惠永崗，楊宇焦，陳昌林，余慶波，馬丁，萬(wàn)勇

(1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，陜西 咸陽(yáng)　712000；2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充　637000)

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極化液對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟的保護(hù)作用

惠永崗1，楊宇焦2，陳昌林2，余慶波2，馬丁1，萬(wàn)勇2

(1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，陜西 咸陽(yáng)712000；2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充637000)

目的：探討高濃度極化液(GIK)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷的保護(hù)作用。方法：連續(xù)3 d腹腔注射脂多糖(LPS)5 mg·kg-1·d-1，構(gòu)建內(nèi)毒素血癥小鼠模型，運(yùn)用ELISA、脾臟指數(shù)、組織病理學(xué)等方法明確GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷是否起保護(hù)作用。結(jié)果：與LPS組小鼠比較，GIK組小鼠脾臟中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，抑炎因子IL-10表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；脾臟損傷明顯減輕。結(jié)論：GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷具有保護(hù)作用。

脂多糖；內(nèi)毒素血癥；脾臟損傷；極化液

細(xì)菌內(nèi)毒素即為脂多糖，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要結(jié)構(gòu)，其中類脂A是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中最穩(wěn)定且具有生物活性的部分[1]。內(nèi)毒素作用于機(jī)體單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞膜表面的Toll樣受體(toll-like receptor,TLR),激活核因子NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，最終導(dǎo)致炎癥細(xì)胞釋放大量的炎性物質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)毒素有關(guān)的急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征以及多器官功能障礙綜合癥是臨床病人感染死亡的重要原因[3-5]。內(nèi)毒素血癥及其引起的感染、多器官損傷和多器官功能衰竭一直是困擾臨床和重癥監(jiān)護(hù)的問題，內(nèi)毒素血癥還可導(dǎo)致機(jī)體促炎抗炎失衡、大量的淋巴細(xì)胞凋亡，而脾臟作為主要的外周免疫器官，內(nèi)毒素血癥也可導(dǎo)致其不同程度的損害。既往研究主要傾向于脾臟儲(chǔ)血造血方面，近年來更關(guān)注脾臟是機(jī)體免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中心的重要組成部分,認(rèn)為脾臟具有造血、濾血、抗感染和抗腫瘤作用。有研究報(bào)道，GIK可以抑制機(jī)體促炎因子分泌，誘導(dǎo)抑炎因子的分泌，所以我們運(yùn)用GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷模型進(jìn)行治療干預(yù)，為內(nèi)毒素血癥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠共45只, 雄性(8～10周齡)，體重質(zhì)量20～23 g，購(gòu)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑

LPS購(gòu)自Sigma公司，10%葡萄糖注射液、10%氯化鉀注射液、50%葡萄糖注射液、胰島素注射液均由附院麻醉科提供，4%多聚甲醛購(gòu)自成都科龍化工、磷酸鹽緩沖液購(gòu)自北京中山金橋、小鼠TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立

將45只清潔級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、LPS組、GIK組，每組15只。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠均測(cè)體重，連續(xù)3 d LPS組和GIK組每天9∶00給予腹腔注射LPS 5 mg·kg-1·d-1，GIK組經(jīng)尾靜脈注射GIK10 mL/kg，每日3次，間隔8 h。正常對(duì)照組和LPS組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg，每日3次，間隔8 h。

1.4標(biāo)本采集

行腹部正中切口暴露小鼠器官，找到小鼠脾臟，完整分離取出脾臟稱取脾臟重量，剪一塊脾臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h、經(jīng)過梯度酒精脫水、石蠟包埋切片后HE染色觀察脾臟情況。剩余脾臟組織用冰的PBS洗去血跡，濾紙吸干水分，凍存與-80 ℃保存以備勻漿做ELISA。

1.5脾臟指數(shù)的計(jì)算

根據(jù)脾臟指數(shù)=脾臟重量(g)/小鼠重量(kg)的公式，計(jì)算出脾臟指數(shù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法分析各組脾臟指數(shù)的變化。

1.6脾臟病理切片

將固定于4%多聚甲醛的脾臟樣本，經(jīng)過72 h固定后，進(jìn)行脫水處理。將處理好的組織用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，石蠟冷凝后，修整蠟塊，在組織切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm，防脫載玻片撈片后，放置于木架上，在70 ℃的電熱干燥機(jī)中烤片4～5 h，使片子上的石蠟完全融化，標(biāo)本即貼于載玻片上。烤干的片子放于切片盒，密封保存于室溫或4 ℃條件下。染色前，將切片放于70 ℃的電熱干燥機(jī)中烤片1 h。經(jīng)過脫蠟、染色后在通風(fēng)櫥中晾干，用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下選取相同部位采集、分析圖片。

1.7ELISA檢測(cè)各組脾臟組織中炎癥因子表達(dá)

用無(wú)菌剪刀減碎脾臟組織，稱取相同重量組織，用pH 7.4的PBS作為介質(zhì)勻漿，勻漿充分后離心20 min(3 000轉(zhuǎn)/min)。仔細(xì)收集上清，分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用；分別用不同的試劑盒檢測(cè)脾臟組織中各因子的表達(dá)：步驟依次為：稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、終止、測(cè)定、計(jì)算等步驟。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組小鼠脾臟指數(shù)相比，LPS組小鼠脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)；GIK組小鼠脾臟指數(shù)較正常對(duì)照組低，但是較LPS組小鼠顯著升高(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖1。

表1　各組小鼠脾臟指數(shù)情況

*P<0.05，#P<0.01，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與LPS組比較。

*P<0.05，#P<0.01，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與LPS組比較。

2.2HE染色觀察

正常對(duì)照組小鼠脾臟肉眼觀察邊緣光滑清晰、有光澤、鏡下觀察可見脾臟無(wú)充血、脾臟實(shí)質(zhì)中有散在的白髓、白髓和紅髓分界清晰； LPS組小鼠脾臟肉眼觀察脾臟變小、顏色發(fā)黑、無(wú)光澤、脾臟表面有膿癍、鏡下觀察脾臟充血、各細(xì)胞之間間隙增大、質(zhì)松、白髓和紅髓間隙不清楚、淤血、紅髓內(nèi)灶狀多核細(xì)胞侵潤(rùn)、碎裂細(xì)胞組織； GIK組小鼠的脾臟損害程度明顯比LPS組減輕，見圖2。

2.3脾臟中細(xì)胞因子表達(dá)變化

LPS組和GIK組的小鼠脾臟TNF-α表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，GIK組小鼠的TNF-α表達(dá)水平顯著低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2、圖3)。GIK 組小鼠脾臟中IL-10表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)和LPS組(P<0.05)(表2、圖3)與正常對(duì)照組比較，LPS組小鼠脾臟中IL-1β的表達(dá)水平顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GIK組小鼠脾臟中IL-1β的表達(dá)水平比LPS組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2、圖3。

表2　脾臟中炎癥因子表達(dá)

*P<0.05，#P<0.01，□P<0.001，與正常對(duì)照組比較；△P<0.05，▲P<0.01， 與 LPS組比較。

3　討論

在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們分別給予3組小鼠不同劑量(2.5 mg·kg-1·d-1、5 mg·kg-1·d-1、7.5 mg·kg-1·d-1)的LPS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5 mg·kg-1·d-1組小鼠反應(yīng)較輕，脾臟損傷效果不明顯；7.5 mg·kg-1·d-1組小鼠癥狀比較重，死亡率較高，不利于實(shí)驗(yàn)的開展；而5 mg·kg-1·d-1組小鼠脾臟損傷較明顯，但全身癥狀不明顯，結(jié)合其它相關(guān)文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)造模劑量，我們選擇5 mg·kg-1·d-1的劑量來創(chuàng)造實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究。

GIK的臨床應(yīng)用已有幾十年，但對(duì)其療效長(zhǎng)期存在爭(zhēng)議，近年的研究分析顯示對(duì)其療效存在爭(zhēng)議的原因之一就是所用的GIK濃度不同[6-8]，高濃度的GIK(25%葡萄糖，80 mmol/L氯化鉀，50 IU/L普通胰島素)能很好的保護(hù)缺血心肌。而低濃度GIK可能作用不大甚至沒有保護(hù)作用。近年提出的胰島素學(xué)說：即胰島素除了具有調(diào)節(jié)代謝外，還可以通過激活心血管內(nèi)源性PI3K-Akt-eNOS信號(hào)途徑，抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生，減輕缺血心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，直接抗凋亡，抑制促炎細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎作用，從而通過多種機(jī)制發(fā)揮心血管保護(hù)作用[9]。由于胰島素具有抗凋亡的作用，葡萄糖還能為炎癥缺血細(xì)胞提供能量，而且內(nèi)毒素血癥有大量的淋巴細(xì)胞凋亡，因此理論上GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，通過連續(xù)3 d腹腔注射LPS (5 mg·kg-1·d-1)建立BALB/c小鼠內(nèi)毒素血癥脾臟損傷模型，然后經(jīng)尾靜脈緩慢注射10 mL/kg的GIK(葡萄糖：200 g/L，胰島素：60 IU/L，氯化鉀：60 mmol/L)q 8 h，3 d后觀察小鼠行為學(xué)、體重變化、脾臟組織病理、脾臟指數(shù)、脾臟組織中IL-1β、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LPS組比較，GIK組小鼠癥狀明顯減輕；組織病理學(xué)提示GIK組小鼠脾臟損傷明顯減輕；ELISA結(jié)果提示GIK組小鼠促炎細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α明顯降低，而抑炎細(xì)胞因子IL-10明顯升高。由此可以說明此濃度劑量組GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠脾臟損傷有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的不足之處是，沒有對(duì)GIK的不同劑量進(jìn)行比較，其次沒有對(duì)GIK對(duì)內(nèi)毒素血癥的抗凋亡機(jī)制進(jìn)行深入研究。其機(jī)制可能為：(1)抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌和增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，從而使失控的促炎/抗炎反應(yīng)趨于平衡；(2)抑制TNF-α表達(dá)，起到抗炎作用；(3)極化液中的葡糖糖使機(jī)體糖代謝平衡，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，使機(jī)體抵抗力增強(qiáng)，有利于抵抗炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素血癥小鼠的脾臟會(huì)受到損害，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，脾臟中促炎因子表達(dá)顯著上調(diào)，大量研究表明[10-11]，抗凋亡可作為膿毒癥的治療措施，其不僅能減輕免疫細(xì)胞的凋亡，同樣能減少肝、肺、心肌和小腸上皮細(xì)胞的凋亡，從而減少并發(fā)癥，改善膿毒癥預(yù)后，提高膿毒癥患者的生存率。尾靜脈注射 GIK可以有效促進(jìn)脾臟組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，使促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)下調(diào)，抑炎因子IL-10表達(dá)上調(diào)。脾臟指數(shù)作為評(píng)估機(jī)體免疫能力的一個(gè)指標(biāo)，可以反應(yīng)機(jī)體的抵抗能力，本研究通過比較正常對(duì)照組、LPS組和GIK組3組的脾臟指數(shù)，發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠的脾臟指數(shù)下降明顯，GIK組小鼠的脾臟指數(shù)比LPS組明顯增高，由此可見，GIK對(duì)小鼠的免疫能力有提高作用。通過ELISA法檢測(cè)血中炎性因子的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn)GIK對(duì)機(jī)體全身血液中促炎因子的降低也有顯著作用。由此可見，GIK對(duì)機(jī)體的免疫具有一定的保護(hù)作用，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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(學(xué)術(shù)編輯：林菁艷)

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Roles of GIK on spleen in a mouse model of endotoxemia

HUI Yong-gang1,YANG Yu-jiao2,CHEN Chang-lin2,YU Qing-bo2,MA Ding1,WAN Yong2

(1.DepartmentofAnesthesiology,XianyangCentralHosptial,Xianyang712000,Shaanxi;2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To explore the protection effect of high concentration polarization(GIK) on endotoxemia mice spleen injury induced by lipopolysaccharide.Methods：Endotoxemia mice model induced by 5 mg·kg-1·d-1lipopolysaccharide injection intraperitoneally for 3 consecutive days.To apply ELISA，splenic index，histopathology to make sure if there was a protection effect of GIK on endotoxemia mice spleen injury.Results：Compared with lipopolysaccharide group，the express of pro-inflammatory cytokines TNF-α、IL-1β of GIK group was down-regulated obviously(P<0.01)，anti-inflammatory cytokine IL-10 was up-regulated(P<0.01)；the spleen index was increased notably(P<0.05)；the spleen injury was attenuated significantly.Conclusion：GIK has a protection effect on endotoxemia mice spleen injury.

Lipopolysaccharide;Endotoxemia;Spleen injury;Polarization

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.010

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(16ZA0238)

2015-12-25

惠永崗(1983-)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師。E-mail：609729854@qq.com

萬(wàn)勇，E-mail：wanyong@medmail.com.cn

時(shí)間：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.020.html

1005-3697(2016)05-0659-04

R631

A