王豪舉，楊大吉，高勝男，馬卉佳，張家驊，沈建忠，丁紅雷

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北培 400715）

重慶市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

王豪舉1，2，楊大吉2，高勝男2，馬卉佳2，張家驊2，沈建忠1，丁紅雷2

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北培 400715）

為了解重慶市部分區(qū)縣動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況，采集重慶市北碚區(qū)、合川區(qū)、榮昌縣部分養(yǎng)殖場466份畜禽糞便樣品，將樣品劃線接種于Mueller-HInton高鹽平板，挑取可疑菌落接種LB液體培養(yǎng)基，提取基因組后，通過PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌特異性nuc基因，對鑒定的金黃色葡萄球菌進(jìn)行23種臨床常用抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果從466份樣品中分離出25株金黃色葡萄球菌，包括17株雞源菌株和8株豬源菌株。25株臨床分離株對23種抗菌藥物均有不同程度耐藥，對氨芐西林、青霉素G、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、林可霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率超過60%，對阿米卡星、呋喃唑酮、萬古霉素只有1株細(xì)菌耐藥。所有分離菌均為多重耐藥。表明分離菌的耐藥性嚴(yán)重。本試驗(yàn)結(jié)果為重慶市養(yǎng)殖場的臨床用藥提供了參考，為研究重慶市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的耐藥基因、耐藥機(jī)制和耐藥傳播規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌；分離鑒定；PCR；藥物敏感性試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌是一種人和動(dòng)物常見的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、環(huán)境條件惡劣或存在外傷時(shí)，金黃色葡萄球菌可以侵入機(jī)體，引起局部膿腫、膿毒血癥、動(dòng)物乳房炎等疾病。隨著抗菌藥物在養(yǎng)殖業(yè)和臨床治療中的廣泛使用，大量耐藥菌株出現(xiàn)，并受到各國政府和科學(xué)家的關(guān)注。分離于患乳房炎奶牛的MRSA與分離于人的MRSA基因型十分相似［1］。因此，金黃色葡萄球菌，特別是部分金黃色葡萄球菌耐藥菌株是一種真正的人獸共患傳染病病原菌，這些菌株對于人類健康是一個(gè)十分嚴(yán)重的威脅。為了研究重慶市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況，并為后續(xù)的耐藥機(jī)制、傳播規(guī)律和與人型菌株的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，我們在重慶部分區(qū)縣的養(yǎng)殖場分離鑒定了部分金黃色葡萄球菌，并測定了這些菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感性。

1　材料與方法

1.1菌株金黃色葡萄球菌菌株CQHC4CSA002、CQRC4PSA005由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基、革蘭染色液，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×Taq Master Mix，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；MarkerⅢ，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3藥敏試紙25種藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司。（1）β-內(nèi)酰胺類：（A）青霉素類：青霉素G、氨芐西林、阿莫西林；（B）頭孢類：頭孢拉定、頭孢唑啉；（2）氨基糖苷類：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、大觀霉素；（3）喹諾酮類：恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星；（4）磺胺類藥物：磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明；（5）硝基呋喃類：呋喃唑酮；（6）四環(huán)素類：四環(huán)素、強(qiáng)力霉素；（7）大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、林可霉素；（8）萬古霉素類：萬古霉素；（9）氯霉素類：氯霉素。

1.4樣本采集和處理

1.4.1樣本采集所有樣本于2014年10月至12月采集于北碚區(qū)兩個(gè)養(yǎng)雞場（養(yǎng)雞場1、養(yǎng)雞場2）、1個(gè)養(yǎng)豬場（養(yǎng)豬場1）、1個(gè)奶牛場（奶牛場1），合川區(qū)1個(gè)養(yǎng)雞場（養(yǎng)雞場3）和1個(gè)養(yǎng)豬場（養(yǎng)豬場2），榮昌縣1個(gè)養(yǎng)雞場（養(yǎng)雞場4）和1個(gè)養(yǎng)豬場（養(yǎng)豬場3）。采集的所有樣本均置于有冰袋的泡沫箱中，6 h之內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。（1）豬糞便的采集：用無菌棉簽取0.5 g左右的糞便盛于2 mL滅菌離心管；（2）雞羽毛的采集：每只雞拔取1～3根羽毛置于2 mL滅菌離心管；（3）牛乳的采集：收集每頭牛擠奶時(shí)的第一把奶0.5～1 mL置于2 mL滅菌離心管。

1.4.2樣本處理 （1）豬糞便的處理：每個(gè)裝豬糞便的離心管中加入1.5 mL PBS震蕩后靜置2 h，使細(xì)菌從糞便中釋放游離出來，再次震蕩混勻后吸取0.2 mL液體于Mueller-Hinton高鹽培養(yǎng)基中增菌8 h；（2）雞羽毛和牛奶的處理：雞羽毛和牛奶直接加入Mueller-Hinton高鹽培養(yǎng)基中增菌8 h。增菌后的菌液劃線Mueller-Hinton高鹽平板，37℃培養(yǎng)20 h后置于4℃3～4 d。每個(gè)平板挑取3～5個(gè)淺黃色、黃色或橙色疑似金黃色葡萄球菌菌落劃線于LB平板，37℃培養(yǎng)20 h。挑取單個(gè)菌落，革蘭染色觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4.3臨床菌株的PCR檢測

1.4.3.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因序列［2］，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物nuc-F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3′和nuc-R：5′-CATCAGCATAAATATAC GCTAAGCCAC-3'。引物由英濰捷基公司合成。

1.4.3.2菌株P(guān)CR模板的制備挑取有金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)特征的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，220 r/min 37℃培養(yǎng)8 h。將新鮮培養(yǎng)的菌液2 mL 12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入1 mL ddH2O，重懸，立即12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入50 μL ddH2O，105℃處理10 min。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.3臨床菌株的PCR鑒定PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μL，nuc-F（10 μmol/L）0.5 μL，nuc-R（10μmol/L）0.5 μL，模板0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應(yīng)體系20 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以金黃色葡萄球菌CQHC4CSA002和CQRC4PSA005作為陽性對照。

1.4.4藥物敏感性試驗(yàn)紙片法測定分離菌株對23種抗菌藥物的敏感性。參照《動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法與稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（2013版）》、《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)；第二十三版資料增刊》和敬德仲［3］與華春珍［4］的方法操作與進(jìn)行結(jié)果判定。

2　結(jié)果

2.1菌株分離情況將平板上疑似為金黃色葡萄球菌的菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌特異基因nuc片段，最終共鑒定出25株金黃色葡萄球菌（圖1），包括17株雞源菌株（泳道1～17）、8株豬源菌株（泳道18-25），未分離到牛源菌株。在北碚區(qū)共分離金黃色葡萄球菌12株，其中養(yǎng)雞場1分離雞源菌株7株，養(yǎng)雞場2分離雞源菌株4株，養(yǎng)豬場1分離豬源菌株1株；合川區(qū)共分離金黃色葡萄球菌2株，其中養(yǎng)雞場3分離雞源菌株1株；養(yǎng)豬場2分離豬源菌株1株；在榮昌縣共分離金黃色葡萄球菌11株，其中養(yǎng)雞場4分離雞源菌株5株，養(yǎng)豬場3分離豬源菌株6株。

圖1　臨床分離株的PCR鑒定結(jié)果

表1　金黃色葡萄球菌樣品采集及菌株分離

2.2藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果25株臨床分離株金黃色葡萄球菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。通過表2和表3可知，所分離的25株金黃色葡萄球菌中，所有菌株均對氨芐西林耐藥；23株菌對四環(huán)素耐藥（除1株分離自北碚的雞源菌株和1株分離自合川的豬源菌株）；對強(qiáng)力霉素、青霉素G、林可霉素、頭孢拉定、氯霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、鏈霉素的耐藥菌株數(shù)次之，分別為18株、17株、15株、13株、13株、11株、11株和10株，分別占所有菌株數(shù)的72%、68%、60%、52%、52%、44%、44%和40%；對卡那霉素、乳酸環(huán)丙沙星、磺胺異噁唑耐藥的菌株數(shù)均為9株，占所有菌株數(shù)的36%；對大觀霉素、諾氟沙星耐藥的菌株有8株，占所有菌株數(shù)的32%；對阿莫西林、恩諾沙星、慶大霉素、頭孢唑啉和氧氟沙星耐藥的菌株分別有7株、6株、5株、4株、4株，分別占所有菌株數(shù)的28%、24%、20%、16%和16%；對阿米卡星、呋喃唑酮、萬古霉素耐藥的菌株均只有1株，對阿米卡星和呋喃唑酮耐藥的菌株均為表2中榮昌豬源25號菌，對萬古霉素耐藥的菌株為榮昌雞源16號菌。

分離自北碚的11株雞源菌株對阿米卡星、呋喃唑酮和萬古霉素高度敏感；10株菌對頭孢唑啉、鏈霉素、慶大霉素、磺胺異噁唑高度敏感；9株菌對大觀霉素、氧氟沙星和復(fù)方新諾明高度敏感。分離自榮昌的11株菌株對氨芐西林和四環(huán)素不敏感；而阿米卡星、呋喃唑酮除對25號豬源菌株不敏感外，對其他菌株高度敏感；除雞源17號菌株對恩諾沙星和氧氟沙星耐藥外，對其他菌株對恩諾沙星和氧氟沙星高度敏感；除17號雞源菌株對諾氟沙星耐藥和15號菌株對諾氟沙星中度敏感外，對其他菌株均其高度敏感；除17號雞源菌株和15號豬源菌株對乳酸環(huán)丙沙星耐藥外，對其他菌株均對其高度敏感；除16號雞源菌株對萬古霉素耐藥外，對其他菌株均對其高度敏感。

從分離菌株的宿主來看，不同宿主來源菌株對大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物的耐藥情況無明顯差異，但豬源菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥率高于雞源菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥率；但對喹諾酮類藥物的耐藥率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雞源菌株對喹諾酮類藥物的耐藥率。

不同菌株的多重耐藥從3耐到17耐不等，分別為3-12耐、14耐和17耐。多重耐藥多集中在5耐、7耐、9耐-12耐。5耐和11耐均有4株菌，10耐和12耐有3株菌，7耐、9耐和14耐有2株菌，3耐、4耐、6耐、8耐和17耐均各有1株菌。10耐以上的菌株數(shù)占所有分離菌株數(shù)的52%。從多重耐藥的地域看，榮昌縣超過10耐以上的菌株數(shù)多于北碚區(qū)，分別為63.6%和41.7%，合川區(qū)分離菌株數(shù)較少，不作比較。

3　討論

金黃色葡萄球菌耐藥已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問題，因?yàn)槟退幘甑某霈F(xiàn)增加了動(dòng)物飼養(yǎng)成本，也成為醫(yī)院和社區(qū)感染中非常嚴(yán)重的問題。特別是發(fā)現(xiàn)豬源MRSA ST398菌株可感染人以來，動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義越來越引起人們重視，并將來源于家畜的MRSA命名為家畜源性MRSA（Livestock-associated Staphylococcus aureus，LA-MRSA）［5］。因此，金黃色葡萄球菌的耐藥性近年來成為微生物學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)和藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。包括我國在內(nèi)的世界各國均對該菌的耐藥有大量報(bào)道，國內(nèi)針對不同省市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌耐藥的研究也越來越多［6-7］，但近年還未見重慶市關(guān)于動(dòng)物源金黃色葡萄球菌耐藥的報(bào)道。本研究從重慶部分區(qū)縣的8個(gè)養(yǎng)殖場的動(dòng)物中分離到25株金黃色葡萄球菌，并對分離菌株對23種抗菌藥物的敏感性進(jìn)行了測定，試驗(yàn)結(jié)果提供了重慶市動(dòng)物源金黃色葡萄球菌耐藥的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表2　25株臨床分離株的抑菌圈直徑及藥物敏感性結(jié)果

本研究中金黃色葡萄球菌總體分離率為5.4%，比很多省市的分離率低。這與樣品來源、所用培養(yǎng)基有一定關(guān)系，特別是本研究中未使用選擇性顯色培養(yǎng)基可能也有一定關(guān)系；另外為了防止較多克隆菌株的出現(xiàn)，每個(gè)養(yǎng)殖場分離的菌株數(shù)均不超過8個(gè)，這也是分離率低的一個(gè)重要原因。

分離菌株對不同藥物的耐藥情況存在較大差異，特別是不同種類的藥物之間，如對β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類藥物耐藥率較高，這與養(yǎng)殖場經(jīng)常使用這些藥物有關(guān)，而氨基糖苷類藥物多為注射方式給藥，對于群體養(yǎng)殖來說操作不易，工作量較大，這類藥物在群體預(yù)防和治療中使用頻率相對較少，因此對這類藥物耐藥菌株較少。由于國家2002年以來已禁止在所有食品動(dòng)物養(yǎng)殖中使用呋喃唑酮，因此硝基呋喃類藥物近年來在重慶的養(yǎng)殖場中已不使用，這可能是大部分菌株對呋喃唑酮敏感的原因。分離菌對氯霉素的耐藥率達(dá)到50%，這可能是由于養(yǎng)殖場中經(jīng)常使用氟苯尼考，因?yàn)槁让顾嘏c氟苯尼考有相同的耐藥基因［8］。不同動(dòng)物源性菌株對藥物的敏感性存在差異，如雞源菌株對喹諾酮類藥物的耐藥率高于豬源菌株，這可能是由于喹諾酮類藥物作為養(yǎng)雞場預(yù)防細(xì)菌感染的常用藥物。

本研究為這些養(yǎng)殖場抗菌藥物的使用提供了參考，有利于提高藥物使用的針對性，并通過藥物的交替使用降低耐藥菌株的比例；在后續(xù)的研究中將繼續(xù)增大樣本采集量和采集范圍，使樣品更有代表性，并為研究重慶市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的耐藥基因、耐藥規(guī)律、耐藥傳播規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

表3　分離菌株對抗生素的耐藥情況

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Isolation，identification and drug sensitivity analysis of Staphylococcus aureusfrom animal farms in Chongqing

WANG Hao-ju1，2，YANG Da-ji2，GAO Sheng-nan2，MA Hui-jia2，ZHANG Jia-hua2，SHEN Jian-zhong1，DING Hong-lei2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

The purpose of the study is to acquire the information of the drug sensitivity of livestock-associated Staphylococcus aureus（S.aureus）in partial districts and counties of Chongqing.Four hundred and sixty-six fecal samples collected from Beibei，Hechuan and Rongchang were cultured on high-salt Mueller-Hinton plates by streak inoculation，and then the suspected colonies were cultured in LB media.The S.aureus specific gene nuc was amplified from the suspected colonies，and the antimicrobial susceptibility of the identified S.aureus was tested.Twenty-five S.aureus clinical strains were isolated and identified from 466 samples，including 17 pip-associated strains and 8 chicken-associated strains.All isolates were resistant to one or more tested antimicrobial agents.The isolates were severely resistant to ampicillin，penicillin G，tetracycline，deoxytetracycline and lincomycin，and the drug resistance rates to five antibiotics were more than 60%.However，only one isolate was resistant to amikacin，furaxone and vancomycin.All isolates were multi-drug resistant strains.These results indicated that the clinical strains were resistant to antimicrobial agents seriously.Meanwhile，the results gave advice for the clinical medication of the animal farms in Chongqing，and provided some useful data for the further study on the drug resistant genes，mechanism of drug resistance and drug resistance transmission profile of livestock-associated S.aureus in Chongqing.

Staphylococcus aureus；isolation and identification；PCR；drug sensitivity assay

s：SHEN Jian-zhong；DING Hong-lei

Q933

A

0529-6005（2016）09-0086-05

2015-07-10

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB12720）；西南大學(xué)博士基金（含引進(jìn)人才計(jì)劃）項(xiàng)目（SWU114018）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（XDJK2014B029）

王豪舉（1963-），男，副教授，博士生，主要從事微生物耐藥研究，E-mail：kyc_whj@swu.edu.cn

沈建忠，E-mail：sjz@cau.edu.cn；丁紅雷，E-mail：hongleiding@swu.edu.cn