑2 mm的孔，每孔點(diǎn)離心上清液樣品10 μL，靜置10 min，于37℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h，測(cè)量溶圈大小。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算納豆激酶活性。

1.2.4 游離氨基酸含量測(cè)定

取一定量混勻的納豆樣品放入研缽中細(xì)細(xì)研碎成糊狀，從中取1 g粉碎的納豆于燒杯中，用去離子水充分溶解并定容至50 mL，過(guò)夜存放。然后，按參考文獻(xiàn)［5］方法測(cè)定游離氨基酸質(zhì)量濃度。

1.2.5 拉絲長(zhǎng)度的測(cè)定及感官評(píng)定

見［6］并作適當(dāng)修改。將納豆均勻攪拌后用筷子挑起，以10 cm為1個(gè)單位，從中間挑起，垂直拉10 cm為2個(gè)單位，再?gòu)睦鸬?0 cm中挑起，依次重復(fù)進(jìn)行，直至拉斷。記錄拉絲的數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

在相同發(fā)酵條件下，比較研究了湖北地區(qū)種植的不同大豆品種和市售東北大豆作為原料對(duì)發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響。

不同大豆品種對(duì)發(fā)酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量的影響見表1。

表1 不同大豆品種對(duì)發(fā)酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量的影響

由表1可知，湖北省大豆中蛋白含量普遍高于市售東北大豆，其中鄂豆8號(hào)大豆中蛋白含量高達(dá)48.8%，比市售東北大豆蛋白含量（41.5%）高7.3%；天隆2號(hào)大豆中蛋白和脂肪含量與東北大豆接近。納豆激酶活性和游離氨基酸含量作為評(píng)價(jià)納豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，發(fā)酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量與大豆原料中蛋白含量無(wú)明顯相關(guān)性，中豆32號(hào)中蛋白含量較高（47.6%），但納豆激酶活性最低，每1 g納豆中納豆激酶活性僅為183 IU。綜合考慮納豆激酶活性和游離氨基酸含量2種指標(biāo)，天隆1號(hào)大豆為最適合納豆發(fā)酵大豆原料，其納豆激酶活性和游離氨基酸含量分別高達(dá)579 IU/g和300.9 μmol/g。

對(duì)同一大豆品種（鄂豆8號(hào)）在湖北不同種植地的大豆原料進(jìn)行了收集，比較了這些大豆作為原料生產(chǎn)發(fā)酵納豆的情況。

同一大豆品種（鄂豆8號(hào)）不同種植地對(duì)發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響見表2。

表2 同一大豆品種（鄂豆8號(hào)）不同種植地對(duì)發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響

由表2可知，大豆中蛋白和脂肪含量不僅與大豆品種有關(guān)，還與種植地域相關(guān)。種植在朱湖村的大豆蛋白含量要普遍高于種植在楊林村的同品種大豆，最高蛋白含量相差5.1%。種植于朱湖村的鄂豆8號(hào)大豆作為原料發(fā)酵的納豆中納豆激酶活性是種植于楊林村大豆所發(fā)酵納豆激酶活性的1.9～2.3倍，明顯高于種植于楊林村的大豆。種植地域差異對(duì)同一大豆品種發(fā)酵納豆中游離氨基酸含量影響不大，游離氨基酸含量約在300 μmol/g。

在以單一納豆芽孢桿菌對(duì)大豆進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵后的納豆具有很明顯的氨味。為此，本研究考察混合菌種發(fā)酵，即同時(shí)接種乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)改善納豆風(fēng)味的效果。

乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆發(fā)酵品質(zhì)的影響見表3。

表3 乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，與單一納豆芽孢桿菌發(fā)酵相比，隨著乳酸菌接種比例的逐步增加，發(fā)酵納豆的氨味逐漸減弱，當(dāng)乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比大于1∶1時(shí)，發(fā)酵納豆的氨味消失，且納豆呈現(xiàn)出特殊的醇香味，表明乳酸菌和納豆芽孢桿菌混菌發(fā)酵可以明顯改善納豆的風(fēng)味。而且，混合菌種發(fā)酵對(duì)發(fā)酵納豆的形狀和金屬光澤沒(méi)有影響，對(duì)納豆拉絲效果也影響不大。

乳酸菌在改善納豆風(fēng)味的同時(shí)，是否會(huì)對(duì)納豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)尤其是納豆激酶活性產(chǎn)生影響。為此，考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發(fā)酵及接種比例對(duì)納豆激酶活性的影響。

乳酸菌與納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆激酶活性的影響見圖1。

由圖1可知，當(dāng)乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例逐漸增加至1時(shí)，納豆激酶活性略有降低（從670 IU/g降至460 IU/g）。當(dāng)乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比從1∶1增加至1.6∶1時(shí)，納豆激酶活性顯著增加；當(dāng)接種比例為1.6∶1時(shí)，納豆激酶活性高達(dá)1 080 IU/g，是單一納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)活性的1.6倍。但隨著接種比例的繼續(xù)增加，納豆激酶活性開始逐漸降低，當(dāng)乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比為3∶1時(shí)，納豆激酶活性降至346 IU/g，約為單一納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)活性的0.5倍。上述結(jié)果表明，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對(duì)納豆激酶分泌具有促進(jìn)作用，適合納豆激酶表達(dá)的最佳接種比例為1.6∶1。

圖1 乳酸菌與納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆激酶活性的影響

已有研究表明，納豆發(fā)酵過(guò)程中有50%～60%分解成水溶性氮化物，其中游離氨基酸含量占10%［7］。而且，納豆中游離氨基酸的含量與納豆風(fēng)味直接相關(guān)，納豆中游離氨基酸態(tài)氮含量的高低可作為納豆生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵控制點(diǎn)［8］。

乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆游離氨基酸含量的影響見圖2。

圖2 乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對(duì)納豆游離氨基酸含量的影響

由圖2可知，隨著乳酸菌接種比例的逐漸增加，納豆中游離氨基酸含量逐漸下降，當(dāng)乳酸菌和納豆芽孢桿菌的接種體積比為1∶1時(shí)，游離氨基酸質(zhì)量濃度約下降至單一納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)的50%，表明乳酸菌的添加弱化了大豆蛋白的分解速度。

3 結(jié)論

比較研究了湖北地區(qū)不同品種大豆和不同種植地同一品種大豆作為納豆發(fā)酵原料對(duì)納豆品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，天隆1號(hào)大豆為最適合納豆發(fā)酵大豆原料，其納豆激酶活性和游離氨基酸含量分別高達(dá)579 IU/g和300.9 μmol/g；種植在朱湖村的鄂豆8號(hào)大豆蛋白含量要普遍高于種植在楊林村的鄂豆8號(hào)大豆，最高蛋白含量相差5.1%；種植地域差異對(duì)同一大豆品種發(fā)酵納豆中游離氨基酸含量影響不大，游離氨基酸含量約在300 μmol/g；乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發(fā)酵能夠明顯改善納豆風(fēng)味，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對(duì)納豆激酶分泌具有促進(jìn)作用，適合納豆激酶表達(dá)的最佳接種體積比為1.6∶1。

［1］ 關(guān)茵，肖然，李春.從工藝角度改善納豆風(fēng)味的研究 ［J］.中國(guó)釀造，2010（6）：75-77.

［2］ 陳文珊，關(guān)茵，肖然，等.輔料對(duì)納豆風(fēng)味影響的研究 ［J］.中國(guó)調(diào)味品，2011（1）：55-57.

［3］ 黃占旺，上官新晨，程軍輝，等.納豆混合發(fā)酵技術(shù)研究 ［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2005（4）：70-73.

［4］ 黃蓓，吳旭蕾，錢炳俊，等.納豆芽孢桿菌rocG基因和ure基因敲除載體的構(gòu)建 ［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2013（5）：16-19.

［5］Lie S.The EBC-ninhydrin method for determination of free alpha amino nitrogen［J］.Journal of the Institute of Brewing，1973，79（1）：37-41.

［6］ 奚銳華，齊鳳蘭，陳有容.納豆生產(chǎn)工藝的優(yōu)化 ［J］.食品工業(yè)科技，2004（3）：78-80.

［7］ 李麒.納豆的營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值 ［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2002（1）：48-49.

［8］ 王冬燕，王遠(yuǎn)紅，郭麗萍，等.納豆中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定 ［J］.食品工業(yè)科技，2010（9）：361-362.◇

The influences of soybean varieties on natto quality and mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto on natto flavor improvement are investigated based on the nutritional evaluation indexes of nattokinase activities and free amino acids content.The results indicate that natto quality is not influenced by the difference of protein contents in different soybean varieties.For the same soybean varieties，the difference of planting areas would influence the nattokinase activities but not the concentration of free amino acids.Mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto could improve the natto flavor significantly，but the concentration of free amino acids will be decreased correspondingly.A suitable ratio of Lactobacillus and Bacillus natto ranging from 1.2∶1～2.0∶1 can promote the secretion of nattokinase and the optimal ratio of Lactobacillus and Bacillus natto is 1.6∶1.

nattto；nattokinase；Lactobacillus；flavor；mixed fermentation

1671-9646（2016）09a-0004-04

TS214

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.002

2016-07-08

湖北省重大科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2014ABBOB）。

金 虎 （1980— ），男，博士，助理研究員，研究方向?yàn)橛土巷炂傻纳镛D(zhuǎn)化與高值化利用。

黃鳳洪（1965— ），男，博士，研究員，研究方向?yàn)橛土霞庸ぁ?/p>