趙新宇，陳楊陽，陳敬幫，蔡冬波，魏雪團(tuán),

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

高產(chǎn)納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養(yǎng)基優(yōu)化

趙新宇1,2，陳楊陽2，陳敬幫2，蔡冬波2，魏雪團(tuán)1,2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

以產(chǎn)納豆激酶的地衣芽孢桿菌基因工程菌BL10（pP43SNT-SsacC）為出發(fā)菌株，開展其全合成培養(yǎng)基的發(fā)酵優(yōu)化研究。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了全合成培養(yǎng)基成分，獲得了最優(yōu)的培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖30、NaNO330、谷氨酸鈉20、檸檬酸鈉15、MgSO4g7H2O 0.5、K2HPO4g3H2O 1.5、CaCl20.5，pH 7.2。在優(yōu)化的全合成培養(yǎng)基中，納豆激酶最高酶活力達(dá)到25.59 FU/mL，相比于初始培養(yǎng)基發(fā)酵活性（4.27 FU/mL），提高了5 倍。對比分析了全合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果表明，全合成培養(yǎng)基可顯著提高納豆激酶的純度，與半合成培養(yǎng)基相比，納豆激酶比活力提高了2 倍。本研究獲得了納豆激酶的全合成培養(yǎng)基成分，顯著提高了納豆激酶發(fā)酵活性，并進(jìn)一步提高了納豆激酶發(fā)酵純度。

納豆激酶；地衣芽孢桿菌工程菌；全合成培養(yǎng)基；發(fā)酵優(yōu)化

心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，已成為威脅人類生命的“頭號殺手”[1]。血栓是造成心血管疾病的主要原因，血栓的主要成分是纖維蛋白[2]，溶解纖維蛋白對預(yù)防和治療心血管疾病具有重要的意義。納豆激酶（nattokinase，NK）不僅可直接降解纖維蛋白，而且可激活體內(nèi)纖溶酶的形成，促進(jìn)纖維蛋白的降解[3-4]，因而對治療和預(yù)防心血管疾病具有重要的意義。NK溶栓性強(qiáng)，半衰期長，無毒副作用，已被開發(fā)為保健食品，深受心血管疾病患者的青睞[5]。

目前，NK多是通過野生納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)[6]。野生菌株合成納豆激酶的途徑復(fù)雜，是多種代謝途徑共同參與的結(jié)果[7]。其中，添加無機(jī)氮源可抑制NK的合成，因此，野生菌發(fā)酵過程中往往需要大量有機(jī)氮源成分[8-9]，如固體發(fā)酵多以天然黃豆為底物進(jìn)行發(fā)酵，液體發(fā)酵多是利用半合成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵[10-11]。由于天然培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基成分多樣，雜蛋白、多肽比較多，導(dǎo)致分離純化過程復(fù)雜[12-13]，制備高純度產(chǎn)品成本較高[14]。同時，野生菌分泌胞外雜蛋白種類繁多，增加了NK分離純化的難度[15]。因此，減少培養(yǎng)基天然雜蛋白和生產(chǎn)菌自身雜蛋白含量，有望提高NK的純度。

本實驗室前期構(gòu)建了10基因缺失的新型地衣芽孢桿菌宿主菌BL10，敲除了野生菌中大量的胞外蛋白酶和冗余蛋白，降低胞外蛋白酶對NK的降解作用，實現(xiàn)了NK的高效組成型表達(dá)[16]，但還未從全合成培養(yǎng)基角度進(jìn)行NK發(fā)酵優(yōu)化。因此，本研究以前期構(gòu)建的地衣芽孢桿菌工程菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行其全合成培養(yǎng)基優(yōu)化研究，有助于提高NK的純度，獲得高活性的NK產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 菌種

地衣芽孢桿菌工程菌株BL10（pP43SNT-SsacC），為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室微生物工程室構(gòu)建保存，可組成型表達(dá)NK。

1.2 試劑

纖維蛋白原、凝血酶 美國Sigma-Aldrich公司；酵母抽提物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；葡萄糖 西王藥業(yè)有限公司；谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NH4Cl、NaNO3、谷氨酸鈉、MnSO4等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂粉20，pH 7.2；LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，pH 7.2；初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖10、NH4Cl 10、檸檬酸鈉 5、谷氨酸鈉5、MnSO4gH2O 0.15、MgSO4g7H2O 1、K2HPO4g3H2O 1、CaCl21，pH 7.2。在本實驗中，根據(jù)研究目的，調(diào)整碳源、氮源、無機(jī)鹽及其他成分種類和用量。

半合成培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、大豆蛋白胨10、酵母粉15、玉米漿5、K2HPO4g3H2O 0.5、MgSO4g7H2O 0.1、CaCl2g2H2O 0.1，pH 7.2～7.4。

1.4 發(fā)酵方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

取BL10（pP43SNT-SsacC）甘油管保藏的菌液，劃線至LB（四環(huán)素質(zhì)量濃度20 μg/mL）固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，保存至4 ℃冰箱中，備用；挑取單菌落接種至液體LB（四環(huán)素質(zhì)量濃度20 μg/mL），37 ℃、240 r/min培養(yǎng)12 h活化菌體，按2%的接種量接種至液體LB（四環(huán)素質(zhì)量濃度20 μg/mL）中，37 ℃、240 r/min培養(yǎng)8 h，即為發(fā)酵種子液。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件

按照3%的接種量將種子液接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃、240 r/min培養(yǎng)36 h。

1.4.3 單因素試驗優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗考察碳氮源種類、碳氮源質(zhì)量濃度、谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度、金屬鹽離子濃度等因素對酶活力的影響：碳源種類包括葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、可溶性淀粉，質(zhì)量濃度均為10 g/L；選擇適宜碳源，質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、10、20、30、40、50 g/L；氮源種類包括NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2CO3、NaNO3，質(zhì)量濃度均為10 g/L；選擇適宜氮源，氮源質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、10、20、30、40、50 g/L；谷氨酸鈉質(zhì)量濃度梯度設(shè)為5、10、15、20 g/L；檸檬酸鈉質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、5、10、15、20 g/L；MnSO4質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L；MgSO4質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、0.5、1.0、1.5 g/L；CaCl2質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、0.5、1.0、1.5 g/L；K2HPO4質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、0.5、1.0、1.5 g/L。

1.4.4 正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計四因素三水平正交試驗，優(yōu)化碳氮源質(zhì)量濃度、谷氨酸鈉和檸檬酸鈉質(zhì)量濃度，確定最優(yōu)組合。

1.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

取0.9 mL發(fā)酵上清液，加入0.1 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，顛倒10 次混勻，4 ℃過夜放置，13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.2 mL無水乙醇洗滌，13 000 r/min離心10 min，棄上清，依此重復(fù)洗滌3 次，37 ℃吹干，加入30 μL包含8 mol/L尿素和2 mol/L硫脲溶液溶解蛋白質(zhì)樣品，再加入30 μL 2hSDS-PAGE上樣緩沖液和3 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），100 ℃水浴10 min溶解沉淀。SDS-PAGE凝膠參考《分子克隆實驗指南》進(jìn)行配制[17]。將溶解好的蛋白質(zhì)離心后取20 μL上樣，用80 V的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑從濃縮膠進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)到120 V，繼續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)指示劑抵達(dá)分離膠底部，斷開電源停止電泳。電泳結(jié)束后，于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中處理1～2 h，最后于脫色液中處理數(shù)次直至條帶清晰。

1.6 納豆激酶酶活力測定

本研究采用纖維蛋白原溶解法測定NK活性[18]。反應(yīng)中所需的纖維蛋白原溶液、凝血酶溶液都用50 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.8）溶液配制，向試管中加入1.8 mL纖維蛋白原溶液（2 mg/mL），然后加入0.1 mL凝血酶溶液，37 ℃恒溫箱中靜置10 min，形成纖維蛋白凝塊；加入0.1 mL稀釋后的待測酶液，放入恒溫箱開始計時，每20 min輕輕晃動一次，反應(yīng)1 h后，迅速加入2 mL TCA溶液（100 g/L）終止反應(yīng)，靜置20 min；10 000 r/min離心10 min，取上清液在275 nm波長處測定其吸光度值，1 個單位的酶活力（1 FU）定義為每分鐘使吸光度值增加0.01所需要的納豆激酶的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 全合成培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

圖1 碳源種類及最適碳源質(zhì)量濃度對NK酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source type and glucose concentration on nattokinase activity

如圖1A所示，當(dāng)菌體在初始培養(yǎng)基以蔗糖為碳源時，發(fā)酵活性達(dá)4.27 FU/mL，當(dāng)以葡萄糖、木糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源時，都能提高NK的發(fā)酵活性，其中，葡萄糖可促進(jìn)合成最高的NK發(fā)酵活性。因此，葡萄糖為地衣芽孢桿菌BL10（pP43SNT-SsacC）合成NK的最適碳源，這與先前在枯草芽孢桿菌中報道的結(jié)論相一致[19-20]。

以葡萄糖為碳源，研究了不同葡萄糖質(zhì)量濃度對NK活性的影響。不添加葡萄糖時，仍能檢測到微弱的NK活性，這是由于培養(yǎng)基中檸檬酸鈉和谷氨酸鈉可作為碳源供菌體利用。添加葡萄糖后，NK活性顯著提高，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度超過20 g/L時，NK發(fā)酵活性沒有顯著性變化，因此，選擇20 g/L為NK發(fā)酵的適宜碳源質(zhì)量濃度，與先前報道的結(jié)果接近[21]。

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

首先，考察了氮源種類對NK發(fā)酵活性的影響，在以NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和NaNO3為氮源時，可以獲得較高活性的NK（圖2A），說明無機(jī)氮源可作為基因工程菌表達(dá)NK的適宜氮源。在野生菌中，無機(jī)氮源如銨鹽可抑制NK的合成，先前的報道都是以有機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵[19]。本實驗所用基因工程菌可組成型表達(dá)NK，在調(diào)控機(jī)制上與野生菌不同，這可能是無機(jī)氮源促進(jìn)NK表達(dá)的原因。

選擇NaNO3作為適宜氮源，考察不同質(zhì)量濃度NaNO3對NK發(fā)酵活性的影響，結(jié)果如圖2B所示，由于谷氨酸鈉可以作為氮源被細(xì)菌利用，因此，不添加NaNO3時，細(xì)菌仍可合成NK，但活性較低，添加NaNO3后，活性顯著提高，當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度為20 g/L時，NK發(fā)酵活性達(dá)到最大。

圖2 氮源種類及最適氮源質(zhì)量濃度對NK酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type and NaNO3concentration on nattokinase activity

2.1.3 不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對納豆激酶發(fā)酵活性的影響

先前的報道發(fā)現(xiàn)谷氨酸鈉是NK重組表達(dá)的限制性因素，添加谷氨酸鈉可顯著提高NK的分泌表達(dá)[22]，因此，本研究考察了不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對NK發(fā)酵的影響。圖3顯示在不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度下NK的發(fā)酵活性，當(dāng)谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為10 g/L時，NK發(fā)酵活性達(dá)到最大值，因此，初步選擇10 g/L的谷氨酸鈉為適宜質(zhì)量濃度。

圖3 不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對NK酶活性的影響Fig.3 Effect of sodium glutamate concentration on nattokinase activity

2.1.4 不同檸檬酸鈉質(zhì)量濃度對納豆激酶酶活性的影響

圖4 不同檸檬酸鈉質(zhì)量濃度對NK酶活性的影響Fig.4 Effect of sodium citrate concentration on nattokinase activity

由圖4可知，不添加檸檬酸鈉時，發(fā)酵活力只有3.85 FU/mL，添加5 g/L的檸檬酸鈉，發(fā)酵活性顯著提高，說明檸檬酸鈉對NK發(fā)酵活性較大的促進(jìn)作用。推測其原因如下：檸檬酸是三羧酸循環(huán)的重要中間代謝物，可促進(jìn)谷氨酸的合成，進(jìn)而促進(jìn)NK的表達(dá)。當(dāng)檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為20 g/L時，發(fā)酵活性最高，因此選擇20 g/L的檸檬酸鈉為適宜發(fā)酵條件。野生菌在20 g/L的檸檬酸鈉質(zhì)量濃度時，NK活性很低[6]，這進(jìn)一步說明工程菌和野生菌在NK合成調(diào)控機(jī)制上的不同。

2.1.5 不同無機(jī)鹽質(zhì)量濃度對納豆激酶酶活性的影響

圖5 不同無機(jī)鹽質(zhì)量濃度對NK酶活性的影響Fig.5 Effect of inorganic salt concentration on nattokinase activity

由圖5可知，添加MnSO4可降低發(fā)酵活性，因此培養(yǎng)基中不需要添加MnSO4。添加MgSO4、CaCl2、K2HPO4可顯著提高NK發(fā)酵活性，適宜質(zhì)量濃度分別為MgSO40.5 g/L、CaCl20.5 g/L、K2HPO41.5 g/L。

2.1.6 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of medium components

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇4 種主要培養(yǎng)基成分葡萄糖、NaNO3、谷氨酸鈉和檸檬酸鈉，設(shè)計四因素三水平正交試驗及其結(jié)果如表1所示，極差R值大小順序為：A＞C＞B＞D，說明葡萄糖質(zhì)量濃度對NK活性影響最大，其次是谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、NaNO3質(zhì)量濃度和檸檬酸鈉質(zhì)量濃度。K值分析結(jié)果顯示，4 種成分的最優(yōu)組合為A3B3C3D3，即葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L，最適質(zhì)量濃度與上述單因素試驗所得結(jié)果不一致，分析其原因，可能是4 種成分之間存在交互作用，這也正是正交試驗相比單因素試驗的優(yōu)點，可以綜合考察單因素之間的交互作用，獲得最優(yōu)的水平組合。依據(jù)此組合進(jìn)行發(fā)酵驗證實驗，最終NK活力為25.78 FU/mL，高于正交試驗中所有的組合，說明該配比確實為最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基。綜合單因素試驗和正交試驗結(jié)果，確定NK的適宜發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2。

2.1.7 NK發(fā)酵過程曲線

以最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，進(jìn)行NK發(fā)酵過程曲線繪制，包括菌體生長及NK合成過程。如圖6所示，隨著菌體的生長，NK快速合成，NK的合成與生長相偶聯(lián)，這與前期的報道相符[23]。同時NK在發(fā)酵初期合成速率較快，這可能是由于NK游離表達(dá)質(zhì)粒在初期相對穩(wěn)定，隨著菌體的生長，出現(xiàn)部分質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致后期合成速率下降。發(fā)酵18 h時，NK活性達(dá)到最大，為25.59 FU/mL，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵活性（4.27 FU/mL）相比，提高了5 倍。目前，NK工業(yè)化生產(chǎn)多以固體發(fā)酵納豆的形式進(jìn)行，商業(yè)化納豆產(chǎn)品的NK酶活力在20～40 FU/mL[24-25]，本實驗所得的最大NK酶活性達(dá)到了商業(yè)化固體發(fā)酵工藝的水平，具有良好的應(yīng)用前景。

圖6 菌體生長曲線及NK活性曲線Fig.6 Time courses of cell growth and nattokinase activity

2.2 全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物分析

將最適培養(yǎng)基得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時以實驗室先前優(yōu)化的半合成培養(yǎng)基為對照[16]，結(jié)果如圖7所示，其中分子質(zhì)量約為27.7 kD的條帶為NK條帶，與已有報道的結(jié)果相一致[16]。由于半合成培養(yǎng)基以蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉和玉米漿為氮源，含有大量雜蛋白和多肽類物質(zhì)，故發(fā)酵產(chǎn)物中雜帶較多，相比之下，本研究所得的全合成培養(yǎng)基中無雜蛋白，發(fā)酵產(chǎn)物中雜蛋白較少，易于純化。以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品分析發(fā)酵液中總蛋白含量，計算兩種發(fā)酵液中NK的酶比活力，全合成培養(yǎng)基發(fā)酵液中總蛋白含量為100 mg/L，NK的酶比活力達(dá)到255.90 FU/mg pro，半合成培養(yǎng)基發(fā)酵液的總蛋白含量為400 mg/L，發(fā)酵酶活力和酶比活力分別為33.83 FU/mL和84.58 FU/mg pro，相比之下，全合成培養(yǎng)基比半合成培養(yǎng)基發(fā)酵制備的NK酶比活力提高了2 倍，說明全合成培養(yǎng)基有利于高純度NK的發(fā)酵制備。

圖7 不同培養(yǎng)基成分發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE of fermented products from different media

3 討 論

本研究獲得了納豆激酶發(fā)酵的最適全合成培養(yǎng)基成分：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2，最大NK活力達(dá)到25.59 FU/mL，相比于初始培養(yǎng)基的發(fā)酵活性（4.27 FU/mL）提高了5 倍。與半合成培養(yǎng)基相比，全合成培養(yǎng)基所發(fā)酵制備的納豆激酶中雜蛋白顯著降低，納豆激酶比活性提高了2 倍，有利于獲得高純度的納豆激酶產(chǎn)品。本研究提供了一種高效生產(chǎn)納豆激酶的全合成培養(yǎng)基配方，并有利于制備高純度的納豆激酶產(chǎn)品。

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Optimization of Synthetic Complete Medium for Enhanced Nattokinase Production by Genetically Engineered Bacillus licheniformis

The nattokinase-producing genetically engineered strain, Bacillus licheniformis BL10 (pP43SNT-SsacC) was used in this study, and the synthetic complete medium composition for nattokinase production by the strain was optimized using combination of single factor and orthogonal tests. The maximum nattokinase activity of 25.59 FU/mL, which was 6 times higher than that (4.27 FU/mL) before optimization, was obtained using a medium consisting of 30 g/L glucose, 30 g/L NaNO3, 20 g/L sodium glutamate, 15 g/L sodium citrate, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, 1.5 g/L K2HPO4·3H2O and 0.5 g/L CaCl2at pH 7.2. The specific activity of nattokinase in the synthetic complete medium was improved by 3 folds when compared with that in semi-synthetic medium. In the present study, both the activity and purity of nattokinase were improved obviously by using the optimized synthetic complete medium.

nattokinase; genetically engineered Bacillus licheniformis; synthetic complete medium; fermentation optimization

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

10.7506/spkx1002-6630-201607026

Q812

A

1002-6630（2016）07-0140-06

趙新宇, 陳楊陽, 陳敬幫, 等. 高產(chǎn)納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 140-145. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Xinyu, CHEN Yangyang, CHEN Jingbang, et al. Optimization of synthetic complete medium for enhanced nattokinase production by genetically engineered Bacillus licheniformis[J]. Food Science, 2016, 37(7): 140-145. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

2015-05-08

湖北省自然科學(xué)基金項目（2014CFB943）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金項目（2662015QC035）

趙新宇（1992—），女，本科生，研究方向為食品發(fā)酵。E-mail：414949799@qq.com

*通信作者：魏雪團(tuán)（1984—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn